INTRODUCCIÓN

La nanotecnología consiste en la manipulación de materiales con dimensiones que van de 1 a 100 nanómetros (nm) (1). A medida que las partículas son más pequeñas, su área de superficie se vuelve exponencialmente más grande y, por lo tanto, las NPs son más reactivas (2).

Debido a su afinidad al oxígeno y otros elementos, el titanio (Ti) no existe en su forma metálica en la naturaleza. El dióxido de titanio (TiO₂) es un compuesto mineral que se encuentra en tres diferentes estructuras cristalinas polimórficas: anatasa, rutilo y brookita. Se ha reportado que la anatasa (tamaño promedio=3-5 nm; dosis=100mg/ mL) es químicamente más reactiva y genera seis veces más especies reactivas de oxígeno ENT#091;por sus siglas en inglés, reactive oxygen species (ROS)ENT#093; que el rutilio después de su irradiación con luz UV, por lo que la fase anatasa podría poseer mayor potencial citotóxico (9). Sin embargo, las ROS generadas por dicha fase no se producen bajo condiciones de luz visible (3,4).

Debido a su coloración, las nanopartículas (NPs) de TiO₂ se han utilizado en pigmentos farmacéuticos, cosméticos, productos para el cuidado de la piel y para el cuidado personal tales como protectores solares y pastas dentales, esto debido también a su capacidad para atravesar barreras biológicas. Los protectores solares y pastas dentales contienen del 1% al 10% aunque existen productos con concentraciones por debajo de 0,01 mg/ mL (5). En el campo de la medicina, se ha reportado el uso de diversas NPs como acarreadoras para liberación de fármacos (6), para tratamiento del cáncer (7), detección (8), diagnóstico (9) y otros tratamientos terapéuticos (10). Específicamente, las NPs TiO₂ se han utilizado como un potencial agente fotosensibilizador en terapia fotodinámica (11) y como componente de las partes articulares de prótesis, especialmente para cadera y rodilla (12); sin embargo, dichas prótesis, en ocasiones fracasan debido a la degradación de los materiales o a la respuesta inflamatoria crónica en el tejido que las rodea (13).

Por otro lado, se está investigando su uso como preparados de NPs de TiO₂ en varios productos del cuidado de la piel para tratar acné vulgaris, dermatitis atópica, lesiones hiperpigmentadas de la piel, condiloma acuminado recurrente, entre otras (14). Asimismo, las NPs de TiO₂ también parecen mostrar actividades antibacteriales bajo radiación ultravioleta (15), ampliando así su aplicación en este campo. Tradicionalmente, las partículas de TiO₂ se han considerado como inertes, debido a esto, se han utilizado como “control negativo” en muchos estudios toxicológicos de partículas tanto in vitro como in vivo. Actualmente, esta visión ha cambiado tras observar el desarrollo de tumores pulmonares cancerígenos en ratas después de dos años de exposición a concentraciones altas de partículas finas de TiO₂ (16). Por lo que la Agencia Internacional para la Investigación sobre el Cáncer ENT#091;por sus siglas en inglés, International Agency for Research on Cancer (IARC)ENT#093;, ha clasificado al TiO₂ dentro del grupo 2B carcinógeno (posible carcinógeno para humanos) (17). Un aspecto que debe tomarse en consideración, es que las NPs poseen un tamaño diminuto, el cual facilita su incorporación a las células por vía de endocitosis (18) y una vez que las NPs han traspasado la membrana, pueden afectar las funciones celulares e inducir la muerte. Existe cierta controversia sobre la biocompatibilidad de dichas NPs; algunos estudios muestran que la inhalación e ingesta de estas es segura sin causar efectos adversos (19), mientras que otros reportes señalan que incrementan el riesgo a desarrollar asma en las crías de ratones expuestos a inhalarlas (20). Además, se ha encontrado que causan efectos citotóxicos en contacto con tejido cardiaco (21) y hemaglutinación y hemólisis celular en cultivo con eritrocitos (22). En cambio, algunos estudios en otro tipo de líneas celulares reportan que el contacto con células epiteliales alveolares (8A549), células epiteliales bronquiales (16HBE), monocitos/macrófagos (THP-1), y macrófagos alveolares de ratón no producen citoxicidad, ni reducción del número de células viables (23). Por otro lado, las NPs, en dosis mayores a 1 mg/L muestran citotoxicidad por acción pro-oxidante en contacto de fibroblastos de ratón y de humano (24). Las condiciones para la evaluación nanotoxicológica in vitro pueden verse en la Tabla I.

