INTRODUCCIÓN

El cáncer en muchos casos puede resultar en la muerte del paciente debido a la resistencia o fallas de la quimioterapia. Por lo tanto, se requiere de nuevos enfoques terapéuticos más eficaces y con menos efectos tóxicos para quienes lo reciben. Los estudios in vitro desarrollados utilizando diferentes tipos de complejos de paladio han producido resultados prometedores (1,2), y contribuyen al desarrollo de nuevos medicamentos contra el cáncer. Desde hace más de 30 años se conoce que los complejos de paladio tienen actividad anti-fúngica, anti-viral, anti-neoplásica y anti-bacteriana (3), pero el estudio de sus propiedades contra el cáncer se ha convertido en un tema de creciente interés en los últimos 15 años. Se han realizado estudios en diferentes tipos de líneas celulares de tumores sólidos y neoplasias malignas hematológicas, con resultados muy prometedores en el campo de la oncología (4). Se ha informado que la actividad antitumoral in vitro frente a células de mamífero que ejercen los agentes quelantes derivados de las tiosemicarbazonas heterocíclicas (N,N,S), es debida a la inhibición de la biosíntesis del ADN, mediante el bloqueo de la enzima ribonucleótidoreductasa, esencial en la conversión de ribonucleótidos en desoxirribonucleótidos (4,6) o en la inhibición de la tiorredoxinareductasa involucrada en la biosíntesis de nucleótidos; otro de los mecanismos propuestos informados, es que estas tiosemicarbazonas heterocíclicas actúan como agentes que se intercalan en las bases pirimidinas y purinas del ADN, induciendo cambios en la conformación de la doble hélice, lo que conduce a la muerte celular y al bloqueo de la división de las células cancerosas (5, 7-10).

Los complejos de paladio(II) muestran mayor solubilidad que el cisplatino, ejemplo de ello, son los complejos de paladio(II) con ligandos oxima de ácido glioxílico, que muestran una mayor solubilidad que los complejos de platino(II) con el mismo ligando (11), lo que hace atractiva la síntesis de estos complejos en el futuro para su aplicación en las neoplasias. Las tiosemicarbazonas se han utilizado como ligandos quelatos debido a sus átomos donadores N y S para la síntesis de complejosde paladio(II), y se ha observado que estos complejos incrementan su actividad antitumoral (12). La preparación de los complejos con otros metales de transición con nuevos ligandos derivados de las tiosemicarbazonas, ha ocasionado una significativa atención debido a sus propiedades farmacológicas (13). Sin embargo, a pesar de que los complejos de paladio(II) con ligandos tiosemicarbazonas muestran una mayor actividad citotóxica in vitro, las dosis in vitro empleadas para lograr el efecto inhibitorio deseado en las células tumorales es muy variable y depende de la línea celular utilizada (14,15,16,17,18). Se ha evidenciado que los complejos de paladio(II) con ligandos tiosemicarbazonas, muestran mayor actividad citotóxica frente a las líneas celulares humanas: adenocarcinoma de mama (MCF-7) y adenocarcinoma de próstata (PC-3) (CI₅₀ = 0,08 μM), y frente a la línea celular humana de adenocarcinoma de cérvix uterino (HeLa), (CI₅₀> 1,0 μM) (15,17,19,20). Los complejos de paladio(II) con ligandos diferentes a las tiosemicarbazonas y con otros metales como el cobre o platino evidencian su efecto antiproliferativo con valor CI₅₀ de 0,31μM para la línea celular HCT-15, mientras que los valores CI₅₀ para las líneas celulares de cáncer de colon HT-29 y HCT-116 se encuentran en el rango de 0,2 μM -100 μM y 0,003 -10 μM, respectivamente. Estos resultados indican el gran potencial farmacológico que presentan estos complejos y que están relacionados con el tipo de tumor (1, 2, 21-24). Además, estos complejos metálicos muestran diferencias significativas en los rangos de las concentraciones inhibitorias, que pueden estar asociadas a las divergencias estructurales entre los complejos, a la sensibilidad de las líneas celulares (18) o a la solubilidad tanto de los ligandos tiosemicarbazonas como de los complejos de paladio(II).

En los últimos años, la industria farmacéutica ha invertido más dinero en el desarrollo de compuestos que sirven como medios de transporte para los fármacos anticancerígenos, para así alcanzar el mismo efecto a más bajas dosis y con una menor toxicidad. Las ciclodextrinas (α, β, γ) son macromoléculas físicamente estables, producidas por la degradación enzimática del almidón, que tienen una superficie externa hidrofílica y un núcleo hidrofóbico, y en el caso de la β-CD, es el compuesto ideal por su tamaño, bajo costo y mayor disponibilidad (25). De hecho, su uso como medio de transporte para las drogas antineoplásicas, ha mostrado baja toxicidad (26), y un incremento en la muerte celular inducida por compuestos con actividad antineoplásica (27,28).

