Comparación del daño cromosómico provocado in vitro por dos formas de administración del tratamiento preventivo de la anemia ferropénica

Comparison of in vitro chromosome damage caused by two ferrous sulphate methods of administration to prevent iron deficiency anemia

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La deficiencia de hierro es la carencia nutricional más prevalente y la principal causa de anemia a escala mundial (International Nutritional Anemia Consultive Group, 2003). En nuestro país, en general y en la provincia de Buenos Aires en particular, numerosos estudios demuestran que la prevalencia de anemia y deficiencia de hierro son muy elevadas (González et al., 2006; Malpeli et al., 2006; ENNyS, 2007; González et al., 2007; Apezteguía et al., 2008).

Los grupos poblacionales con mayor riesgo de sufrir dicha carencia son los niños de entre 6 y 24 meses de edad y las mujeres embarazadas. En los niños, la causa más común es el aumento del requerimiento ferroso, relacionado con la mayor velocidad de crecimiento (Clark, 2008).

La anemia por carencia de hierro (ADH) es una condición patológica, en la cual no hay suficiente mineral para la síntesis de proteínas y enzimas que contienen hierro, tales como hemoglobina, mioglobina, citocromos, catalasas y varias peroxidasas (Aksu et al., 2010). Se han descrito otras manifestaciones no hematológicas de la deficiencia de hierro como disminución de la capacidad de trabajo físico y de la actividad motora espontánea, alteraciones de la inmunidad celular y de la capacidad bactericida de los neutrófilos, disminución de la termogénesis, alteraciones funcionales e histológicas del tubo digestivo, falla en la movilización de la vitamina A hepática, disminución de la velocidad de crecimiento, alteraciones conductuales y del desarrollo mental y motor, velocidad de conducción más lenta de los sistemas sensoriales auditivo y visual y reducción del tono vagal, entre otros (Olivares et al., 2003; Swanson, 2003; Beard, 2008). La deficiencia de hierro, al igual que la de otros micronutrientes, tiene un mayor impacto cuando ocurre en etapas tempranas de la vida, llevando a un retardo crónico de crecimiento, bajas capacidades cognitivas, letargo y pobre atención (Rivera et al., 2003, González et al., 2007; Algarín et al., 2003).

Esta deficiencia puede prevenirse mediante el consumo de una dieta adecuada, la fortificación de los alimentos con hierro y la suplementación con hierro medicinal. Ninguna de estas medidas es excluyente. En cuanto a la suplementación con hierro medicinal, existe un consenso científico internacional avalado por la OMS, por el cual la suplementación universal farmacológica de lactantes y embarazadas es una estrategia prioritaria cuando la prevalencia en un grupo particular es alta, mayor a 40% (UNICEF/UNU/WHO, 2001; Lynch et al., 2007).

En este sentido, en el ámbito local, la recomendación actual de la Sociedad Argentina de Pediatría (2001/2009) es la suplementación diaria con sulfato ferroso. Sin embargo, a partir de los años noventa han aparecido publicaciones que demuestran que la eficacia de una dosis semanal de hierro es comparable a la de una dosis diaria (Viteri, 1997). Se ha planteado que con la administración diaria de hierro vía oral, la absorción se ve notablemente reducida días después del inicio del tratamiento, mientras que con dosis intermitentes los niveles de absorción permanecen elevados. La dosis diaria produciría una saturación de los mecanismos de transporte que se correlacionan con síntomas de intolerancia. La dosis semanal permitiría optimizar la absorción a través de los mecanismos de transporte y disminuir, así, los síntomas de intolerancia. La prevención semanal cuenta con otras ventajas, tales como mayor adherencia y cumplimiento y menores efectos adversos (Gross y Schultink, 1994; Cook y Reddy, 1995; Liu et al., 1995; Schultink et al., 1995; Viteri, 1997; Eickmann et al., 2008).

Asimismo, el tratamiento diario preventivo de la deficiencia de hierro puede llevar, como consecuencia no deseada, a la producción de un cuadro de sobrecarga tisular de dicho mineral. El hierro participa en las reacciones de óxido-reducción de la célula y en éstas, se generan especies reactivas del oxígeno (ROS), las cuales pueden ocasionar daño en las proteínas, en los lípidos y en el ADN (Brody, 1994; Jomova y Valko, 2011; Lin et al., 2011; Prá et al., 2012). Este daño puede ser permanente y provocar alteraciones estructurales y funcionales (Aksu et al., 2010). Concentraciones elevadas de hierro en plasma pueden amplificar los efectos de los radicales libres (Ashour et al., 1999). Como consecuencia de lo antedicho, las células han desarrollado diversos mecanismos para reducir la toxicidad de los iones de hierro, los cuales incluyen la regulación del transporte del hierro a través de las membranas y la producción de enzimas que eliminan ROS. Sin embargo, un desbalance en estos sistemas, causado por el exceso de hierro, incrementaría la susceptibilidad al daño oxidativo, resultando en un aumento de las mutaciones, pudiendo llevar, entre otros, al desarrollo de procesos neoplásicos (Stevens et al., 1988), diabetes (Salonen et al., 1998), enfermedades cardiovasculares (Salonen et al., 1992) y enfermedades neurológicas (Rogerio Meneghini de Freitas, 2001).

