Estudio de la expresión del P16INK4A Y KI 67 en diagnóstico de lesiones intraepiteliales de cabeza y cuello informe preliminar
Estudio de la expresión del P16INK4A Y KI 67 en diagnóstico de lesiones intraepiteliales de cabeza y cuello informe preliminar
Revista Venezolana de Oncología, vol. 29, núm. 2, pp. 83-90, 2017
Sociedad Venezolana de Oncología
Recepción: 22 Septiembre 2016
Revisado: 15 Octubre 2016
Aprobación: 12 Noviembre 2016
Resumen: OBJETIVO: El p16INK4a ha sido identificado como un biomarcador de infección por VPH y su presencia en conjunto con el Ki 67 ha sido propuesta como una herramienta diagnostica de lesiones pre invasoras intraepiteliales cervicales. Es conocida la asociación del VPH con algunos tipos de carcinomas epidermoide de cabeza y cuello. El propósito de este estudio fue utilizar la inmunotinción de p16/Ki-67 en el diagnóstico de lesiones intraepiteliales preinvasoras de mucosa de cabeza y cuello. MÉTODO: Una serie de 20 lesiones intramucosas provenientes de la cavidad oral y laringe. Utilizamos la técnica de matriz de tejidos y realizamos inmunohistoquímica para p16/Ki-67. RESULTADOS: El diagnóstico histológico fue de papilomatosis, hiperplasia escamosa y displasia. Inesperadamente el 60 % fueron de sexo femenino y 40 % masculino. 13 % progresaron a carcinoma escamoso de cabeza y cuello entre un mes y 5 años después del diagnóstico. 13 % expresaron p16/Ki-67. Todos los pacientes positivos para Ki-67 evolucionaron a carcinoma. CONCLUSIÓN: La serie es muy pequeña y no permitió encontrar asociación entre p16/Ki-67 con las variables. Los datos sugieren que Ki 67 podría ser utilizado como un biomarcador para el riesgo de desarrollo de carcinoma infiltrante. La utilidad del p16 como biomarcador de infección por VPH debe ser confirmado con métodos moleculares.
Palabras clave: p16INK4a, VPH, Ki 67, carcinoma epidermoide, cabeza, cuello, lesiones intramucosas, papilomatosis.
Abstract: OBJECTIVE: The p16INK4a has been identified as a biomarker for lesions caused by the HPV, and its presence with Ki-67 immunostains has been proposed as a diagnostic tool for the neoplastic pre invasive lesions. For all is well known the association between the HPV and certain kinds of the head and neck squamous cell carcinoma. The purpose of this study was to determine the use of P16/Ki-67 immunostains in the diagnosis of the neoplastic intramucosal pre invasive lesions of head and neck. METHOD: A series 20 biopsies of intramucosal lesions from oral cavity and larynges. We used tissue microarray technique and performed immunostains for P16/Ki-67. RESULTS: Histological diagnosis was papillomatosis, squamous hyperplasia and dysplasia. Unexpected 60 % were female and 40 % were man. 13 % evolved to a squamous cell carcinoma between 1 month and 5 years. 13 % express P16/Ki-67 immunostains. All patients positive Ki-67 evolves to head and neck squamous cell carcinoma. CONCLUSION: The series is too short; we were not able to find association between the p16/Ki-67 and variables. Data suggests that Ki-67 as biomarker predicting a higher risk of becoming and invasive carcinoma. In addition, the utility of p16 as biomarker of the HPV lesions has to be confirming with the molecular diagnosis.
Keywords: p16INK4a, HPV, Ki 67, head, neck, squamous carcinoma, intra mucosal lesion, papillomatosis.
INTRODUCCIÓN
El carcinoma epidermoide de cabeza y cuello (CECC) constituye el sexto tumor maligno más común, con una incidencia anual estimada de 633 000 y 355 000 muertes en todo el mundo (1,2,3).
Las lesiones precursoras son conocidas como alteraciones del epitelio que tienen mayor probabilidad de progresión hacia el CECC. Los términos displasia, neoplasia intraepitelial e hiperplasia epitelial atípica se utilizan casi de manera equivalente. Estas lesiones de potencial maligno implican cambios citológicos y arquitecturales caracterizados por atipias y trastornos de maduración del epitelio de revestimiento de tipo mucoso de la cabeza y el cuello (4,5,6).
En la actualidad entre los factores de riesgo conocidos se reconoce la participación de la infección por el Virus del Papiloma Humano (VPH). Los serotipos de alto riesgo (16, 18, 31 y 33), se describen en la literatura mundial en el carcinoma de cuello uterino, otras neoplasias ano-genitales, y en un subgrupo de CECC (3).
