Microcystis fue recolectada en abril de 2017 en la Pista Olímpica (19º 16’ 20.58” N, 99º 6’ 16.72” O) de la Ciudad de México. Este cuerpo de agua mide aproximadamente 2200 m de largo, 125 m de ancho, tiene 2 m de profundidad y mantiene su volumen mediante aporte pluvial y vertido de aguas tratadas (Pineda-Mendoza et al. 2011).

Se recolectaron 5 l de agua superficial con botella van Dorn. De este volumen se almacenó 1 L del agua en un frasco de plástico, colocado y trasportado en una hielera (~ 8 ºC) hasta el laboratorio, previo al aislamiento de Microcystis. La muestra de agua se mantuvo fresca y en la oscuridad por un tiempo < 30 min antes de llegar al laboratorio. El material se agitó vigorosamente por 1 min para separar las colonias. Los cultivos clonales se realizaron usando el método de micropipetas y diluciones seriadas bajo el microscopio (Andersen y Kawachi 2005), donde una célula de Microcystis se aisló y multiplicó clonalmente en tubos estériles con medio basal Bold (0.5 mL). En este estudio se utilizaron dos cepas de Microcystis denominadas Mc17C2 y Mc17C3.

Dichas cepas crecieron en monocultivos in vitro en una cámara iluminada con irradianza de 19.6 µmol/m²/s, con un fotoperiodo de 12 h luz:12 h oscuridad, a temperatura ambiente (~ 24 ± 2 ºC). Los cultivos desarrollados de Microcystis se transfirieron y mantuvieron en crecimiento exponencial en un volumen de 250 mL antes de los experimentos de crecimiento y mortalidad. Cabe destacar que las cepas de Microcystis se distinguieron por su crecimiento unicelular en todos los monocultivos, aunque esporádicamente se observó formación de triadas.

Se utilizó la cepa Mc17C3 para evaluar el efecto de un gradiente de concentración de N_total (1.47-29.40 nM) y P_total (0.86-17.21 nM) sobre el crecimiento. El medio basal Bold (N_total = 2.94 mM y P_total = 1.72 mM [Andersen et al. 2005]) se utilizó como referencia estándar en las combinaciones de N y P empleadas para el crecimiento de Microcystis. En este sentido, la combinación de nutrientes asignada a los cultivos experimentales de Microcystis se denominó 1/2 ×, 1 ×, 2 ×, 6 × y 10 × (submúltiplos y múltiplos del valor de N y P agregado a los cultivos considerando el contenido del medio basal Bold).

Los experimentos de crecimiento (1/2 ×, 1 ×, 2 ×, 6 × y 10 ×) se realizaron por triplicado en matraces Erlenmeyer (1 L) con un volumen inicial de 700 mL. El crecimiento se evaluó durante 15 días en las condiciones físicas descritas. Los cultivos experimentales iniciaron con abundancias celulares de 10⁴ cel/mL. El crecimiento de Microcystis se cuantificó usando un microscopio compuesto (Zeiss Standard 25) y cámara de Neubauer (Guillard y Sieracki 2005) cada dos días. La tasa de crecimiento se calculó con base en la pendiente de una regresión lineal transformando a logaritmo natural los datos de abundancia de la fase del crecimiento exponencial (Wood et al. 2005).

La concentración de clorofila a en una alícuota de 25 mL se determinó por espectrofotometría siguiendo el método de extracción pasiva (Jeffrey y Humphrey 1975). Los pigmentos clorofílicos fueron extraídos en la oscuridad durante 24 h a 4 ºC, utilizando acetona al 90 %.