En trabajos donde se evaluó específicamente el efecto del tratamiento terapéutico de la anemia con hierro sobre la oxidación del ADN en niños con ADH, se observó un aumento significativo de fracturas del ADN y bases oxidadas respecto de niños sanos (Aksu et al., 2010). En un trabajo reciente, se demostró que el hierro era uno de los metales de transición que más inducen a la formación de 8-oxo-7,8 dihidro-guanina (8-OHdG), provocando más roturas de doble cadena que de simple cadena (Prá et al., 2012). En ratones a los que se les suministró un tratamiento con sulfato ferroso se observó, en médula ósea, un aumento de la frecuencia de micronúcleos (Mni) (Prá et al., 2008).

A raíz de lo anteriormente expuesto, el objetivo del presente trabajo es analizar in vitro la frecuencia de daño cromosómico provocado por la suplementación de sulfato ferroso en sus dos formas de administración para la prevención de la anemia, diario y semanal, a través del ensayo de micronúcleos por bloqueo de la citocinesis (CBMN).

Se analizaron los resultados de las tres tandas experimentales. En la Tabla 1, se muestran los promedios obtenidos para el IM y para los indicadores analizados con el ensayo CBMN (IDN, MNi, NPBs y NBuds). Los resultados se expresan como media ± desvío estándar.

TABLA 1.
Valores promedio para índice mitótico, índice de división nuclear, micronúcleos, puentes nucleoplásmicos y brotes nucleares

Índice Mitótico (IM), Índice de División Nuclear (IDN), Micronúcleos (MNi), Puentes Nucleoplásmicos (NPBs), Brotes Nucleares (NBuds). Entre paréntesis se indica el desvío estándar. Los grupos que no comparten la misma letra son significativamente diferentes entre sí (ANOVA: p<0,05).

En lo que respecta al índice mitótico, se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre tratamientos con la prueba de ANOVA (F=41,18; p=0,0000). A su vez, se efectuó un análisis por contraste de múltiples rangos en donde se detectaron tres grupos homogéneos. Formando un mismo grupo se encontraron los tratamientos de hierro diario y el control negativo y, en grupos distintos el hierro semanal y el control positivo (Fig. 2a). El tratamiento semanal presentó un índice mitótico significativamente más elevado que el tratamiento diario.

Fig. 2
Gráfico de medias y 95,0 porcentajes de LSD: a) Índice Mitótico, b) Índice de División Nuclear, c) Frecuencia de micronúcleos, d) Frecuencia de puentes nucleoplásmicos, e) Frecuencia de brotes nucleares.

El efecto citotóxico fue evaluado a través del IDN. Se observó una disminución del mismo en los cultivos con tratamiento diario y en el control positivo (Bleomicina). El IDN más elevado se observó en los cultivos correspondientes al control negativo. Se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los grupos (F=4,27; p=0,044). A su vez, para poder observar la homogeneidad al interior de los grupos, se realizó un análisis por contraste de múltiples rangos. El mismo permitió visualizar dos grupos homogéneos, uno de ellos formado por el control negativo, el tratamiento diario y el semanal, y otro sólo con el control positivo. El tratamiento semanal presentó un IDN ligeramente superior al tratamiento diario (Fig. 2b).

Para valorar el daño cromosómico, se contabilizó la frecuencia de MNi, NPBs y NBuds en 1.000 células binucleadas. Las mayores frecuencias de MNi se encontraron en el control positivo y en el tratamiento diario. El análisis por ANOVA simple arrojó diferencias estadísticamente significativas (F=26,69; p=0,0002). A su vez, el análisis por contraste de múltiples rangos separó los datos en 3 grupos. Por un lado, el control negativo y el tratamiento semanal; y en grupos separados el tratamiento diario y el control positivo. Se observó un aumento significativo de micronúcleos en el tratamiento diario respecto del semanal (Fig. 2c). Las frecuencias obtenidas de puentes (NPBs) y brotes (NBuds) fueron, en líneas generales, muy bajas para todos los tratamientos. En el caso de los NPBs se realizó un ANOVA simple el cual no resultó estadísticamente significativo (F=3,698; p=0,0620) (Fig. 2d). En el caso de los NBuds, como los datos no respondían a una distribución normal, se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis. La comparación de a pares de tratamientos resultó estadísticamente significativa (F=8,46296; p=0,0373515) tanto para el control positivo respecto del negativo como para el control positivo respecto del hierro semanal. La comparación entre el resto de los tratamientos no reflejó diferencias significativas (Fig. 2e).

