INTRODUCCIÓN
El cromo presenta cinco estados de valencia, de los cuales los más importantes y
estables en medios naturales son el cromo (III) y (VI), que se encuentran presentes
en acuíferos naturales y aguas residuales (Cheung y
Ji 2007, Dhal et al. 2013, Evelyne y Ravisanka 2014, Tommasi y Lombardelli 2017). El Cr(VI) es considerado un agente
mutagénico, carcinogénico y teratogénico, el cual se presenta como cromato o
dicromato, dependiendo del pH en donde se encuentre (Dhal et al. 2013, Suh et al.
2019). Debido a su naturaleza química, no puede degradarse, sólo
transformarse a una forma menos tóxica como es el Cr(III), el cual es esencial para
el metabolismo humano en bajas concentraciones, ya que participa en el metabolismo
de la glucosa, el colesterol y los ácidos grasos, donde desempeña un papel
importante en diferentes reacciones enzimáticas (Arderiu 1998, Watson y Logan
2011, Dhal et al. 2013, Suh et al. 2019). El Cr(III) considerado 100
veces menos tóxico y 1000 veces menos mutagénico que el Cr(VI) (Dhal et al. 2013, Kanmani et al. 2012, Guan et
al. 2019, Suh et al. 2019) se
encuentra en la naturaleza formando hidróxidos, óxidos o sulfatos, los cuales son
solubles en agua.
Para el tratamiento de la contaminación por Cr(VI) existen diferentes estrategias
como el uso resinas de intercambio iónico, los procesos de filtración y los métodos
de reducción química. Sin embargo, estas estrategias no son limpias, usualmente
tienen altos costos y generan productos secundarios, que a su vez originan otros
problemas de contaminación. Por lo tanto, se plantea el uso de alternativas que sean
amigables con el ambiente, como es el caso de la biorremediación (Rehman et al. 2008, Cárdenas et al. 2011). Método que se basa en el aprovechamiento
de las características de diferentes organismos como plantas, levaduras, hongos y
bacterias, entre otros (Alcalá 2007, Gaun et al. 2019), los cuales poseen diferentes
mecanismos para retener, degradar o transformar sustancias tóxicas, siendo una de
ellas el Cr(VI) (Rehman et al. 2008, Benítez-Campo 2011, Thatoi et al. 2014).
Adicionalmente, la biorremediación puede combinarse con la tecnología de las celdas
de combustible microbianas (CCM) en la cual se emplean aguas residuales domésticas o
industriales como sustrato directo para producir espontáneamente energía, a la vez
que se disminuye la concentración de diferentes contaminantes (Min y Logan 2004, Thygesen et
al. 2011, Wang et al. 2008, Zhang et al. 2016, Liu et al. 2019).
En las CCM la energía química contenida en la materia orgánica se transforma por los
microorganismos en energía eléctrica en el ánodo. El circuito se cierra con un medio
electrolítico, un circuito externo (Bond et al.
2002) y un cátodo recubierto generalmente con platino (Li et al. 2009, Revelo et al. 2018). Un aspecto importante de las CCM es el tipo de
sustrato que se emplea, ya que a partir de este se produce la energía. En la
literatura se reportan desde compuestos puros hasta mezclas complejas, como es el
caso de sedimentos de aguas marinas (Reimers
2001, Logan et al. 2006), agua
contaminada con Cr(VI), aguas residuales domésticas (Sophia y Sai 2016a, 2016b),
celulosa, acetato, glucosa y lactosa entre otras sustancias (Pant et al. 2010, Zhang et al.
2016, Kim et al. 2017, Loloei et al. 2017, Tommasi y Lombardelli 2017).
Además, los microorganismos que se emplean se caracterizan por ser anaerobios
facultativos o anaerobios estrictos, no fermentativos y electroquímicamente activos
(exoelectrogénicos), entre los cuales se han reportado bacterias como
Shewanella oneidensis, Geobacter sulforreducens, Geobacter
metallireducens, Rhodoferax ferrireducens, Klebsiella pneumoniae, Clostridium
butyricum, y Exiguobacterim acetylicum (Debabov 2008, Wang et al. 2008, Xing et al.
2008, Vejarano et al. 2018).