En las etapas iniciales de la enfermedad, el paciente puede no mostrar ningún síntoma clínico; y como un número tan significativo de los pacientes presentan metástasis en el momento del diagnóstico (nodal regional participación en 43 % y la metástasis distante en 10 %), lo que lleva a 5 años las tasas de supervivencia de menos de 60 % (7).
Tienden a ser altamente curables si se detecta tempranamente. El VPH posee E6 y E7 las cuales codifican las principales oncoproteínas del virus, que promueven la célula a la progresión del ciclo y la replicación del ADN viral. La mayoría de las personas con infección por el VPH no desarrollan cáncer. La expresión de E6 y E7 es necesaria pero no suficiente para transformación maligna (7,8).
Sin embargo, el aumento de la capacidad proliferativa y la evasión de la apoptosis inducida por la E6 y E7 pueden conducir a la acumulación de daño del ADN y mutaciones que en última instancia, pueden dar lugar a la transformación maligna y la carcinogénesis. La proteína E7 también conduce a un aumento de la inducción de p16INK4a (9,10,11,12).
La patogénesis del carcinoma de cabeza y cuello no solo está asociada al VPH sino se enfoca la adquisición de seis habilidades fundamentales por parte de las células neoplásicas: autosuficiencia de las señales de crecimiento, insensibilidad a las señales inhibidoras del crecimiento, evasión de la muerte celular programada (apoptosis), potencial replicativo ilimitado, mantenimiento de la angiogénesis, y capacidad de invadir los tejidos y producir metástasis. Estos comportamientos no son independientes uno del otro y son resultado de un complejo proceso de alteraciones genéticas en múltiples etapas desde las lesiones pre-malignas hasta el carcinoma (11).
El p16(INK4a) es un gen supresor que modula la proliferación celular. Se localiza en la región 21 del brazo corto del cromosoma 9 y es un potente inhibidor del complejo ciclina D1/cdk4. Este efecto oncogénico de p16(INK4a) depende de la inhibición de CDK4 / CDK6 en el cáncer células donde se inactiva Rb, cuya inactivación por la proteína E7 sensibiliza a las células a la apoptosis dependiente de p53, pero la proteína E6 inhibe las funciones proapoptóticas de p53. E6 se une directamente a un asociado-E6 proteína (E6-AP), una ubiquitina-ligasa específica para la degradación de p53 (1,2,3,4,5).
E6 y E7 también pueden inducir daño al ADN y aumentar la frecuencia de integración de ADN extraño en el genoma del huésped. La proteína E7 se une a Rb, dando lugar a la sobreexpresión de la p16(INK4a) gen supresor de tumor en células tumorales infectadas por el VPH. Dicha sobreexpresión por sí sola no es suficiente para identificar con precisión la infección por VPH en los carcinomas de células escamosas en cabeza y cuello (18).
Por lo tanto, los marcadores de proliferación celular, como el Ki 67 pueden ser útiles en la valoración del tipo y grado de las lesiones pre-malignas orales. Así, los cambios en la capacidad proliferativa de las lesiones pre-malignas orales pueden revelar los cambios pre neoplásicos e indicar su potencial de transformación maligna.
MÉTODO
Se identificaron un total de 20 casos de lesiones intra-epiteliales localizadas en la mucosa de cabeza y cuello con los diagnósticos de papilomatosis, displasia o neoplasia intraepitelial, atendidos en el servicio de cabeza y cuello en el Instituto de Oncología “Dr. Miguel Pérez Carreño”, entre enero de 2005 hasta diciembre de 2015. Se utilizaron como criterios de inclusión la disponibilidad de los bloques de parafina y la disponibilidad de la información clínica relacionada con la evolución de los pacientes.
CONSTRUCCIÓN DE MATRIZ DE TEJIDO (MICROARRAY)
De los bloques de parafina seleccionados, se obtuvieron secciones histológicas de 4 μm de espesor que posteriormente se tiñeron con hematoxilina-eosina. Se revisaron las preparaciones histológicas y se seleccionaron cuidadosamente las zonas con tumor, marcando esas mismas áreas en el bloque de parafina.
Se prepararon los bloques receptores de un tamaño aproximado de 5 cm x 4 cm. Cada uno de estos bloques donantes se dividió a la mitad para poseer un duplicado de cada caso. En cada fragmento se seleccionaron dos zonas diferentes en el bloque de tejido donante. Se estableció el orden de estos bloques en una plantilla que sirvió después para su lectura en el microscopio.
