Para la realización de los dos ensayos de toxicidad crónica se ha seguido el protocolo de la prueba de reproducción para D. magna (OECD 2012). Se utilizó fosfito de sodio dibásico pentahidratado de la marca ®Sigma-Aldrich para la preparación de una solución madre a una concentración final de 250 mg/L de fosfito de sodio.

Para llevar a cabo los ensayos crónicos uniespecíficos se prepararon tres concentraciones subletales: 5 mg/L (bajo, B), 10 mg/L (medio, M), 25 mg/L (alto, A) con base en la LC₅₀ publicada por varios autores ( Cuadro I ). Además de estas tres concentraciones de tóxico, también se expuso en el ensayo testigo (T), libre de concentración de fungicida.

En cada experimento se prepararon cuatro réplicas para cada concentración o tratamiento en las que se expuso a los organismos de forma individual en frascos de vidrio de 60 mL de capacidad, con 50 mL de medio (agua mineral suplementada con vitaminas según tipo de experiencia, ver más adelante), con las siguientes características: pH = 8.28, temperatura = 20 ºC, dureza = 219.96 mg/L CaCO₃ y conductividad eléctrica = 0.48 mS/cm). Se utilizaron 16 neonatos (< 24 h) procedentes de una línea monoclonal.

Se planificaron dos experiencias, en una de ellas los organismos eran mantenidos a unas condiciones de cultivo subóptimas (con concentración de algas menor a 1.5 x 10⁶ células por dafnia/día y sin añadir vitaminas al medio). Esta experiencia simuló una situación probablemente más parecida a la que tiene lugar en el medio natural donde la disponibilidad de recursos es variable (disponibilidad, calidad, competencia).

En la segunda experiencia se mantuvieron condiciones óptimas con alimentación ad libitum y disponibilidad mayor de vitaminas siguiendo el ejemplo de la experiencia de Díaz-Báez et al. (2004). Se añadió así a cada uno de los frascos, 5 μL de tiamina, 1 μL de vitamina B12, 0.5 μL de biotina y 1 μL de selenito de sodio (Elendt y Bias 1990), una vez por semana.

A partir del día 7 se fueron retirando los neonatos que iban emergiendo empleando pipetas Pasteur. Estos neonatos fueron aislados en función de su tratamiento de origen y mantenidos en condiciones óptimas, para así poder estudiar los efectos del producto tóxico en su supervivencia.

Finalizados 21 días de experiencia se realizó el recuento total de la reproducción en cada uno de los vasos experimentales, además se analizó el tamaño final de estos, para así poder evaluar la existencia o no de diferencias en crecimiento.

Para la estimación de la longitud, se midió el caparazón, desde la región anterior del rostro hasta el final de la espina apical. Los individuos fueron dispuestos en la lupa (Leica MZ12) que presenta una cámara Leica EC3 acoplada. Una vez tomada la imagen y almacenada en el ordenador se midieron todos los sujetos experimentales con el programa de análisis de imagen “Imagen J”.

Teniendo en cuenta los valores promedio de los parámetros físicos y químicos y sus respectivas desviaciones estándar, podemos observar que a lo largo de todo el periodo experimental dichos parámetros presentan una evolución similar, existiendo diferencias significativas a lo largo del tiempo (oxígeno: F = 33.13; p < 0.0001; temperatura: F = 19.79; p < 0.0001; conductividad: F = 27.33; p < 0.0001; pH: F = 33,131; p < 0,000; TSD: F = 27.84; p < 0,0001), pero no entre tratamientos, a excepción del pH en la semana 6, donde el C mostró valores más bajos que B y M (oxígeno: F_(2,9) = 0.797; p = 0.480; temperatura: F_(2,9) = 1.94; p = 0.199; conductividad: F_(2,9) = 1.23; p = 0.336; pH: F_(2,9) = 8; p = 0.010; TSD: F_(2,9) = 1.22; p = 0.339), ( Cuadro III a, b y c). Por tanto, las condiciones experimentales, aparte de la exposición al tóxico, son similares en todos los tratamientos, salvo en la semana 6 respecto al pH.