En estudios previos realizados por Mora y Bravo
(2017), se aisló la cepa CrLIM26 del electrodo de una CCM ubicada en el
lago de la estación experimental del Departamento de Biología de la Universidad del
Valle. Esta cepa presentó actividad electroquímica y, considerando dicho
antecedente, el objetivo de este trabajo fue determinar la actividad electrogénica
acoplada a la biorremediación de cromo hexavalente con la cepa bacteriana CrLIM26.
Para esto se realizaron ensayos de tolerancia al Cr(VI) por concentración mínima
inhibitoria (CMI) y ensayos de reducción del Cr(VI). Asimismo, se hizo la
identificación filogenética de la cepa bacteriana y se evaluó su capacidad para
producir energía durante la remoción del Cr(VI) en CCM.
MATERIALES Y MÉTODOS
Este trabajo fue realizado en el Laboratorio de Investigaciones Microbiológicas (LIM)
del Departamento de Biología de la Universidad del Valle, Santiago de Cali,
Colombia, 3º22´30´´N 76º32´04´´O.
Ensayo de tolerancia al Cr(VI)
Para determinar la tolerancia de la cepa CrLIM26 al Cr(VI), se utilizó el método
de concentración mínima inhibitoria (CMI) en el medio de cultivo LB, inoculado
con 10 % V/V de un cultivo fresco de la cepa CrLIM26 y suplementado con Cr(VI) a
concentraciones de 5, 10, 20, 40, 80, 160, 320, 640, 1280 y 2560 mg/L, ajustado
a un volumen final de 2 mL. Se usó un testigo positivo sin Cr(VI) y un testigo
negativo sin inóculo, con el fin de garantizar la inocuidad de los tratamientos
y verificar si existía reducción química espontánea. Todas las pruebas se
realizaron por triplicado. La CMI fue interpretada como la concentración de
Cr(VI) a la cual se inhibió el crecimiento visible de la cepa después de 24 h de
incubación por comparación con el crecimiento del testigo positivo y las
diferentes soluciones evaluadas (Rangdale et al.
1997, Andrews 2001). El
crecimiento se midió por espectrofotometría a una longitud de onda de 550
nm.
Estimación del potencial de reducción del Cr(VI)
En pruebas preliminares se determinó que la cepa CrLIM26 presentó condiciones
óptimas de crecimiento a 35 ºC y pH 7.0 (p = 0.00321 ensayos no mostrados en el
presente trabajo), motivo por el cual los bioensayos de reducción de cromo se
realizaron a esas condiciones de incubación. Todos los bioensayos de remoción de
Cr(VI) se realizaron por triplicado, en matraces Erlenmeyer a los cuales se les
agregaron 45 mL de caldo LB, 100 µL de una solución patrón de Cr(VI), para
garantizar una concentración final de 10 mg/L de Cr(VI) y 5 mL del inoculo
bacteriano de 14-16 h de incubación. Se dispuso un testigo positivo de
crecimiento sin cromo y un testigo negativo con cromo, pero sin inoculo
bacteriano. Las variables de respuesta fueron la concentración de Cr(VI) y el
crecimiento bacteriano; la concentración de cromo se estimó por el método de la
1.5 difenilcarbazida usando un espectrofotómetro Hach DR/890 (Ramírez y Benítez 2013) y el crecimiento
bacteriano se midió por densidad óptica a 550 nm. Dichas mediciones se
realizaron cada 2 h, hasta que la concentración de cromo fue imperceptible.
Efecto del Cr(VI) en la morfología de la cepa CrLIM26
El efecto del Cr(VI) sobre la morfología bacteriana se observó por microscopía
electrónica de barrido. Para esto se realizaron dos cultivos de la cepa CrLIM26
en caldo LB con y sin Cr(VI), a los cuales se les agregó una barra de grafito
como soporte de fijación para las bacterias, dejándose en incubación a
temperatura ambiente durante 15 días. Para el proceso de fijación se tomaron las
barras de grafito y se sumergieron en solución de glutaraldehído a 2.5 % en
amortiguador de fosfato de sodio 0.1 M a pH 7.2 por 42 h a 4 ºC. Después de
retirar el glutaraldehído se les agregó solución fría de etanol a 10 %, 30 %, 40
%, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % y 100 %, cada solución se incubó a 4 ºC durante
10 min. Las muestras se retiraron del etanol e inmediatamente fueron secadas
agregando gotas de hexametildisiloxano (HMDS). Las muestras se adhirieron a un
soporte metálico y se mantuvieron en desecador con sílica gel hasta su
recubrimiento con oro en el equipo Sputter Coater - Denton Vacuum Desk IV para
la observación en microscopio electrónico de barrido (Joel JSM 6490LV).