Hoy en día, la quimioterapia sigue siendo la piedra angular en la oncología médica, por lo que la búsqueda de nuevos compuestos más eficaces y menos tóxicos es necesaria para mejorar la calidad de vida de los pacientes que padecen cáncer.

Con el fin de incrementar la solubilidad y la estabilidad de las drogas antineoplásicas, se han propuesto nuevas alternativas de solución, entre ellas, la combinación de los complejos de paladio(II) con compuestos β-ciclodextrina(29), para mejorar su actividad biológica con respecto a otras drogas de uso clínico (30).Tal es así, que en un trabajo previo, se prepararon los complejos de paladio(II), Pd(MePhPzTSC)₂ y Pd(Ph₂PzTSC)₂, los cuales fueron incluidos en la ß-ciclodextrina y ensayados en la línea celular de adenocarcinoma de mama (MCF-7), y se evidenció que cuando se incluyen los complejos de paladio(II) con ligandos tiosemicarbazonas en la β-ciclodextrina, aumenta significativamente la actividad antiproliferativa frente a la línea celular MCF-7 (20), es por ello que en este estudio se procedió a evaluar la actividad antiproliferativa in vitro de los complejos de paladio(II) con ligandos tiosemicarbazonas incluidos en β-ciclodextrina, frente a tres diferentes líneas celulares humanas, pertenecientes a diferentes tumores, tales como la de adenocarcinoma de próstata (PC-3), la de cérvix uterino (HeLa) y la de colon (HCT-15).

MATERIALES Y MÉTODOS

Ligandos y complejos de paladio(II)

Se utilizaron los siguientes ligandos: 3-metil-1-fenil-1-pirazol-4-carboxaldehido tiosemicarbazona (MePhPzTSC) o (HL₁) y 1,3-difenilpirazol-4-carboxaldehido tiosemicarbazona(Ph₂PzTSC) o (HL₂); así como los complejos de paladio(II)Pd(MePhPzTSC)₂ o Pd(L₁)₂ y Pd(Ph₂PzTSC)₂ o Pd(L₂)₂. Además, se utilizaron los complejos Pd/ligandos incluidos en la β-ciclodextrina (β-CD), Pd (MePhPzTSC)₂]•ß-CD y Pd (Ph₂PzTSC)₂•ß-CD (Fig. 1a y Fig 1b). Todos estos compuestos fueron sintetizados y caracterizados por el grupo de Investigación en Química de Coordinación y Bioinorgánica de la Universidad Nacional de Colombia. Para la preparación del compuesto Pd(MePhPzTSC)₂•ß-CD, se mezclaron 15 mg de Pd(MePhPzTSC)₂ y 27,35 mg de ß-CD (relación molar de 1:1) en agua, con agitación constante y a temperatura ambiente por 24 horas, mientras que para la preparación del compuesto Pd(Ph₂PzTSC)₂•ß-CD, se mezclaron 15 mg de [Pd(Ph₂PzTSC)₂] y 22,8 mg de ß-CD (relación molar de 1:1) en un mortero de ágata hasta obtener un polvo homogéneo (31,32).

Líneas de células tumorales empleadas y cultivo celular

Se emplearon tres líneas celulares: Las líneas celulares HCT-15(línea celular humana de adenocarcinoma de colon), PC-3 (línea celular humana de adenocarcinoma de próstata) y HeLa (línea celular humana de adenocarcinoma de cérvix uterino). Estos diferentes tipos de células tumorales fueron cultivados en medio RPMI-1640 con una solución 0,05% de antibiótico y suplementado con suero fetal bovino al 10%, hasta obtener una confluencia del 80%. Las células se disociaron con una solución de tripsina al 0,25% y luego se sembraron por triplicado en placas de cultivo de 96 pozos, a una densidad de 20,000 células/100μL por pozo. Luego de permitir la adhesión celular durante 24 horas, se adicionaron los compuestos en un rango de concentraciones de 0,1 a 10 μM.

Evaluación de la actividad antiproliferativa mediante el ensayo de la sulforodamina B

Después de 24 horas de exposición con los compuestos, se evaluó la viabilidad celular por el método de la sulforodamina B (SRB) (33). Las células se fijaron con 100μL de CCl3COOH al 10% y se tiñeron durante 30 minutos con 50μL de la solución de SRB al 0,4% en ácido acético al 1%. Se procedió a lavar las placas 5 veces con una solución de CH3COOH al 1% y posteriormente se extrajoel colorante celular, utilizando 100 μL de una solución Tris Base 10 mM (pH 10,5) durante 5 minutos con agitación suave. Finalmente, se determinó la densidad óptica de la solución a 556 nm, mediante un espectrofotómetro Organon Teknica Microwell System, Durham, NC, USA. El efecto antiproliferativo de los compuestos sobre las células HCT-15, PC-3 y HeLa, se expresó como valores del porcentaje de inhibición, usando la siguiente fórmula: %Inhibición= [1-(absorbancia media de células tratadas/absorbancia media del control)] x 100.