En odontología, la utilización de las NPs es un campo potencial para el desarrollo de nuevos materiales de restauración, implantes dentales, irrigación de conductos, entre otras, debido a sus propiedades antibacteriales y terapéuticas (25) including dental practice with the development of silver nanoparticles (Ag NPs). Recientemente, diversos materiales dentales han incluido NPs en su composición. Por ejemplo, se han incorporado NPs de TiO₂ a cementos de ionómero de vidrio, las cuales incrementan significativamente su resistencia a la flexión y compresión, así como su microdureza y su efecto antibacterial, además de no interferir con la adhesión de estos con los tejidos dentales (26).

Por lo antes mencionado, el presente artículo tiene como propósito analizar el impacto biológico de las NPs de TiO₂ para determinar su citotoxicidad, producción de ROS así como inducción de estrés oxidativo, a través de una revisión sistemática de la bibliografía publicada hasta el momento sobre la biocompatibilidad de éstas en contacto con células orales. Adicionalmente, se incluyó una breve sección que brinda un panorama general de los métodos de síntesis de NPs de TiO₂.

METODOLOGÍA

En la presente revisión sistemática, los datos disponibles sobre las NPs de TiO₂ fueron recopilados de la base de datos electrónica PubMed y Science Direct, de acuerdo con recomendaciones PRISMA para revisiones sistemáticas (27), durante el mes de octubre-noviembre de 2017. Se realizó una búsqueda de los métodos de síntesis de NPs de TiO₂ con el fin de enriquecer el contenido de la revisión, así como ofrecer un contexto adecuado del tema. La búsqueda electrónica se realizó en dichas bases de datos con las siguientes palabras clave y términos MeSH: viability AND oral cells AND titanium dioxide nanoparticles; Cytotoxicity AND titanium dioxide nanoparticles AND oral cells; Prostaglandin E₂ AND titanium dioxide nanoparticles AND oral cells; Oral cells AND oxidative stress AND titanium dioxide nanoparticles; Reactive oxygen species generation AND titanium dioxide nanoparticles AND oral cells.

Para refinar aún más la búsqueda, se tomaron los siguientes criterios de inclusión: Artículos de texto completo en idioma inglés centrados en el objetivo de esta revisión, que son los aquellos estudios originales publicados en revistas sobre biocompatibilidad de las NPs de TiO₂ en contacto con células orales. La evaluación de la calidad de los artículos fue determinada por la investigación original y metodológicamente coherente y publicada en revistas indizadas de revisión por pares. Las referencias bibliográficas de los artículos consultados también se consideraron como búsqueda manual, como artículos pertinentes no incluidos en la búsqueda electrónica si contaban con los criterios de inclusión de la búsqueda. La extracción de datos, la recolección, manejo y análisis de datos consistió en la descripción de la evidencia relevante, la cual se presenta en diagrama de flujo de acuerdo a PRISMA (Fig. 1). Además, se presenta una evaluación crítica de los resultados de forma ordenada bajo encabezados apropiados para cada uno de ellos.

DESARROLLO DE LA REVISIÓN SISTEMÁTICA

Generalidades de los métodos de síntesis de NPs de TiO₂

Uno de los aspectos importantes que se debe de considerar cuando se pretende utilizar un material estructurado es el método de síntesis, ya que este va encaminado a controlar la morfología, tamaño y el ambiente químico en la superficie de la NPs. En la literatura, desde hace más de dos décadas, existen reportes de síntesis de TiO₂, enfocados a la preparación de polvos, cristales, películas delgadas y estructuras. Existe una gran gama de métodos de síntesis que pueden ser utilizados para obtener NPs de TiO₂; desde los físicos hasta los biológicos, por lo que, dependiendo de la aplicación final, será el método utilizado para elaborarlas (28).

Cuando se desea tener un buen control de la estequiometría, el tamaño y la forma los métodos más utilizados son los métodos químicos, entre los que podemos mencionar sol-gel, micro-emulsión, hidrotermal o deposición química de vapor. Sin embargo, estos métodos presentan algunas desventajas tales como el uso de precursores caros, tiempos largos de síntesis y, en algunos casos, presencia de impurezas.