Identificación de la cepa CrLIM26
Para la identificación de la cepa CrLIM26, se realizó la extracción del ADN
genómico utilizando el paquete de extracción Ultraclean Microbial DNA isolation
de Mobio, siguiendo las indicaciones del fabricante. A partir del ADN obtenido
se amplificó por PCR el gen 16S rRNA utilizando los cebadores universales 27F
(5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3’) y 1492R (5’TACGGYTACCTTGTTACGACTTT’3). La mezcla de
la PCR se preparó con base en las siguientes concentraciones finales: solución
amortiguadora (1X) MgCl2 (1.75 µM) DNTPs (20 µM cada uno) cebadores
(4 µM cada uno) polimerasa Taq (1 unidad). El programa utilizado para la
amplificación consistió en un ciclo de desnaturalización a 94 ºC durante 5 min,
una fase de amplificación de 35 ciclos con una desnaturalización a 94 ºC durante
1 min, hibridación a 54 ºC durante 45 s y extensión a 72 ºC durante 40 s;
seguido de una extensión final a 72 ºC durante 10 min. Se determinaron las
secuencias mediante procedimientos estándares del servicio suministrado por la
compañía Macrogen (EUA), amparados por la Resolución 1070 (MADS, ANLA 2015).
Las secuencias obtenidas fueron comparadas directamente con la base de datos del
Genbank y del Ribosomal Database Project, para clasificar y asignar los taxones
jerárquicos. Se colectaron secuencias de las especies registradas para el género
Exiguobacterium y fueron alineadas con el programa Bioedit
Sequence Alignment para la construcción de los árboles filogenéticos mediante el
método de máxima verosimilitud utilizando el programa PAUP versión 4.0b10 con el
algoritmo de TBR (Tree-Bisection-Reconnection). El modelo de sustitución
nucleotídica fue seleccionado por el criterio de Akaike en Modeltest versión
2.1; el soporte estadístico fue evaluado con el método “bootstrap” de máxima
parsimonia con 10 000 repeticiones (MP), máxima verosimilitud 1000 repeticiones
(ML) y análisis de inferencia bayesiana con 1 000 000 de remuestreos, tomando
muestras cada 100 generaciones. Se generó un árbol consenso con el 50 % de los
árboles más representativos. Esta identificación se complementó con la
realización de pruebas bioquímicas, resultados no mostrados en este trabajo.
Monitoreo de actividad electroquímica en presencia y ausencia de
Cr(VI)
Se construyeron cuatro celdas de combustible microbianas (CCM) de una sola cámara
(simples), fabricadas en vidrio con un volumen de 100 mL. En cada una de ellas
se colocaron dos colectores de corriente anódica y catódica, compuestos por
grafito con dimensiones de 8 mm de diámetro y 5 cm de longitud, con área
superficial de 13.57 cm2. Con la ayuda de un taladro se realizaron
orificios para introducir un alambre de cobre, que se conectó al circuito. El
colector catódico fue recubierto con Pt/C hasta depositar 0.416
mg/cm2 de platino a partir de una mezcla de Pt/C 20 % de peso de
Pt / (peso de Pt + peso del soporte de carbono), 50 μL de Nafion en solución al
5 % en alcoholes de bajo peso molecular y 50 μL de isopropanol. La mezcla fue
homogeneizada en un ultrasonido por 1 h, y luego se aplicaron tres capas de la
solución a la barra de grafito, dejando secar cada capa a temperatura ambiente,
con el fin de obtener una capa homogénea.