Cálculo de la concentración inhibitoria

La concentración inhibitoria, se define como la concentración micromolar requerida de los compuestos ensayados para inhibir al 50% el crecimiento de las células tumorales. La concentración inhibitoria (CI₅₀) se determinó a partir de las curvas de inhibición del porcentaje vs la concentración. Se seleccionó el modelo no lineal hiperbólico para el ajuste de los datos. El análisis de regresión no lineal que se implementó, permitió la obtención de los parámetros del modelo mediante el método de los mínimos cuadrados, usando como variable respuesta a la dosis inhibitoria y como variable de regresión a la concentración de los compuestos evaluados. La selección del modelo se basó en la gran utilidad del mismo para este tipo de ensayos y por tener el más bajo AIC (Criterio de información de Akaike). Adicionalmente, se aplicaron los estadísticos convencionales con el programa Prism 5, versión 5.03, a fin deobtener los valores de la desviación estándar y la aplicación de la t de Student.

RESULTADOS

Los valores CI₅₀ obtenidos para los compuestos estudiados se incluyen en la Tabla I. En las Figs. 2a y 2b se muestra que los valores de CI₅₀ disminuyeron significativamente cuando los ligandos se encontraban coordinados con el ion Pd(II), tal como se observó para los complejos [Pd(MePhPzTSC)₂] (CI₅₀= 0,45 - 1,13 μM) (p<0,04) y [Pd(Ph₂PzTSC)₂] (CI₅₀=0,86 - 1,31 μM) (p<0,05), mientras que cuando estos complejos se encontraban incluidos en la ß-CD, los valores de CI₅₀ se redujeron en el rango de 0,14 - 0,52 μM para los compuestos [Pd(MePhPzTSC)₂] •ß-CD (p<0,001) (Fig. 2a) y [Pd(Ph₂PzTSC)₂] •ß-CD(p<0,001) (Fig. 2b). A pesar de que en algunas condiciones se evidenciaron variaciones en la respuesta a algunos compuestos, esto no afectó la inhibición pronunciada de la respuesta proliferativa observada especialmente cuando se incorporó la ß-CD. Estos resultados indican que se requiere aproximadamente de 5 a 10 veces menos la concentración de los complejos de paladio(II) solos que cuando estos complejos se incluyen en la ß-CD (Tabla I).En el caso del compuesto [Pd(MePhPzTSC)₂] •ß-CD, el valor de CI₅₀ obtenido fue menor con respecto al complejo sin incluir: PC-3 (7 veces menor), HeLa (7 veces menor) y HCT-15 (6 veces menor). En el caso del compuesto [Pd(Ph₂PzTSC)₂] •ß-CD, el valor de CI₅₀ fue 6 veces menor para todas las líneas evaluadas. Finalmente, la inclusión de los complejos de paladio(II) con ligandos tiosemicarbazonas en la β-CD, incrementó su actividad antiproliferante.

Los valores de CI₅₀ obtenidos para el compuesto [Pd(MePhPzTSC)₂]•ß-CD mostraron una tendencia ascendente de 0,16 μM para la línea HeLa, mientras que para el compuesto [Pd(Ph₂PzTSC)₂] •ß-CD, se evidenció un valor de CI₅₀ ascendente a 0,34 μM para la línea HCT-15. Finalmente, a pesar de que la línea celular HeLa fue más susceptibles que otras con respecto a los complejos de paladio(II) incluidos en ß-CD, en todos los casos la inclusión de estos complejos en la ciclodextrina, originó una disminución de los valores CI₅₀ de 5 a 10 veces (Tabla I). La línea celular HeLa mostró mayor susceptibilidad al compuesto [Pd(MePhPzTSC)₂] •ß-CD, mientras que la línea HCT-15 mostró mayor susceptibilidad al compuesto [Pd(Ph₂PzTSC)₂] •ß-CD.