En la realización del troquelado de los bloques se utilizó una aguja hueca con la cual se extrajo un cilindro de parafina del bloque receptor dejando el espacio donde se introducen los cilindros obtenidos de los bloques donantes. Con otra aguja de menor calibre se obtuvo el cilindro con el material de la zona marcada del bloque donante que se introdujo en el bloque receptor. Los cilindros fueron introducidos de modo que quedaran al mismo nivel que el bloque de parafina para facilitar el corte de todos ellos. Al culminar el proceso de troquelado de todos los bloques, se le coloco una capa de parafina al nuevo bloque y se esperó 60 min para que la parafina se solidificara y la superficie se alisara.
INMUNOHISTOQUÍMICA
Se realizaron cortes histológicos de 2 μm en un micrótomo y cada uno fue colocado en láminas portaobjetos tratadas previamente con poly-L-lisina y secadas durante 45 min a 70°C en estufa, para evitar el desprendimiento de los cortes.
Se realizaron estudios inmunohistoquímicos, mediante la técnica de avidina-biotina peroxidasa (ABC), después de desparafinación y tratamiento de los tejidos con soluciones recuperadoras de epitopes utilizando vaporizador, los cortes histológicos fueron incubados con el siguiente anticuerpo monoclonal: p16INK4a y el índice de proliferación celular Ki67. Se utilizaron controles positivos adecuados para establecer la veracidad de las reacciones.
ANÁLISIS DEL RESULTADO DE INMUNOHISTOQUÍMICA
La cuantificación de la proporción de p16 se realizó mediante la observación de las láminas con criterios de todo o nada, es decir positivo o negativo, cuando se identificó la coloración marrón dorada en el núcleo y el citoplasma de las células. La cuantificación del Ki 67 se realizó mediante la observación de las láminas y conteo porcentual de las células, considerándose positivas aquellas con un color marrón dorado nuclear a la técnica. Se expresó en porcentaje.
Los datos obtenidos se sistematizaron en Microsoft Excel® y fueron analizados a partir del procesador estadístico Statgraphics Plus 5.1. Se relacionó la expresión de p16 y las demás variables en estudio mediante estadística descriptiva bivariada a partir del coeficiente de correlación de Pearson o Spearman. Adoptando como nivel de significancia estadística valores de P inferiores a 0,05.
RESULTADOS
De los 20 pacientes identificados en los cuales se dispuso de los bloques de parafina, 62 % fueron del sexo femenino y el 38 % del sexo masculino, con un rango de edad que osciló entre los 17 a los 73 años, un promedio de 54,2 con una desviación standard de 16,1 (Cuadro 1). Clínicamente todos los pacientes fueron diagnosticados en el mismo año de inicio de la clínica y el sitio más común fue la lengua (Figura 1).
Cuadro 1.
Características de los pacientes
Figura 1
Localización de las lesiones
El diagnostico histológico más frecuente fue de papilomatosis, seguido por hiperplasia escamosa.
Dentro de los factores de riesgo encontrados, el hábito tabáquico acentuado entre 4 cigarrillos y 2 cajas diarias estuvo presente en 60 % de los pacientes, 7 del sexo femenino y 5 del sexo masculino.
El cuadro clínico estuvo caracterizado por lesión dolorosa, con aumento de volumen de la misma y sintomatología de disfagia y disfonía. El diagnóstico se realizó principalmente por examen físico, exploración de cavidad orofaríngea, realización de laringoscopia indirecta en la consulta y corroborado por toma de biopsia de las lesiones sospechosas; la mayoría biopsias excisionales y por nasofibrolaringoscopia.
Cuadro 2
Evolución clínica
Durante su evolución clínica, el 13 % (4) de los pacientes de los 20 pacientes estudiados, progresaron a carcinoma epidermoide infiltrante y un paciente presentó un adenocarcinoma adenoideo quístico, este tenía el diagnóstico de una lesión papilar benigna de paladar blando. De los 4 pacientes con carcinoma epidermoide, 3 eran del sexo femenino y uno masculino, con edades que oscilaban entre 50 y 75 años. El diagnóstico de carcinoma epidermoide fue realizado entre 1 mes posterior al diagnóstico de papilomatosis hasta 5 años.
La única paciente con el diagnóstico de displasia leve de cuerda vocal, era de 73 años, presento un carcinoma epidermoide de laringe estadio I, 4 años más tarde.
Al realizar la técnica de inmunohistoquímica, se desprendieron un total de 5 cortes de las láminas, con los siguientes resultados. Un total de 13 casos fueron negativos para el p16 y 2 casos expresaron p16 en células basales, focal con una intensidad moderada, todos con el diagnostico histológico de papilomatosis. Asimismo, de los 15 casos a quienes se les realizó el Ki 67, 2 expresaron el anticuerpo en las capas basales, con una intensidad moderada, en un 15 % de las células evaluadas. De estos pacientes uno tenía el diagnóstico de papilomatosis y otro el diagnóstico de una displasia leve.