Se usaron tres celdas iguales, con un volumen de 67.5 mL de medio LB, más 7.5 mL
de inóculo de la cepa CrLIM26; el ánodo se ubicó en la parte inferior para
mantenerlo en condiciones anaerobias y el cátodo en la parte superior en
contacto con el aire, la separación entre los electrodos fue de 2 cm. La cuarta
celda con un volumen de trabajo de 75 mL de caldo LB, se empleó como testigo.
Se obtuvo una curva de polarización de acuerdo con Xing et al. (2008), al medir el voltaje (V) y la corriente
(I) usando resistencias externas (Rex = 1Ω a 3900kΩ), conectadas a un
circuito eléctrico con dos multímetros. Para la toma de datos se usó una fase de
estabilización de 15 min, después con cada resistencia se realizaron tres ciclos
de 5 min y se tomaron los datos de voltaje (V) y la corriente (I) generados en
el último ciclo. La potencia (P) se calculó a partir de P = IV, la densidad de
potencia (DP) fue igual a P/Acat, donde Acat es el área
del cátodo usado, y la densidad de corriente (DI) fue igual a I/
Acat, los datos fueron normalizados tomando como referencia el área
del cátodo (Martinez-Santacruz et al.
2016). La curva de densidad de corriente se construyó usando los
valores de DI máxima generada diariamente. Adicionalmente, para evaluar la
cantidad de energía que se produce al reducir Cr(VI), se agregaron 150 µL de la
solución patrón de Cr(VI), para obtener una concentración final de 10 mg/L de
Cr(VI), a cada celda. Inmediatamente se inició el monitoreo de la concentración
de Cr(VI) con mediciones cada hora hasta su agotamiento. La adición del metal se
hizo los días 14 y 28 después de iniciado el experimento, el voltaje se midió
usando una resistencia de 1 kΩ.
DISCUSIÓN
La reducción del 60 % del Cr(VI) por el aislado bacteriano CrLIM26 se produjo durante
las primeras 6 horas de crecimiento, coincidiendo con la fase exponencial, mientras
que el 40 % restante se removió más lentamente durante la fase estacionaria. Este
fenómeno está asociado al crecimiento bacteriano, lo cual se evidencia en estudios
similares, en los que se demostró que durante la fase exponencial también existe un
aumento en la velocidad de reducción del Cr(VI) ligada a los procesos metabólicos
que generan un crecimiento en la población bacteriana (Ramírez y Benítez 2013, Guerrero et al. 2017). Es importante señalar que el testigo negativo no
presentó reducción de Cr(VI), evidenciando que ningún componente del medio utilizado
fue un agente reductor de Cr(VI).
El crecimiento celular de la cepa CrLIM26 disminuyó levemente en comparación con el
testigo positivo que no contenía Cr(VI), este resultado puede deberse a que, bajo
condiciones de estrés inducido por el Cr(VI), las bacterias activan mecanismos de
absorción o expulsión de iones o cascadas redox asociadas a rutas metabólicas. Esto
genera una inversión energética en procesos de transporte activo para controlar la
entrada de este metal altamente toxico, generando una disminución en el proceso de
división celular y provocando que sea más lento el crecimiento celular (Morais et al. 2011, Thatoi et al. 2014, Viti et al.
2014, Guerrero et al. 2017).
La cepa CrLIM26 sufrió cambios morfológicos en presencia de Cr(VI) formando agregados
y su morfología celular se tornó más larga y ancha, en comparación con la morfología
en ausencia de Cr(VI), (Fig. 2). Los cambios
morfológicos en presencia de Cr(VI) como son la deformación y el aumento de tamaño
celular en bacterias se atribuye a la acumulación de este metal en el interior
celular, según Sarangi y Krishnan (2008),
Recillas et al. (2010), Morais et al. (2011), Singh et al. (2015) y Echeverry
(2016).
La acumulación del Cr(VI) en el interior celular ha sido asociada a la presencia de
grupos funcionales amino, carboxilos, carbonilo e hidroxilos en la superficie de la
membrana celular, que facilita el ingreso de este metal al interior celular (Oves et al. 2013, Guerrero et al. 2017). Adicionalmente, la formación de
agregados o biopelículas, proporciona una cooperación fisiológica en la células y
protección contra diferentes condiciones ambientales hostiles o de estrés ambiental,
brindando mayor resistencia y tolerancia a agentes peligrosos como el Cr(VI) (Loera et al. 2012, Olarte y Cristiano 2012, Mendoza et al. 2015).