DISCUSIÓN

En este estudio, se investigó el efecto antiproliferativo de los ligandos (HL_1-2), los complejos bis-quelatos de paladio(II)[Pd(L₁)₂] y los complejos [Pd(L₂)₂] incluidos en ß-CD. Estudios previos han indicado que la línea celular de cáncer de mama (MCF-7), es susceptible a estos compuestos, así como lo es al cisplatino (20), debido a ello, en este estudio se utilizaron tres diferentes líneas de células tumorales celulares para evaluar el efecto antiproliferativo de los compuestos en mención .A pesar de que en algunos casos los valores de las DE fueron mayores a la media, producto posiblemente a la “n” limitada, los resultados evidenciaron que con la inclusión de los complejos [Pd(MePhPzTSC)₂] y [Pd(Ph₂PzTSC)₂] en la ß-CD, se obtienen menores concentraciones micromolares de inhibición (CI₅₀), incrementando así su actividad antiproliferativa, efecto que pudo observarse en las 3 líneas de células tumorales evaluadas en este trabajo. Los resultados obtenidos respecto a los valores de CI₅₀, se mantuvieron bajos, en comparación con los altos rangos de valores CI₅₀ informados para los complejos de paladio(II) evaluados en las líneas MCF-7 (CI₅₀= 25,09 - 48,0 μM), PC-3 (CI₅₀= 0,08 - 72,2 μM) y HeLa (CI₅₀= 1,0 - 22,2 μM) (1, 2, 7,9,14,18).

Tanto las tiosemicarbazonas como los complejos de paladio(II) fueron altamente tóxicos para las líneas celulares PC-3, HeLa y HCT-15, efecto que puede estar relacionado con la inhibición de la biosíntesis del ADN, mediante el bloqueo de la enzima ribonucleótido reductasa, esencial en la conversión de ribonucleótidos en desoxirribonucleótidos, inhibición de la tiorredoxina reductasa involucrada en la en la biosíntesis de nucleótidos o como un agente que se intercala entre las bases pirimidinas y purinas del ADN, induciendo cambios en la conformación de la doble hélice, lo que conduce a la muerte celular (5,7,9, 10), o al bloqueo de la división de las células cancerosas (8). Otros modos de acción descritos recientemente para los complejos de paladio(II), pueden estarrelacionados con la inhibición de la entrada al ciclo celular e inducción de la apoptosis de las células tumorales (24).

Por otro lado, los resultados obtenidos sugieren que los complejos de paladio(II) con sus ligandos tiosemicarbazonas y estos complejos de paladio(II) incluidos en la β-ciclodextrina, pueden ser considerados como posibles agentes quimioterápeúticos, debido a su potencial efecto antiproliferante sobre células neoplásicas representadas en las líneas celulares PC-3, HeLa y HCT-15. Además, estos compuestos ofrecen la posibilidad de reducir los efectos tóxicos observados con las diferentes quimioterapias disponibles en la actualidad, por cuanto para alcanzar valores aceptables de la CI₅₀, se logró reducir la concentración óptima de los complejos de paladio(II) incluidos en la β-CD, en comparación con los ligandos tiosemicarbazonas libres y sus respectivos complejos de paladio(II).

En general, en este estudio se evidenció que la actividad antiproliferativa in vitro de los complejos de paladio(II) incluidos en la β-ciclodextrina frente a las líneas tumorales ensayadas, se incrementa debido a los bajos valores de CI₅₀ obtenidos. La línea celular HeLa muestran mayor susceptibilidad al compuesto Pd(MePhPzTSC)₂ •ß-CD, mientras que la línea HCT-15 al compuestoPd(Ph₂PzTSC)₂•ß-CD (Tabla I). Basados en los informes de investigaciones previas y de otros investigadores, la implementación de la β-ciclodextrina como medio de transporte puede ser un factor muy importante en el campo de la oncología (25-30). Se deberían realizar estudios complementarios respecto al modo de acción de los complejos de paladio(II) y los complejos incluidos en laβ-ciclodextrina, con la finalidad de conocer que factores son los que inducen el incremento de la actividad antiproliferante frente a las líneas tumorales ensayadas y otras por investigar. Además, los resultados obtenidos servirán para proponer su uso como un potencial agente quimioterapéutico en los diversos tipos de tumores.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a todos los miembros del grupo de investigación en Química de Coordinación y Bioinorgánica, Universidad Nacional de Colombia por la síntesis y caracterización de los complejos de paladio(II), al Centro de Microscopía Electrónica “Dr. Ernesto Palacios Prü”, del Instituto de Inmunología Clínica, Facultad de Medicina, Universidad de Los Andes- Mérida, Venezuela y al Centro Integral de Hematología y Oncología Médica C.A. por su apoyo y colaboración en el desarrollo de la investigación.

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Notas de autor

Autor de Correspondencia: Nancy Jaimes: Departamento de Biología, Ciudadela Universitaria - Edificio Jorge Gaitán, Pamplona, Norte de Santander, Colombia. Teléfono: 5685303-5685304 ext 243 Correo electrónico: najame3@hotmail.com