El método de sol-gel, es en base húmeda; en la que se realiza una reacción de hidrólisis del alcóxido o haluro del metal precursor, dando paso a la condensación de la fase inorgánica; siendo uno de los más utilizados. Uno de los grupos de investigación que estudiaron algunas de las variables que interviene en este proceso es el de Sugimoto y col. (29-33); ellos variaron la relación del precursor con un grupo amino, pH, temperatura y tiempo de reacción y encontraron que controlando estas variables podían obtener NPs con diferentes morfologías y tamaños. Su y col. (34), sintetizaron NPs de TiO₂ a partir de la hidrólisis de n-Butóxido de Titanio (IV) en isopropanol con un tamaño variable de 4-35nm con morfologías elipsoidales y polígonales. Wetchakun y Phanichphant (35), utilizaron etanol absoluto para llevar a cabo la hidrólisis y una membrana de celofán para aumentar el proceso de difusión, reportando NPs de TiO₂ con alta pureza y tamaños de 15-60nm.

Otro de los métodos, en el cual utiliza agua como solvente es el de micro-emulsión donde se forman micelas para controlar el tamaño y la morfología de las NPs de TiO₂ (36-42). En este método las variables que se deben de controlar son la solubilización, tensión superficial, conductividad y difusión. Kim y cols. (36) sintetizaron NPs de TiO₂, en agua y en amoniaco y obtuvieron partículas amorfas con tamaños de 10-20nm; al calcinar a 600°C obtuvieron la fase anatasa y a 900°C la fase rutilo. Li y col. (40) utilizaron una fase oleosa y un surfactante no iónico y obtuvieron NPs amorfas; la fase anatasa se obtuvo utilizando rangos de temperatura de 200-750°C y la fase rutilo con una temperatura mayor a 750°C. Zhang y col. (11) sintetizaron TiO₂ cristalino, utilizando ácidos y temperatura ambiente; su aporte principal fue la relación de la acidez con la relación de cristalinidad de la nanopartícula.

También, diferentes grupos de investigación (16-23), han sintetizado NPs de TiO₂ utilizando método hidrotermal o solvotermal. Nian y col. (23) prepararon barras de anatasa en ausencia de surfactantes controlando el pH de la reacción.

En definitiva, se han reportado una gran variedad de métodos de síntesis para fabricación de NPs de TiO₂ con diferentes morfologías y tamaños. De ellos, el método de sol-gel es el más recomendado para sintetizar nanopartículas monodispersas, que es un factor importante para obtener los beneficios de los materiales a escala nanométrica y que dichas NPs puedan ser utilizadas en aplicaciones biológicas.

Es importante mencionar que se debe hacer un estudio detallado de la toxicidad y la biocompatibilidad de estas NPs, ya que en la literatura se muestra principalmente los estudios enfocados a las aplicaciones de TiO₂. En lo que se refiere a su biocompatibilidad, se han realizado trabajos de investigación acerca de la citotoxicidad de las NPs de TiO₂ sobre diversas células de animales y de humanos, e incluso es probable que sea uno de los nanomateriales más estudiados; sin embargo, existen pocos reportes acerca de la biocompatilibidad en células orales.

Citotoxicidad de las NPs de TiO₂ en cultivo de células orales

Al llevar a cabo la revisión sistemática, uno de los aspectos que se observan en los estudios publicados hasta el momento es la imposibilidad de realizar una comparación cuantitativa debido a la gran variabilidad en las condiciones entre los diversos estudios. Así, se emplean diversos métodos de síntesis que generan diferentes tamaños de partícula y de morfología, las dosis de las NPs difieren entre sí, así como el número de subdivisiones celulares de la población, el tipo de células, ya sea obtenidas a través explantes de tejido o adquiridas como células inmortalizadas ATCC y los cultivos celulares primarios empleadas en los experimentos. Debido a esto, la siguiente revisión sistemática está enfocada en un análisis cualitativo de los datos publicados en la literatura hasta el momento.

En las investigaciones que han sido publicadas sobre la citotoxicidad de las NPs de TiO₂ en contacto con células orales (vea Tabla II), la viabilidad celular se ha evaluado por dos métodos, el ensayo de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-ilo)-2,5-difeniltetrazol (MTT) y el tetrazolio soluble en agua (WST1). Ambos métodos son muy eficientes e igualmente válidos para terminar la citotoxidad de un material; sin embargo, el WST-1 es una prueba más sensible capaz de detectar actividad celular aun cuando el conteo es escaso.