La potencial toxigenicidad de Microcystis (cepas Mc17C2 y Mc17C3) se investigó por medio de bioensayos de mortalidad del crustáceo Artemia sp. (Vanhaecke et al. 1981). Artemia sp. se cultivó eclosionando quistes comerciales según el método propuesto por Sorgeloos et al. (1986). Antes del cultivo se filtró (0.7 µm) y esterilizó agua de mar con una salinidad de 34 UPS. Los quistes eclosionaron en agua de mar diluida (salinidad 27 UPS) a temperatura de 25 ºC (± 2), con un fotoperiodo de 12 h luz:12 h oscuridad. En los bioensayos se usaron individuos juveniles de Artemia sp. con la boca y el sistema digestivo desarrollados. Antes de los bioensayos se confirmó la ingestión de células vivas de Microcystis a través de microscopía de epifluorescencia (Fig. 1 ). Todos los bioensayos se realizaron en la oscuridad para no alterar la abundancia celular de Microcystis, a temperatura de 23 a 26 ºC. Como control experimental negativo, Artemia sp. fue alimentada con microalgas no tóxicas de los géneros Scenedesmus y Pseudokirchneriella. El rango de abundancia y la cepa de Microcystis expuesta como alimento a Artemia se describen en el cuadro I. Los controles negativos y las pruebas experimentales de alimentación se realizaron por sextuplicado en todos los casos. Los bioensayos se realizaron en frascos de cristal (8 mL) con un volumen de 5 mL de agua marina diluida (salinidad 27 UPS), donde un organismo de Artemia se alimentó con la abundancia señalada en el cuadro I. El gradiente de abundancia empleado en los bioensayos se realizó por dilución (agua de mar y cultivo de Microcystis), donde se conservó una salinidad de 27 UPS en todos los casos. La mortalidad se cuantificó a las 24, 48 y 72 h en todos los bioensayos.

Fig. 1
(a) Vista del tracto digestivo de un juvenil de Artemia sp. observado en campo claro (100 ×). (b) Fluorescencia de la ficoeritrina (585 nm) en células de Microcystis sp. contenidas en el tracto digestivo de Artemia sp. (100 ×).

CUADRO I
ABUNDANCIA DE Microcystis UTILIZADA EN LOS BIOENSAYOS DE Artemia sp.

Para comparar la toxicidad de Microcystis con resultados de otros estudios, se calculó la equivalencia entre la abundancia celular (cel/mL) usada en este trabajo y la biomasa seca (mg/mL) usada por otros autores, considerando que una célula tuvo una equivalencia en peso de 1.21 × 10^-11 g (Hu 2014).

Los datos de abundancia, tasa de crecimiento y concentración de clorofila a se promediaron y graficaron con el programa SigmaPlot (v. 13, Systat Sofware, San Jose, CA, EUA). Además, se graficó el porcentaje de mortalidad de Artemia sp. (n = 4) de los controles y de los tratamientos con alimentación a las 24, 48 y 72 h. Las tasas de crecimiento determinadas en diferentes concentraciones de nutrimentos (1/2 ×,1 ×, 2 ×, 6 × y 10 ×) se analizaron estadísticamente mediante un análisis de varianza (ANOVA) de una vía (SigmaPlot 13). Previamente se realizaron las pruebas de normalidad (Shapiro-Wilk) y homocedasticidad que confirmaron las condiciones de parametricidad de los datos de crecimiento. El valor de significancia (p) de las pruebas estadísticas fue de 0.05.

Microcystis (cepas Mc17C2 y Mc17C3) fue cultivada y creció satisfactoriamente en condiciones controladas de laboratorio usando los concentrados 1 × a 10 × del medio basal Bold (Fig. 2). Microcystis no creció en el medio Bold diluido (1/2 ×) y su crecimiento celular y producción de clorofila a declinaron al iniciar el cultivo (Figs. 2 y 3). El aumento de la concentración de nutrientes disueltos (1 × a 10 ×) produjo un incremento en las tasas de crecimiento de Microcystis (Fig. 4), pero el ANOVA (n = 3) no mostró diferencias significativas en las tasas de crecimiento de los experimentos 1 × (0.49 ± 0.10 d^-1), 6 × (0.58 ± 0.12 d^-1) y 10 × (0.50 ± 0.05 d^-1) (p = 0.05, Fig. 4) Sin embargo, el crecimiento óptimo de Microcystis ocurrió en los cultivos 6 × (0.58 d^-1). En el medio Bold 2 ×, a pesar de la concentración de nutrientes, Microcystis redujo su tasa máxima de crecimiento (0.33 d^-1), pero no mostró diferencias estadísticamente significativas respecto a las tasas determinadas en los cultivos 1 × y 10 ×, con excepción del medio Bold 6 × (ANOVA, p = 0.05, Fig. 4). Independientemente de la concentración de nutrientes (medio Bold 1 × a 10 ×), la fase del crecimiento exponencial de Microcystis tuvo una duración < siete días para todos los tratamientos, y las abundancias máximas fluctuaron entre 8.83 × 10⁴ y 6.52 × 10⁵ cel/ml (Fig. 2).

Fig. 2
Crecimiento de Microcystis (cepa Mc17C3) determinado en diferentes concentraciones de nutrientes. Cada punto indica el promedio del crecimiento de Microcystis en el tiempo (n = 3). Las barras verticales indican la desviación estándar (n = 3).