CUADRO III CUADRO III VALORES PROMEDIO DE LOS PARÁMETROS FÍSICOS Y QUÍMICOS CON SUS RESPECTIVAS DESVIACIONES ESTÁNDAR EN LOS TRES TRATAMIENTOS A LO LARGO DEL PERIODO EXPERIMENTAL: A) SEMANAS 0, 1 Y 2; B) SEMANAS 3, 4 Y 5; C) SEMANAS 6, 7 Y 8. CUADRO III

Testigo, sin tóxico (0 mg/L, T), concentración baja (5 mg/L, B), concentración media (10 mg/L, M). Tem. = temperatura, OD = oxígeno disuelto, Cond. = conductividad, TSD = total de sólidos disueltos

En lo referente a la temperatura de los microcosmos, podemos ver que a lo largo de todo el periodo experimental este parámetro muestra un incremento, a excepción de las semanas 5 y 7, lo que concuerda con las variaciones de la temperatura ambiental registradas en la estación meteorológica de Jaén de la red de estaciones agroclimáticas de la Junta de Andalucía (2016).

Tras evaluar e identificar los grupos taxonómicos de las muestras de zooplancton, estos fueron clasificados en los siguientes ocho niveles taxonómicos prácticos (TPL, por sus siglas en inglés): nauplios, Metacyclops minutus, Daphnia sp., Alona sp., ostrácodos, Lecane luna, Lecane sp. y Hexarthra sp.

En la figura 1 se puede observar la evolución semanal de la abundancia total de organismos zooplanctónicos en cada uno de los tratamientos a lo largo del experimento.

Fig. 1 Fig. 1 Evolución semanal de la abundancia total de organismos zooplanctónicos en cada uno de los tratamientos a lo largo del experimento. Testigo, sin tóxico (0 mg/L), concentración baja (5 mg/L, Bajo), concentración media (10 mg/L, Medio). Las barras de error indican la desviación estándar

Con la finalidad de determinar si existían diferencias significativas respecto a los valores de abundancia total de zooplancton entre los tres tratamientos (C, B y M) se llevó a cabo la prueba Kruskal-Wallis.

El análisis estadístico de los resultados reveló que no existen diferencias significativas entre tratamientos a lo largo del periodo experimental a excepción de la semana 1 (X² = 7.423; g.l. = 2; p = 0.024).

Inicialmente, las comunidades zooplanctónicas son poco diversas y están formadas casi en su totalidad por nauplios. Con el paso del tiempo empiezan a aparecer otros organismos zooplanctónicos, cuya abundancia también aumenta. De forma que, en las últimas semanas del experimento se observa un incremento de la riqueza de organismos zooplanctónicos que forman las comunidades de los microcosmos y una mayor similitud en la abundancia de cada uno de los TPL.

Sin embargo, cabe destacar que el grupo zooplanctónico más abundante durante todo el experimento han sido los nauplios. En el caso de B y M ambas comunidades presentan siete TPL, mientras que la de C posee ocho TPL, siendo así el único tratamiento en el cual se observa el rotífero Hexarthra sp.

El segundo TPL con el mayor rango de abundancia tanto en B como en M son los ostrácodos, a diferencia del C en donde lo es el cladócero Alona sp. seguido a continuación por los ostrácodos.

A partir de los datos biológicos recogidos la última semana del experimento, se construyeron las curvas de rango-abundancia de cada uno de los tratamientos ( Fig. 2 ).

Fig. 2 Fig. 2 Curvas de rango-abundancia de las comunidades que se han establecido en cada uno de los tratamientos al final del periodo experimental. Testigo, sin tóxico (0 mg/L); concentración baja 5 mg/L (Bajo); concentración media (10 mg/L Medio)

Teniendo en cuenta la pendiente de las curvas de rango-abundancia de los tres tratamientos (C, B y M) se puede deducir que son muy similares. Además, no hay diferencias significativas en el índice de diversidad de las comunidades al final del experimento ( Fig. 3 ; F_(2,9) = 0.042; p = 0.960).

Fig. 3 Fig. 3 Biodiversidad de las comunidades que se han establecido al final del experimento en los tres tratamientos. H’max = diversidad máxima si la distribución fuese equitativa en la comunidad. Testigo, sin tóxico (0 mg/L), concentración baja (5 mg/L, Bajo), concentración media (10 mg/L, Medio). Las barras de error indican la desviación estándar

Dado que en ningún caso la comunidad zooplanctónica presenta un valor del índice de Shannon-Wiener máximo (H´max), en ninguno de los tratamientos la comunidad presentó una distribución de abundancias equitativa.