En un estudio, en el cual se emplearon NPs de TiO₂ dopadas y sin dopar con nitrógeno a través del método del sol-gel, se observaron agregados de partículas entre 100 a 300 nm, conformados por NPs primarias de 20-30 nm, en ambos casos. En el análisis de Difracción de Rayos X (DRX), se observó que el dopaje con nitrógeno dio como resultado la formación de TiO₂ principalmente en fase rutilo, mientras que el TiO₂ sin dopar fue principalmente anatasa. Se registró la actividad mitocondrial de las células epiteliales gingivales humanas primarias (hGEPs), en contacto con NPs de TiO₂ con y sin ser dopadas con nitrógeno, con o sin luz azul (485 nm de longitud de onda) usando WST-1 (41). Además, realizaron un ensayo de especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelular, el cual mostró que las partículas causaban una respuesta de estrés en hGEPs cuando se exponían a 1 hora de luz azul, aunque esto no dio como resultado una liberación detectable de citoquinas. Los resultados muestran que las NPs de TiO₂ dopado con nitrógeno tienen actividad antibacteriana cuando se exponen a la luz azul y son biocompatibles a estas concentraciones. El tratamiento con NPs de TiO₂ dopadas con nitrógeno expuestas a luz ambiental resultó en un aumento ligero, aunque no significativo, de la proliferación celular. Además, el metabolismo celular fue significativamente elevado en las células expuestas a 50 y 100 μg/mL durante 24 horas, independientemente del tratamiento con luz. Al parecer, dichas NPs estimularon el metabolismo celular a concentraciones bajas e intermedias, pero no fueron citotóxicas en ninguna concentración probada. Debido a resultados de investigaciones como las señaladas anteriormente, acerca de las NPs y tubos de TiO₂ y de otras llevadas a cabo con otras líneas celulares no provenientes de la cavidad oral, se considera por varios grupos de investigación, como un agente que potencialmente puede estimular la proliferación celular por lo que se ha propuesto como recubrimiento para implantes dentales, sin embargo aunque la adición de NPs de TiO₂ ha mejorado la frecuencia de éxito de los implantes en experimentos in vivo, todavía dicha tasa de éxito no es completamente satisfactoria (42).

De igual manera, en otro estudio se utilizaron células epiteliales bucales humanas (TR146), las células se pusieron en contacto con dosis entre 1-200 μg/mL de NPs de TiO₂ hidrófobas-rutilo (tamaño promedio de 20 nm, recubiertas con dimeticona) y NPs de TiO₂ hidrófilas-rutilo (tamaño promedio 20 nm, recubiertas con glicerol). En sus resultados indicaron que la actividad mitocondrial de las células puestas en contacto con cada uno de los tipos de NPs fue mayor en comparación con el control celular. En este estudio se realizó una prueba de mutagenicidad (ensayo de mutación del gen HPRT), y se encontró que ninguna de las NPs desencadenó la mutación génica en las células epiteliales bucales. En dicho estudio, las NPs hidrofílicas produjeron aglomerados de casi el doble de tamaño que las NPs hidrofóbicas de TiO₂ al ser suspendidas tanto en PBS como en saliva artificial. Una posible explicación para la aparente proliferación celular podría ser que dicho incremento es detectado en el ensayo como consecuencia del aumento de la actividad metabólica mitocondrial, la cual podría implicar una situación de estrés celular. Para aclarar este problema, se examinó el potencial de membrana mitocondrial, el cual es indispensable para mantener la función fisiológica de las células. Una pérdida en el potencial de membrana produce lo que genera agotamiento de la energía y muerte celular. El colorante TMRM funciona como un sensor de potencial de membrana mitocondrial y se usó para evaluar los cambios temporales. El efecto desequilibrante del potencial de membrana mitocondrial fue más pronunciado para las partículas hidrofílicas que para las hidrofóbicas. Por tanto, un potencial de membrana reducido de las mitocondrias indica el primer signo de muerte celular programada. La producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) se evaluó en ausencia de luz UV. Los datos revelaron que las partículas hidrófobas causaron una mayor producción de ROS en comparación con las células no tratadas. Sin embargo, la fluorescencia relativa obtenida fue marcadamente menor que el control positivo (43). Esto puede interpretarse como que existe una generación de ROS por parte de estas partículas, que pueden producir cambios en las funciones mitocondriales que son seguidos por alteraciones celulares que desencadenan el inicio del proceso apoptótico.