Fig. 3
Concentración de clorofila a obtenida en cultivos monoclonales de Microcystis (cepa Mc17C3) en diferentes concentraciones de nutrientes. Los símbolos representan los promedios y las barras verticales indican la desviación estándar.

Fig. 4
Tasa de crecimiento (µ) de Microcystis (cepa Mc17C3) obtenida en diferentes concentrados del medio de cultivo Bold. Las barras verticales indican la desviación estándar (n = 3).

La producción de clorofila a durante el crecimiento de Microcystis no mostró diferencias significativas en los medios 1 × y 2 ×, donde el máximo registrado fue de 11.0 µg cl a/L y 15.8 µg cl a/L (Fig. 3), respectivamente.

Artemia sp. se alimentó de distintas cantidades de Microcystis (Mc17C2 y Mc17C3) en los bioensayos, confirmándose que a mayor abundancia de Microcystis aumenta la tasa de mortalidad de Artemia (Fig. 5). En general, Artemia sp. no fue sensible a la ingestión de Microcystis en las primeras 24 h, excepto en el bioensayo B1 con abundancia de 3 × 10⁵ cel/ml de la cepa Mc17C2 (Fig. 5). La tasa de mortalidad de juveniles de Artemia, producto de una intoxicación potencial, se agudizó a las 48 y 72 h (bioensayos B1 y B3), llegando a producir > 50 % de decesos cuando la abundancia fluctuó de 3 × 10⁵ a 3 × 10⁶ cel/ml (Fig. 5). Cabe destacar que en el bioensayo B2 se obtuvo la máxima tasa de mortalidad (100 %) de Artemia a las 72 h de haber sido alimentada con 1 × 10⁵ y 3 × 10⁶ cel/ml de la cepa Mc17C3. Sin embargo, en el bioensayo B3, a pesar de que se utilizó una mayor abundancia de Microcystis (≥ 5 veces) que en el bioensayo B2, únicamente se alcanzó un máximo de mortalidad de 66 % al término de 72 h (Fig. 5). La valoración del efecto máximo de mortalidad indica que la cepa Mc17C3 de Microcystis fue potencialmente más letal que la cepa Mc17C2 (Fig. 5). La exposición de Artemia sp. a abundancia ≤ 10⁴ cel/ml de Microcystis causó mortalidad inferior al 50 % en la mayoría de los bioensayos.

Fig. 5
Tasa de mortalidad de Artemia sp. por exposición e ingestión de Microcystis a diferentes concentraciones. (a-c) Bioensayo 1 (5, 50 y 300 × 10³ cel/mL, respectivamente). (d) Control. (e-g) Bioensayo 2 (21, 100 y 1000 × 10³ cel/mL, respectivamente). (h) Control. (i-k) Bioensayo 3 (50, 500 y 5000 × 10³ cel/ml, i-k, respectivamente). (l) Control. Cada punto indica el promedio porcentual de mortalidad en el tiempo (n = 4). En todos los controles Artemia se alimentó con fitoplancton no tóxico.

En este trabajo, la tasa óptima de crecimiento de Microcystis en condiciones de cultivo se asoció con concentraciones elevadas de N y de P (medio Bold 6 ×). Estos resultados coinciden con los realizados en distintas regiones, como en el caso de una cepa aislada de una laguna de Filipinas (Baldia et al. 2007). En ese mismo sentido, Vézie et al. (2002) demostraron que una proporción alta de N:P favorece el crecimiento de Microcystis, siempre y cuando la concentración de N supere un nivel mínimo (0.05 mg/L), tomando en cuenta la incapacidad de esta cianobacteria para fijar N atmosférico. Es importante destacar que los nutrientes influyen sobre la abundancia tanto de cepas tóxicas como no tóxicas; estas últimas los requieren en menor concentración para alcanzar la tasa máxima de crecimiento, en tanto que las cepas tóxicas los necesitan en mayores concentraciones (Davis et al. 2009, Burford et al. 2018). La ausencia de crecimiento de Microcystis en el experimento con menor concentración de nutrientes podría relacionarse con el aumento o mayor influencia en la síntesis de compuestos de reserva a expensas de la disminución en la división celular (Cordeiro et al. 2017).