La cepa CrLIM26 presentó una CMI de 160 mg Cr(VI)/L, resultado asociado a la
acumulación en el interior celular y a los diferentes mecanismos de resistencia que
se han reportado para microorganismos similares, los cuales son variados y pueden
ser conferidos por genes localizados en los cromosomas o en plásmidos (Morais et al. 2011). Por lo general, estos
mecanismos son codificados por genes que permiten la expulsión del cromato a través
de la membrana. Otros sistemas de resistencia están relacionados con estrategias
como la reducción del Cr(VI) de forma enzimática específica o no específica, o por
actividad de enzimas de destoxificación de especies reactivas de oxígeno (ROS).
Finalmente, estos procesos pueden estar asociados con la homeostasis de azufre,
hierro, sulfatos y/o por reparación de daños del ADN (Morais et al. 2011, Thatoi et al. 2014, Viti et al. 2014).
La cepa CrLIM26 se identificó como Exiguobacterium acetylicum,
resultado que se confirmó con las pruebas bioquímicas realizadas. Otros autores como
Okeke (2008), Sarangi y Krishnan (2008) y Zumbair y Malik (2008), han reportado la capacidad de esta especie para
reducir Cr(VI) a concentraciones mayores o menores a la presentada en este estudio.
Sin embargo, no se ha informado el modo de reducción del Cr(VI) en este género.
En cuanto a la evaluación electroquímica de la cepa E. acetylicum
CrLIM26, esta generó una densidad de potencia máxima de 89.74 µW/m2 a una
densidad de corriente de 4.75 mA/m2. Esta especie, en estudios
preliminares mostró una densidad de potencia de 6.9 mW/m2 (Mora y Bravo 2017). Estos resultados contrastan
con la potencia generada al usar distintos microorganismos como
Desulfovibrio desulfuricans (Pant et al. 2010), Geobacter sulfurreducens (Nevin et
al. 200), Rhodopseudomonas palustris (Xing et al, 2008) y Geobacter sulfurreducens
(Bond y Lovley 2003), los cuales generaron
potencias máximas de 1150 mA/m2, 2.15 kW/m3, 1170
mW/m2 y 1150 mA/m2, respectivamente. Esto demuestra la
relación entre la bacteria usada, la corriente y el voltaje generado, causado por la
diferencia en la actividad metabólica, el mecanismo de transferencia de electrones
al colector de corriente por parte de cada bacteria y los factores asociados al
sistema como el diseño, la resistencia usada en el circuito, el suministro de
oxígeno y el tiempo de funcionamiento de las celdas (Min y Logan 2004, He et al. 2005,
Debabov 2008, Watson y Logan 2011, Chen et
al. 2014, Parkash 2016, Penteado et al. 2016)
La curva de polarización (Fig. 4a) mostró un
aumento paulatino del desempeño electroquímico, lo que indica un crecimiento en la
colonización de la superficie del ánodo (Mendoza et
al. 2015, Revelo et al. 2018),
incrementando el número de bacterias por área y generando un mayor flujo de
electrones que entran al circuito externo de las celdas (Vejarano et al. 2018, Revelo y
Hurtado 2013). Adicionalmente, en las curvas de voltaje vs DI se observó
que la pendiente fue poco pronunciada, lo que indica una mejora en la capacidad del
sistema al dejar pasar mayor cantidad de corriente (Vejarano et al. 2018). En otros trabajos se argumenta que esto se
relaciona con la maduración de la biopelícula donde la población bacteriana logra
establecerse, multiplicarse y adaptarse al medio (Bond y Derek 2003, Watson y Logan
2011).
La DI alcanzó su valor máximo en los primeros 15 días, tiempo en el cual se presume
el establecimiento de una biopelícula bacteriana sobre los ánodos de la CCM.
Posterior al establecimiento de la biopelícula, los microorganismos trasmiten
electrones de forma óptima desde la matriz celular hasta los electrodos del
dispositivo; proceso mediado por contacto directo o mediante nanocables y nanohilos
conductivos, que facilitan la transferencia de electrones (Min y Logan 2004, Debabov
2008, Fernández-Marchate et al.