Por otra parte, se ha reportado que el contacto de NPs de TiO₂, a diferentes concentraciones, con contacto fibroblastos gingivales humanos ENT#091;del inglés Human Gingival Fibroblast (HGF)ENT#093;, no mostraron citotoxicidad. Además, se observó proliferación celular a bajas concentraciones y una disminución en el número de células viables a mayor concentración; es decir que sigue un patrón dosis-dependiente (44).

En un estudio en el que se utilizaron NPs de TiO₂ en una mezcla de anatasa-rutilo (en relación 80:20, estabilizadas en solución acuosa, Sigma-Aldrich) comparadas con micropartículas de TiO₂ se encontró que el TiO₂, tanto nano como micrométrico, fue bien tolerado por las células al emplear un modelo de células epiteliales orales no queratinizadas (H376) a concentraciones que van de 0,031% a 0,250% peso/volumen. En dicho estudio se observó, a través de la medición de la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH), la disrupción de la membrana celular inducida por las NPs de TiO₂; la liberación de LHD para todas las concentraciones de TiO₂ tanto nano como micrométrico, fue menor al 25%. Esto indicaría que, en dicho porcentaje de células, se libera una enzima citosólica estable en etapas tempranas durante la necrosis y en etapas tardías durante la apoptosis (45). Esto se interpreta como una citotoxicidad ligera, sin encontrar diferencias en dicha toxicidad atribuibles al tamaño de partícula.

En un estudio acerca de la citotoxicidad de nanotubos de TiO₂ (diámetro=120 nm) en HGF monitorizados por la actividad de la deshidrogenasa mitocondrial (ensayo de MTT), después de un período de exposición de 72 h, se observó un ligero aumento en el número de células metabólicamente activas (46), lo cual clínicamente se traduciría como proliferación celular.

Otro aspecto que es abordado es la posibilidad de emplear nanotubos de TiO₂ como reservorio de lenta liberación de factores de crecimiento tales como el Factor de crecimiento fibroblástico 2. En este estudio se muestra una citotoxicidad de los nanotubos de TiO₂ en forma de film sobre placas de Ti que podría ser empleado para fines prácticos como un recubrimiento para implantes. Al evaluar la viabilidad celular de los HGF se encontró una viabilidad ligeramente mayor que el control, la cual aumentaba aún más si se exponía a diferentes concentraciones del Factor de crecimiento fibroblástico 2 (FGF2) de manera dosis dependiente, lo cual a su vez también incrementa la adhesión celular a las placas de Ti funcionalizadas con los nanotubos y el FGF2. En este estudio se remarca la importancia de continuar estudiando la posibilidad de emplear dicho NPs de TiO₂ para liberación prolongada de factores de crecimiento de manera local, lo cual abriría la posibilidad de generar otras líneas de investigación prometedoras (47).

Además, en consistencia con esta investigación, se probaron las NPs de TiO₂ (pureza ≥ 99,5%; anatasa/rutilo = 80:20; y tamaño de partícula = 27 nm) a concentraciones desde 100 mg/L en diluciones seriadas hasta 1 pg/L frente a las células TR146. Las células tratadas fueron igual de viables (más del 98% de viabilidad relativa) que el grupo control no tratado. Dichas células tratadas son igual de viables (más del 98% de viabilidad relativa) que el grupo control no tratado. En las células TR146 con NPs de TiO₂, la muerte celular significativa sólo se detectó a una dosis de 1 g/L con una disminución del 24% en la viabilidad celular relativa.