El diagrama PRC ( Fig. 4 ) muestra la respuesta integrada de la estructura de la comunidad zooplanctónica debido a los tratamientos a lo largo del experimento. Se observa que tras la aplicación del fosfito de sodio dibásico pentahidratado hasta aproximadamente la segunda semana, la respuesta de las comunidades zooplanctónicas a los tratamientos B y M presenta unas pequeñas desviaciones respecto a C, siendo mayor la de B.

Fig. 4 Fig. 4 La respuesta general de la estructura de la comunidad zooplanctónica y los cambios de abundancia de los niveles taxonómicos prácticos (TPL, por sus siglas en inglés) debidos al tratamiento: Testigo, sin tóxico (0 mg/L), concentración baja (5 mg/L, B), concentración media (10 mg/L, M) a lo largo del experimento están representados en el diagrama PRC (curvas de respuesta principal, por sus siglas en inglés). El peso de dichos TPL en la respuesta general de la comunidad está representado en el gráfico 1-D plot

Desde la semana dos hasta la semana ocho dichas desviaciones adquieren mayor relevancia, y durante este periodo de tiempo la desviación de M es mayor que la de B, presentando ambos una tendencia similar.

El único TPL cuyo peso presenta valor positivo es Hexarthra sp., por lo que sería el único cuya abundancia disminuirá tras el tratamiento con el fosfonato. Sin embargo, hay que tener en cuenta que como su valor se encuentra dentro del rango + 0.5 y - 0.5 puede manifestar tanto una respuesta débil como una respuesta que no guarde relación con la mostrada en el diagrama.

El resto de taxones presentaron valores negativos, correspondiendo a Daphnia sp. el valor de peso negativo más alto seguido de Alona sp., que serán los TPL que presenten los mayores incrementos en abundancia debido al tratamiento.

De acuerdo con los resultados del método de permutación Monte Carlo (F = 14; p = 0.07) no existen diferencias significativas entre tratamientos en lo que se refiere a la abundancia y a la estructura de la comunidad, aunque cabe destacar que dichos resultados se encuentran en el límite de la significancia.

Por tanto, aunque el agroquímico parece ocasionar variaciones en la comunidad zooplanctónica respecto al testigo (C), estas no son significativas.

Los cambios en la concentración de clorofila estimada mediante las medidas de fluorescencia ( Fig. 5 ) muestran tendencias diversas entre los tratamientos y los testigos.

Fig. 5 Fig. 5 Variación semanal de los valores de fluorescencia en cada uno de los tratamientos durante el periodo experimental. Testigo, sin tóxico (0 mg/L); concentración baja (5 mg/L, Bajo); concentración media (10 mg/L, Medio). Las barras de error indican la desviación estándar

El análisis estadístico de los resultados puso de manifiesto la existencia de diferencias significativas en relación al tiempo (F₍₈₎ = 7.205; p < 0.001), pero no en relación al tratamiento (F_(8,16) = 1.512; p = 0.119).

En las pruebas de los efectos intersujetos se ratifica la no existencia de diferencias significativas de los valores de fluorescencia debido a los tratamientos (F = 0.841; p = 0.463).

Con respecto al perifiton, la figura 6 presenta las medias del crecimiento en función del tratamiento. El análisis estadístico de los resultados puso de manifiesto la existencia de diferencias significativas respecto al crecimiento del perifiton entre tratamientos (F = 5.068; p = 0.012). El análisis mediante la prueba post hoc de Tukey muestra que el testigo (T) no presenta diferencias significativas respecto a B (p = 0.654) y M (p = 0.085), pero sí existen diferencias significativas entre B y M (p = 0.011).

Fig. 6 Fig. 6 Valor de biomasa medio (mg) del perifiton en cada tratamiento al final del periodo experimental. Testigo, sin tóxico (0 mg/L); concentración baja (5 mg/L, Bajo); concentración media (10 mg/L, Medio). Las barras de error indican la desviación estándar, letras diferentes indican diferencias significativas entre grupos