Los dos pacientes con el diagnóstico histológico de papilomatosis eran del sexo femenino y no hay evidencia de desarrollo de carcinoma epidermoide, en nuestra institución. Sin embargo, de los 2 pacientes con expresión de Ki 67, ambos desarrollaron carcinoma epidermoide, uno de ellos con un diagnóstico de displasia leve de cuerda vocal.
DISCUSIÓN
El CECC es aquel tumor epitelial maligno, que afecta el epitelio mucoso desde la cavidad oral, desde la superficie mucosa de los labios, faringe, orofaringe, nasofaringe, hipofaringe y laringe. A pesar de localizaciones anatómicas diferentes, comparten una serie de factores de riesgo comunes. Tradicionalmente se ha asociado al hábito tabáquico y consumo de alcohol. Sin embargo, en los últimos años, se ha detectado la presencia de pacientes con evidencia de infección por VPH, capaces de desarrollar un carcinoma epidermoide. Desde el punto de vista epidemiológico, se trata de pacientes más jóvenes que en el CECC relacionado con el hábito tabáquico. Prácticamente se trata de dos enfermedades, aquellos con tumores no relacionados al VPH y los relacionados al VPH, estos últimos con un riesgo menor de mortalidad (3,4,5,6).
Las lesiones pre-invasoras o pre-malignas del CECC, son una serie de cambios patológicos intraepiteliales que cursan con trastornos de la maduración del epitelio, en ocasiones, muy parecidos a cambios reactivos como hiperplasia de células basales o cambios histológicos asociados a la infección por el VPH. Estas lesiones son conocidas como displasia o neoplasias intraepitelial laríngea (NIL), haciendo una analogía a lo que ocurre en el cuello uterino.
En nuestra investigación, identificamos un total de 20 pacientes, la mayoría de ellos con cambios histológicos de VPH (papilomatosis) y un paciente con una displasia de cuerda vocal. A diferencia de lo descrito en la literatura mundial, nuestros pacientes demostraron un predomino importante en el sexo femenino y con una edad significativamente mayor a lo que se describe en lesiones por VPH (19,20,21,22).
El p16 es una oncoproteína supresora de CDK4,6 que en numerosos estudios es interpretado como un equivalente a la infección por el VPH. Sin embargo, en nuestra investigación, solo se demostró p16 en 2 pacientes, uno con una papilomatosis y otro con una displasia leve de cuerda vocal.
De manera semejante, solo 2 casos se identificaron expresión del índice de proliferación celular Ki 67. Ambos fueron de sexo femenino, uno desarrollo un carcinoma epidermoide de lengua y otra desarrollo un carcinoma epidermoide de laringe 5 años después.
Llama la atención el bajo índice de expresión de p16. Entre los factores que podemos postular están defectos pre analíticos como fallas en la fijación o sobreexposición al fijador, sabemos que en la mayoría de nuestras instituciones públicas o privadas no se emplea formol tamponado, otros problemas fallas en el almacenamiento de los bloques, con inadecuada preservación del material antigénico, defectos en la titulación del anticuerpo empleado, especialmente si se trata de casos con baja expresión de antígenos. Sin embargo, es importante el empleo de una prueba gold standar, como métodos moleculares para el diagnóstico de la infección por el VPH y además identificar si se trata de una serotipo de alto riesgo, riesgo intermedio o alto riesgo (23,24).
La expresión de Ki 67 en un caso de displasia leve en la capa basal de la mucosa, permite confirmar el diagnóstico histológico.
Adicionalmente, es importante recalcar que el 20 % de los pacientes con lesiones intraepiteliales o pre-invasoras desarrollaron carcinoma epidermoide infiltrante. Podemos concluir:
Las lesiones intraepiteliales más frecuentes en la mucosa de la cabeza y el cuello son las papilomatosis. En nuestras medias estas lesiones intraepiteliales son más frecuentes en mujeres que en hombres. El 20 % de estos pacientes desarrollaron un CECC, con predominio del sexo femenino. El 75 % de los pacientes que desarrollaron un CECC, referían hábito tabáquico intenso. El 13 % de los pacientes expresaron p16. El 13 % de los pacientes expresaron Ki67. Basado en estos resultados, a pesar de lo pequeña de la muestra, permite inferir que probablemente el VPH no sea un agente causal de CECC como en Europa o en EE.UU. Recomendamos en este caso hacer diagnóstico de infección por VPH, mediante técnica de PCR, Western blot o captura híbrida, para poder establecer el valor diagnóstico del p16 en las lesiones intraepiteliales mucosas de cabeza y cuello.