Otro aspecto de discusión en este estudio, es cuando las NPs de TiO₂ están en suspensión en cuyo caso tienden a agregarse y el grado de agregación depende del dispersante utilizado. Esto se demostró al comparar el tamaño hidrodinámico de las NPs suspendidas en agua ultrapura, DMEM/F-12 y únicamente DMEM. Los resultados mostraron que el tamaño hidrodinámico de las NPs en DMEM fue 33-37% menor que el tamaño de las partículas suspendidas en agua ultrapura; en cambio, en DMEM/F-12 el tamaño fue un poco mayor que en aquellas partículas suspendidas en DMEM pero 28% más pequeñas que las suspendidas en agua ultrapura. Los valores absolutos del potencial zeta se desplazaron hacia potenciales negativos en los medios de cultivo, DMEM/F-12 (7,6 mV) y DMEM (-11,6 mV) en comparación con los valores del potencial zeta del agua ultrapura (+21,8 mV). Al ser suspendidas en agua las NPs de TiO₂ con un tamaño de 29,8 nm incrementó el tamaño a 392,2 nm en agua ultrapura cuyo pH fue de 6,8, DMEM/F-12 con un pH de 7,4 con 282 nm y DMEM completo (pH 7,4) con 260,9 nm, por lo que el medio es un factor determinante para la agregación de las partículas. Además, al parecer, existe una relación directa entre el pH del medio de cultivo, el potencial zeta y la aglomeración de las NPs; esto es un aspecto importante ya que de dichas condiciones dependerá el tamaño final de los agregados de TiO₂. Al observar los resultados de estudios sobre vialidad celular del contacto de las NPs de TiO₂ en cultivo celular, éstas tienden a agregarse entre sí muy fácilmente al entrar en contacto con el medio de cultivo celular, formando aglomerados de NPs (Fig. 2), que muestran menor toxicidad los aglomerados cuando se compara con las NPs dispersas. Al parecer, la transición entre la agregación y dispersión de estas NPs produce resultados experimentales diferentes dependiendo la naturaleza de dichos experimentos. Dado los datos de los reportes anteriores, la citotoxicidad de dichas NPs se genera en función de la concentración; por lo que mientras las concentraciones sean bajas, la citotoxicidad del material es mínima. En el estudio referido se observó una baja citotoxicidad en TR146. En dichas células, la muerte celular sólo se detectó a una dosis de 1 g/L, con una disminución del 24% en la viabilidad celular (48).

Por otra parte, es muy escasa la información sobre el efecto de las NPs de TiO₂ sobre las células cancerígenas. Debido a que estas células exhiben una alta capacidad de proliferación y, tomando en cuenta el comportamiento reportado en células normales de las NPs de TiO₂ se podría suponer que tampoco serian citotóxicas para las células cancerígenas. Para demostrar esto, se pusieron en contacto NPs de TiO₂ con células humanas de carcinoma escamoso ENT#091;del inglés Human Squamous Carcinoma (HSC-2)ENT#093;, las cuales no mostraron citotoxicidad y al combinarse con agentes quimioterapéuticos tampoco se potencializó el efecto antitumoral de dichos fármacos ENT#091;doxorubicina, melfalán, 5-fluorouracilo (5-FU), gefitinib, y docetaxelENT#093; (49), sin mostrar diferencias estadísticamente significativas.

Otra línea de estudios involucra la incorporación de las NPs de TiO₂ a materiales de uso odontológico en porcentajes menores al 5%, ya que dopar un material con un porcentaje mayor de NPs de cualquier composición (no necesariamente de TiO₂) genera un decremento de las propiedades físicas originales del material. En este sentido, se realizó un estudio, en el cual se incorporaron NPs de TiO₂ (3 y 5%) en diferentes cementos de ionómero de vidrio (GIC, de 0 a 40 mg/mL). Se encontró una citotoxicidad moderada, independientemente de la composición del GIC y la presencia o la ausencia de NPs de TiO₂; sin embargo, extrañamente, las células de cáncer orales fueron más sensibles que las células orales normales (50). También se realizó un estudio para evaluar la citotoxicidad del MTA y MTA con NPs de TiO₂ al 1% en peso durante 24 y 48 h después de ponerse en contacto con HGF. Los resultados mostraron un aumento en la viabilidad celular de ambos grupos, y en ambos intervalos de tiempo, respecto al control de células sin inocular. Sin embargo, una de las deficiencias que impiden la reproducibilidad de este estudio, es que no se especifica el tamaño de partícula ni el método de obtención de las nanopartículas (51).

Al realizar los ensayos de viabilidad celular, una consideración importante es que el método del MTT o incluso el WST-1 pueden dar resultados erróneos. El primero, por ejemplo, se basa en la reducción metabólica del MTT realizada por la enzima mitocondrial succinato-deshidrogenasa en un compuesto coloreado de color azul-violeta (formazán), permitiendo determinar la función mitocondrial de las células tratadas. En el empleo de este ensayo se pueden producir lecturas erróneas debido a que ciertas NPs reaccionan con los reactivos empleados en los ensayos de citotoxicidad al incorporar un solvente orgánico aprótico, comúnmente dimetil sulfóxido, lo que genera la interpretación de las partículas como células vivas o con actividad mitocondrial en el ensayo (52). Para evitar que esto ocurra debe trasportarse el sobrenadante de los platos de cultivo a una microplaca nueva antes de la lectura de la densidad óptica. Esto resuelve el problema dando una lectura precisa de la cantidad de actividad metabólica que se entiende como el número de células viables en el cultivo.