2016, Parkash 2016, Bose et al. 2018, Li et al 2018).
Un factor que influyó durante todo el proceso fue la cantidad de nutrientes
disponibles en el medio durante el experimento. Se ha demostrado que a mayor
cantidad de materia orgánica, mayor es la cantidad de corriente generada, ya que a
partir del sustrato se produce la energía (Min y
Logan 2004, Cheng y Logan 2011,
Sophia y Sai 2016a, Bose et al. 2018, Vejarano et
al. 2018). Otro factor influyente es la actividad microbiana debida a la
naturaleza misma de las bacterias, que emplean mecanismos específicos de
transferencia de carga al colector anódico y tipo de sustrato (Bond et al. 2002, Li et al.
2009, Sophia y Sai 2016b).
Adicionalmente, Martínez-Santacruz et al.
(2016) consideran que las resistencias bajas favorecen el desarrollo de
biopelículas de microorganismos exoelectrogénicos.
Wartson y Logan (2011), encontraron que las
biopelículas necesitan un tiempo más largo de adaptación a las resistencias
aplicadas, recomendando el uso de resistencias fijas. Ellos reconocen que dichas
características pueden producir un incremento de la corriente y la potencia, al
igual que el suministro de oxígeno (He et al.
2005, Watson y Logan 2011, Martínez-Santacruz et al. 2016, Parkash 2016). Asimismo, se ha demostrado que
el uso de electrodos de grafito, empleados por su relación costo beneficio en lugar
de colectores metálicos, puede proporcionar una superficie de adherencia para las
bacterias (Logan et al. 2007, Loloei et al.
2017, Li et al 2018).
En cuanto a la producción de energía de la CCM en presencia de Cr(VI), se encontró un
efecto negativo al inicio del experimento en términos de la producción de potencia,
asociada al uso del Cr(VI) como aceptor de electrones en el cátodo. Otros reportes
hechos por Wang et al. (2008), Li et al. (2009), Huang et al. (2011), Wu et al.
(2015), Carmalin y Saikant (2016) y
Kim et al. (2017), sugieren que la
disminución en la producción de energía está asociada al poder electronegativo del
Cr(VI) que al agotarse deja de funcionar como un sumidero de electrones y el voltaje
vuelve a restablecerse, situación coherente con la evidencia experimental de la
presente investigación.
También, se plantea que el Cr(VI) no sólo está siendo reducido por la actividad
bacteriana, sino por actividad electroquímica, lo que genera una disminución en la
producción de potencia de la CCM y una aceleración del proceso de reducción de
Cr(VI) en el medio (Huang et al. 2011, Wei et al. 2011, Wu et al. 2015, Carmalin y
Saikant 2016, Loloei et al. 2017).
Considerando que el Cr(VI) es un agente oxidante, podría ser que la actividad
electroquímica encontrada y su efecto en la reducción del Cr(VI) resultara de una
combinación de factores, tales como: cantidad de biomasa, crecimiento celular en su
fase exponencial y mecanismos de adsorción y reducción del cromo, pues a mayor
cantidad de inóculo, hay más sitios de unión al metal (Cárdenas et al. 2011, Wu et al.
2015, Carmalin y Saikant 2016,
Loloei et al. 2017, Revelo et al. 2018), además de un aumento en la actividad
electroquímica por parte del microorganismo.
CONCLUSIONES
En este trabajo la cepa nativa E. acetylicum CrLIM26 mostró, a pesar
del efecto tóxico del metal, la capacidad de tolerar y disminuir la concentración de
Cr(VI) en caldo LB, evidenciado por un mayor volumen y longitud celular. Se demostró
la transferencia de electrones en presencia y ausencia de Cr(VI) en celdas de
combustible microbianas, mostrando su potencial para la biorremediación de ambientes
contaminados con este ión en futuros estudios con sistemas acoplados a la generación
de energías alternativas en CCM.
En futuros estudios podría evaluarse la eficiencia y factibilidad de la aplicación
del sistema de CCM empleando E. acetylicum cepa CrLIM26 como
inóculo masivo, para la remoción de Cr(VI) en residuos industriales o en ambientes
contaminados con este metal.