El CECC es aquel tumor epitelial maligno, que afecta el epitelio mucoso desde la cavidad oral, desde la superficie mucosa de los labios, faringe, orofaringe, nasofaringe, hipofaringe y laringe. A pesar de localizaciones anatómicas diferentes, comparten una serie de factores de riesgo comunes. Tradicionalmente se ha asociado al hábito tabáquico y consumo de alcohol. Sin embargo, en los últimos años, se ha detectado la presencia de pacientes con evidencia de infección por VPH, capaces de desarrollar un carcinoma epidermoide. Desde el punto de vista epidemiológico, se trata de pacientes más jóvenes que en el CECC relacionado con el hábito tabáquico. Prácticamente se trata de dos enfermedades, aquellos con tumores no relacionados al VPH y los relacionados al VPH, estos últimos con un riesgo menor de mortalidad (3,4,5,6).
Las lesiones pre-invasoras o pre-malignas del CECC, son una serie de cambios patológicos intraepiteliales que cursan con trastornos de la maduración del epitelio, en ocasiones, muy parecidos a cambios reactivos como hiperplasia de células basales o cambios histológicos asociados a la infección por el VPH. Estas lesiones son conocidas como displasia o neoplasias intraepitelial laríngea (NIL), haciendo una analogía a lo que ocurre en el cuello uterino.
En nuestra investigación, identificamos un total de 20 pacientes, la mayoría de ellos con cambios histológicos de VPH (papilomatosis) y un paciente con una displasia de cuerda vocal. A diferencia de lo descrito en la literatura mundial, nuestros pacientes demostraron un predomino importante en el sexo femenino y con una edad significativamente mayor a lo que se describe en lesiones por VPH (19,20,21).
El p16 es una oncoproteína supresora de CDK4,6 que en numerosos estudios es interpretado como un equivalente a la infección por el VPH. Sin embargo, en nuestra investigación, solo se demostró p16 en 2 pacientes, uno con una papilomatosis y otro con una displasia leve de cuerda vocal.
De manera semejante, solo 2 casos se identificaron expresión del índice de proliferación celular Ki 67. Ambos fueron de sexo femenino, uno desarrollo un carcinoma epidermoide de lengua y otra desarrollo un carcinoma epidermoide de laringe 5 años después.
Llama la atención el bajo índice de expresión de p16. Entre los factores que podemos postular están defectos pre analíticos como fallas en la fijación o sobreexposición al fijador, sabemos que en la mayoría de nuestras instituciones públicas o privadas no se emplea formol tamponado, otros problemas fallas en el almacenamiento de los bloques, con inadecuada preservación del material antigénico, defectos en la titulación del anticuerpo empleado, especialmente si se trata de casos con baja expresión de antígenos. Sin embargo, es importante el empleo de una prueba gold standar, como métodos moleculares para el diagnóstico de la infección por el VPH y además identificar si se trata de una serotipo de alto riesgo, riesgo intermedio o alto riesgo (23,24).
La expresión de Ki 67 en un caso de displasia leve en la capa basal de la mucosa, permite confirmar el diagnóstico histológico.
Adicionalmente, es importante recalcar que el 20 % de los pacientes con lesiones intraepiteliales o pre-invasoras desarrollaron carcinoma epidermoide infiltrante. Podemos concluir:
Adicionalmente, es importante recalcar que el 20 % de los pacientes con lesiones intraepiteliales o pre-invasoras desarrollaron carcinoma epidermoide infiltrante. Podemos concluir:
Las lesiones intraepiteliales más frecuentes en la mucosa de la cabeza y el cuello son las papilomatosis. En nuestras medias estas lesiones intraepiteliales son más frecuentes en mujeres que en hombres. El 20 % de estos pacientes desarrollaron un CECC, con predominio del sexo femenino. El 75 % de los pacientes que desarrollaron un CECC, referían hábito tabáquico intenso. El 13 % de los pacientes expresaron p16. El 13 % de los pacientes expresaron Ki67. Basado en estos resultados, a pesar de lo pequeña de la muestra, permite inferir que probablemente el VPH no sea un agente causal de CECC como en Europa o en EE.UU. Recomendamos en este caso hacer diagnóstico de infección por VPH, mediante técnica de PCR, Western blot o captura híbrida, para poder establecer el valor diagnóstico del p16 en las lesiones intraepiteliales mucosas de cabeza y cuello.
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Notas de autor
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