Acción pro-inflamatoria de las NPs de TiO₂ en células orales

A pesar de que las NPs de TiO₂ no mostraron citoxicidad en cultivo con HGF, estas NPs inducen a un incremento en la producción de prostaglandina E2 (PGE2) con la mínima concentración de 0,2 mM (47), y en mayor grado cuando se adiciona interleucina-1β (IL-1β), un agente inflamatorio conocido y estudiado previamente por nuestro grupo de investigación. El contacto de las NPs de TiO₂ con HGF, refleja una actividad pro-inflamatoria cuyo mecanismo se ha identificado por el incremento de la expresión de ciclooxigenasa 1 y 2 al estar presente la IL-1β, agravando el efecto pro-inflamatorio (53). Esta información es de suma importancia, ya que la presencia de NPs de TiO₂ en cavidad bucal y ante una enfermedad inflamatoria crónica (por ejemplo, en la periodontitis y gingivitis) agrava significativamente la inflamación, pero al conocer los mecanismos pro-inflamatorios se puede contrarrestar dicha inflamación con antiinflamatorios no esteroideos.

Es imprescindible mencionar que la acción pro-inflamatoria puede ser el resultado de la presencia de lipopolisacáridos (LPS) en las NPs; sin embargo, se ha eliminado esta posibilidad a través de la adición intencional de LPS en el cultivo, concluyendo que su presencia (a una concentración de 0,2 mM de NPs de TiO₂ con 9,0 ng de LPS) no es suficiente para inducir una acción pro-inflamatoria, siendo las NPs de TiO₂ la causa directa de la inducción del efecto inflamatorio en cultivo de HGF ^{(44, 52)}.

Se encontró un único estudio, realizado por nuestro grupo de trabajo, donde se realizó un análisis con técnica metabolómica de las NPs de TiO₂ en HGF inducidas a un estado inflamatorio con IL-1β. Las NPs de TiO₂ aumentaron significativamente la producción de prostaglandina E2 inducida por IL-1β y expresión de la proteína COX-1 y COX-2. IL-1β, redujo las concentraciones intracelulares de metabolitos primarios en general, especialmente las vías sintéticas de los aminoácidos, el ciclo de urea, poliamina, S-adenosilmetiona y glutatión (52), ciclos relacionados con el proceso inflamatorio e incremento del estrés oxidativo. Por tal motivo, se recomendaría el uso cuidadoso de los materiales dentales que contienen NPs de TiO₂ en pacientes con enfermedades pro-inflamatorias agudas o crónicas como gingivitis o periodontitis que son muy comunes en la cavidad oral.

Incorporación de las NPs de TiO₂ en las células orales

La interacción de las NPs de TiO₂ con las células es un tema de relevancia para comprender los mecanismos de citotoxicidad de dicho material. En un estudio, se identificó que la incorporación de las NPs de TiO₂ a las células se lleva a cabo por medio de endocitosis por vía de receptores tipo toll 4 (TLR 4) (54). La observación con microscopio electrónico de transmisión demostró la incorporación de NPs de TiO₂ en forma de endosoma temprano y la inducción de formación de vesículas lisosomales de las células (55).

En células orales normales de HGF, HPLF y cancerígenas HSC-2 se ha observado la incorporación de las NPs de TiO₂. A pesar de la formación de agregados de NPs, algunas logran incorporarse a la célula y estas se depositan y coexisten como vesículas con organelos celulares donde las NPs son vacuolizadas para su eliminación. Esta atracción o incorporación dentro de las células puede ser causa de la interacción entre los grupos amino y carboxilo de la membrana celular (con carga negativa) y la superficie de las NPs de TiO₂ (con carga positiva) (55). Sin embargo, el mecanismo de incorporación de las NPs de TiO₂ a las células aún no se conoce ampliamente. Diversos estudios señalan que las NPs, después de incorporarse a la célula se posicionan como endosomas y se obsrva la atracción de lisosomas en el citoplasma ^{(44, 53)}. En otro estudio con NPs de TiO₂ de rutilo, hidrofílicas (20 nm) y de rutilo hidrofóbicas (20 nm) se observaron diferencias significativas en la localización de partículas intracelulares en células epiteliales bucales humanas (TR146). Las partículas hidrofílicas se encontraron libremente distribuidas en el citoplasma, mientras que sus homólogas hidrófobas fueron engullidas en estructuras vesiculares; por lo tanto, los efectos secundarios citóxicos fueron bajos ya que las partículas aisladas del citoplasma no reaccionan con las estructuras intracelulares. Al parecer, las partículas hidrófobas no se unieron a las vesículas; en consecuencia, pudieron interferir con la membrana mitocondrial externa, alterando el potencial de membrana mitocondrial que es un elemento indispensable para la homeostasis celular (43).