El objetivo del presente trabajo fue comparar la frecuencia in vitro de daño cromosómico provocado por la suplementación de sulfato ferroso diario y semanal. En trabajos previos, donde se evaluaron los parámetros bioquímicos asociados a ambas formas de tratamiento en niños de edad escolar con anemia ferropénica (diario 3mg/kg y semanal 6mg/kg) se observó que ambos tratamientos resultaron igual de eficientes, teniendo el tratamiento semanal menores efectos colaterales y mayor aceptación (Zalles Cueto et al., 2005). A su vez, Viteri et al. (1999) al comparar la eficacia nutricional de la suplementación diaria y semanal con sulfato ferroso en mujeres no embarazadas, observó que el tratamiento semanal no sólo presentó menos efectos adversos que el tratamiento diario, sino también que mantuvo y mejoró el estado nutricional en relación al hierro.

En lo que respecta a los resultados aquí analizados, se observó para el índice mitótico que las frecuencias de metafases en cada tratamiento presentaron variación en la viabilidad celular. De este modo, el tratamiento con hierro semanal obtuvo un aumento significativo de la viabilidad respecto del tratamiento diario. De todos modos, ambos tratamientos mostraron mayor cantidad de metafases que el control negativo, esto podría explicarse por el hecho de que el hierro es un micronutriente necesario para el desarrollo correcto y normal del ciclo celular. El efecto citotóxico también fue evaluado a través del IDN. En este caso, si bien el tratamiento semanal presentó un IDN superior al tratamiento diario, las diferencias no resultaron significativas. Para todos los tipos de tratamientos los valores de índice de división nuclear resultaron bajos con respecto a los publicados por Fenech (2007) para linfocitos humanos. Esto podría deberse al extenso tiempo de cultivo que requiere el protocolo llevado a cabo para evaluar el efecto de ambos tratamientos. Si bien existen ciertas diferencias, en líneas generales, los resultados obtenidos para el IM y el IDN presentan la misma tendencia.

Los resultados arrojados para el ensayo CBMN siguen la tendencia aquí propuesta, ya que el tratamiento con hierro semanal presenta las frecuencias más bajas de micronúcleos, significativamente inferiores a las observadas con el tratamiento diario. Cabe mencionar, que las frecuencias de micronúcleos encontradas en ambos tratamientos con sulfato ferroso se encuentran dentro del rango de normalidad establecido por Fenech (2007) para cultivos de linfocitos de sangre periférica. Dado que ninguno de los tratamientos con sulfato ferroso supera la dosis máxima establecida, era de esperarse que las frecuencias de ambos caigan dentro de los rangos de normalidad. Sin embargo, estos resultados sugieren que el tratamiento semanal produciría un menor daño genómico que el tratamiento establecido actualmente. Si bien es escasa la bibliografía publicada en relación al tratamiento con hierro, Prá et al. (2008) desarrollaron un modelo experimental in vivo en ratones suplementados con sulfato ferroso durante 6 días consecutivos (33,23mg Fe/kg). En este estudio se encontró un aumento estadísticamente significativo en las frecuencias de micronúcleos entre el grupo suplementado respecto del control negativo (agua). A su vez, estos autores (Prá et al., 2011) realizaron un estudio in vivo en niños cuyo objetivo fue evaluar la asociación entre la ingesta real de hierro y el daño genético. Observaron una correlación negativa entre la ingesta de hierro y la frecuencia de micronúcleos. Dicha frecuencia resultó significativamente más baja en aquellos niños cuya ingesta de hierro superaba a los 15mg/d. Por otro lado, Premkumar y Bowlus (2003) analizaron el efecto de la combinación de hierro y ácido ascórbico sobre la genotoxícidad a través del ensayo de micronúcleos en células de medula ósea de ratones. Concluyeron que una dieta con alto contenido en sulfato ferroso incrementa la frecuencia de daño cromosómico in vivo.

Dentro del ensayo de micronúcleos por bloqueo de la citocinesis, también se analizó la presencia de puentes y brotes nucleares. En ambos casos se puede vislumbrar la propensión hacia un menor daño genético con el tratamiento semanal en comparación con el tratamiento diario. Los resultados tanto para los NPBs como para los NBuds se encuentran dentro de lo que Fenech (2007) considera rangos normales de daño genómico.

En líneas generales, la administración de suplementos de sulfato de hierro in vitro en dosis únicas semanales provoca una disminución en el daño genómico. La suplementación semanal permitiría disminuir los efectos adversos y lograr un mayor cumplimiento del tratamiento preventivo. De todos modos, se recomienda realizar estudios complementarios utilizando otras técnicas, como por ejemplo la electroforesis unicelular para evidenciar el daño al ADN y diversas técnicas de estrés oxidativo, así como también la realización de estudios in vivo.

CONICET. Universidad Nacional de La Plata