Adicionalmente, la respuesta interespecífica de crecimiento de Microcystis en diferentes concentraciones de N y P, ha mostrado resultados muy variables (Parrish 2014); por lo anterior, diversos autores coinciden en la dificultad de definir los límites de N y P que promueven el desarrollo y la formación súbita de sus florecimientos. En consecuencia, es importante estudiar el crecimiento de diferentes cepas del género, ya que las respuestas génicas y fisiológicas de poblaciones de distintas localidades y ambientes pueden diferir significativamente (Vézie et al. 2002).

Las tasas máximas de crecimiento de Microcystis obtenidas en este estudio (0.58 y 0.50 d^-1, medios Bold 6 × y 10 ×) son superiores a las documentadas en otros reportes que usaron el mismo medio Bold. La tasa óptima de crecimiento, obtenida usando el medio Bold 6 ×, permite inferir que una probable eutrofización del ambiente favorecería el mantenimiento y crecimiento de la cianobacteria. En la condición opuesta, en cuanto a limitación de N y de P en cultivo, se ubican tasas de crecimiento menores (0.15-0.18 d^-1 [Imai et al. 2009, Che et al. 2017]), como ocurrió en este caso con el crecimiento en el medio con menor concentración de nutrientes. Por otra parte, también se ha señalado que Microcystis puede adaptarse y crecer eficientemente en condiciones reducidas de N, pero no en ausencia de P (Wu et al. 2015). Cabe agregar que la tasa de asimilación de diferentes concentraciones de P varía durante las etapas del crecimiento de Microcystis; puede aumentar en los primeros días de cultivo y luego disminuir (Ghaffar et al. 2017), como en los experimentos 1 × y 2 × aquí presentados. Algunos autores consideran que el P es el principal factor limitante en la formación y permanencia de los FAN de Microcystis en aguas epicontinentales (Harke et al. 2012).

Las toxinas producidas por cianobacterias afectan a organismos acuáticos a distintos niveles. En este trabajo, las cepas Mc17C2 y Mc17C3 provocaron inmovilidad, letargo y mortalidad de juveniles de Artemia, como ocurrió en estudios previos (Arzate-Cárdenas et al. 2010, Vasconcelos et al. 2010, entre otros). En ese sentido, las toxinas producidas por Microcystis podrían considerarse un mecanismo de defensa contra organismos fitoplanctívoros y, al mismo tiempo, afectarían las tasas de alimentación, reproducción y supervivencia de algunos depredadores (Holland y Kinnear 2013, Zanchett y Oliveira-Filho 2013).

La mortalidad de Artemia en los bioensayos estuvo relacionada directamente con el aumento de la abundancia celular de Microcystis, ya que se ha encontrado que al aumentar la abundancia de este microorganismo disminuye la supervivencia de los crustáceos Artemia y Daphnia magna (Arzate-Cárdenas et al. 2010). Cabe señalar que la biomasa seca de Microcystis se ha utilizado en varios bioensayos de toxicidad (Cuadro II), en los cuales la mortalidad de Artemia sp. ha sido similar a la de este estudio, hecho que revela la utilidad de su potencial nocivo como primer diagnóstico.

CUADRO II
ESTUDIOS DOCUMENTADOS SOBRE MORTALIDAD DE Artemia POR INGESTIÓN DE Microcystis.

MC-LR: microcistina LR, Nd: no disponible.

En el cuadro II se aprecia que hubo mortalidad significativa (˃ 50 %) de organismos de Artemia alimentados con cultivos de Microcystis mucho menos abundantes que los usados en otros estudios. Este resultado permite inferir la potencial toxigenicidad de las cepas Mc17C2 y Mc17C3, ya que existe relación entre el aumento de la mortalidad de Artemia y el incremento proporcional en la concentración de hepatotoxinas y neurotoxinas (Kiviranta et al. 1991, Campbell et al. 1994).

La diferencia en la mortalidad de Artemia producida por las cepas Mc17C2 y Mc17C3 (67-100 % vs. 50-67 %, respectivamente) podría atribuirse a una mayor concentración de compuestos nocivos. D’ors et al. (2013) señalan diferencias en la producción de compuestos nocivos entre distintas cepas que tienen efectos diferentes sobre los bioensayos. La mortalidad de Artemia estaría asociada al efecto de altas concentraciones de compuestos nocivos que inhiben la producción de enzimas digestivas en crustáceos, indispensables para desintegrar y digerir la biomasa fitoplanctónica de sus presas (Agrawal et al. 2005).

*Autor para correspondencia: aldoaqcz@yahoo.com