A través de la revisión de la literatura es evidente que se han observado diferencias en la localización de NPs de TiO₂ en el interior de las células. Esto puede deberse a diversos factores intrínsecos a la morfología, tamaño, método de síntesis y agente estabilizador de las NPs. Es indudable que el medio en el que dichas NPs son solubilizadas juega un papel importante en su interacción con las células dado el cambio producido en el potencial Z de la partícula y la formación de aglomerados.

PERSPECTIVAS FUTURAS

En un futuro, es necesario contar con mayor evidencia científica para determinar la biocompatibilidad y la aplicación segura de las NPs de TiO₂ en contacto con las células orales. Para esto, el estudio de perfiles metabólicos será capaz de proporcionar información sobre la toxicidad de las NPs de TiO₂, los procesos patológicos asociados a éstas y su influencia en las funciones bioquímicas. Los estudios metabolómicos han sido ampliamente utilizados en la evaluación de la seguridad de los productos químicos como un método para identificar nanotoxicidad en los órganos blancos y el mecanismo toxicológico a través de biomarcadores de orina y suero. Una técnica metabolómica selectiva es la espectroscopía de resonancia magnética nuclear (RMN), acoplado con el patrón de reconocimiento (PR). Las investigaciones futuras podrían emplear dichos métodos, ya que éstos pueden ofrecer información nanotoxicológica rápida y no invasiva, sólida y reproducible (56). De esta manera, mediante pruebas de expresión metabólica es necesario determinar las vías inflamatorias de señalización y el mecanismo de interacción de los metabolitos, así como crear estrategias terapéuticas específicas para la aplicación de antiinflamatorios como método de prevención y determinar los efectos dosis-respuesta de las NPs de TiO₂ en diversos intervalos de tiempo, particularmente en estudios in vivo. La demostración de la bioseguridad en el uso de las NPs de TiO₂ deben estar encaminadas a probar su biocompatibilidad en modelos animales.

Se concluye que los trabajos de investigación encaminados al estudio de la interacción de las NPs de TiO₂ con células y tejidos bucales es limitada debido a que este tipo de materiales se usaban en otras áreas de aplicación, como fotocalizadores o portadores de carga por mencionar algunos. Las publicaciones están orientados a pruebas de citotoxicidad en otro tipo de células somáticas (no provenientes de la cavidad oral) y órganos que pueden ser afectados durante los métodos de síntesis o manipulación de la NPs. Por lo anterior, es de suma importancia revisar los resultados con los que se cuenta hasta el momento, ya que uno de los temas científicos de gran relevancia es la creación de biomateriales odontológicos basados en NPs.

La evidencia con la que se cuenta hasta el momento sugiere que las NPs de TiO₂ en cultivos de células de la cavidad oral no producen un efecto citotóxico y al parecer estimulan el crecimiento celular a bajas concentraciones (hormesis). Este comportamiento puede ser atribuido a la aglomeración de las NPs al entrar en contacto con el cultivo celular. De manera general, en los resultados de los estudios en células in vitro se observa cierto grado de biocompatibilidad, siendo un paso importante en el campo científico encaminado al uso de las NPs de TiO₂ en odontología que debe ser extrapolado a un sistema in vivo tomando en cuenta todas las condiciones inherentes para realizar estos estudios.

Por otro lado, la investigación clínica sugiere que un efecto pro-inflamatorio en fibroblastos gingivales humanos es ocasionado por el uso de NPs de TiO₂ en ausencia de interleucina-1β; y podría agravarse en pacientes con enfermedades bucales inflamatorias crónicas.

AGRADECIMIENTOS

Proyecto UNAM-DGAPA, PAPIME: PE201617 y PAPIIT: IA204516. Red Farmoquímicos, CONACyT.

REFERENCIAS

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Notas de autor

Autor de correspondencia: René García-Contreras. Laboratorio de Investigación Interdisciplinaria (LII), Área de Nanoestructuras y Biomateriales, Escuela Nacional de Estudios Superiores Unidad León; Universidad Nacional Autónoma de México; León, Guanajuato, México. e-mail: dentist.garcia@gmail.com