Efecto inhibidor in vitro del extracto etanólico de propóleo al 15% y 30% frente a cepas de Lactobacillus acidophilus

In vitro Inhibitory effect of ethanolic propolis extract at 15% and 30% against strains of Lactobacillus acidophilus

La caries dental es una enfermedad infecciosa y trans- misible de los dientes (1). Es de origen multifactorial, donde interactúan: la dieta, la microflora (Strepto- coccus mutans y Lactobacillus) y el huésped (diente y la saliva)(2,3,4).Su principal característica es la desintegración de los tejidos calcificados del diente, para lograr esta desintegración, los microorganismos deben metabolizar los carbohidratos fermentables provenientes de la dieta ingerida y como resultado de esta metabolización se obtendrán ácidos que actuarán sobre la superficie dental generando la mencionada desintegración de tejidos(5). Lactobacillus acidophilus es un bacilo anaerobio facultativo o anaerobio estricto (6). Gram Positivo, catalasa negativo, no esporulado, pleomórfico, pero debido a que se dividen en un sólo plano, nunca presentan ramificaciones, suelen aparecer asociados en parejas, cadenas, empalizadas o frecuentemente aislados (7).En cuanto a los cultivos, la temperatura óptima es de 36+/- 1 ºC. Son muy acidogénicos y tolerantes al ácido(8,9), se asocian a las lesiones de caries a nivel de dentina(10), porque pasan a ser continuadores del proceso de caries iniciada por los Streptococcus del grupo mutans (11,12).

El propóleo es una resina natural elaborada por las abejas, cuya función es proteger a la colmena, evitando el crecimiento de bacterias y otros microorganismos patógenos (13). Generalmente es de color amarillo-marrón, pero varía según la zona geográfica (14).

El propóleo se compone aproximadamente de 50% a 55% de resinas y bálsamos, de 30% a 40% de cera, de 10% a 15% de aceites esenciales, de 5% de polen y de 5% de minerales (15,16). En sus componentes podemos mencionar que posee compuestos fenólicos: Flavonoides (17,18). Flavonas, isoflavonas y flavononas en un 50%, las cuales inhiben bacterias (19,20,21) y hongos (22). Siendo atribuido el poder antibacteriano del propóleo a los flavonoides presentes, este varía según la zona de recolección por parte de las abejas (23). Su mecanismo de acción antibacteriano está dado por la inhibición de la división celular, disrupción del ADN, desorganización de la membrana citoplasmática e in- hibición de la síntesis de la pared celular, causando bacteriólisis parcial e inhibiendo la síntesis proteica (24). Por otro lado, Xiao et al., observaron que la formación del biofilm es vital para la progresión de la caries dental, por lo tanto, la inhibición de este factor de riesgo constituiría una alternativa para prevenir esta enfermedad (25). Cayo et al., evaluaron el efecto antibacteriano in vitro del propóleo sobre cultivos de Streptococcusmutans; determinaron que el propóleo a partir de una concentración al 10% fue efectivo ante esta cepa (26).

Actualmente existen colutorios para el control de la placa dental, inhibiendo químicamente la formación o proliferación de esta. La clorhexidina al 0,12% es el agente antimicrobiano más utilizado dada su eficacia en la eliminación de microorganismos cariogenicos(27,28).Sin embargo, la clorhexidina presenta efectos adversos, tales como pigmentación dental de un color amarillo-marrón, cuando su uso sobrepasa los 14 días, sabor metálico, sensación de quemazón e incluso puede generar lesiones descamativas en la mucosa y úlceras en la gíngiva (29,30). Por eso, se hace necesaria la búsqueda e implementación de nue vos agentes antiplaca que controlen y eliminen a los microorganismos causantes de la caries dental.

El presente estudio tuvo por objetivo evaluar el efecto inhibitorio del extracto etanólico de propóleo al 15% y 30% en comparación al gluconato de clorhexidina al 0,12% frente a cepas de Lactobacillus acidophilus.

El presente estudio fue de tipo experimental in vitro, mediante el método de difusión en disco placa, llamada también el método de Kirby-Bauer. Seleccionándose la bacteria asociada a la caries dental Lactobacillus acidophilusde uso comercial, presentación en ampolla y cuya procedencia fue del laboratorio LMB.H COLICHON®. Llevándose a cabo en el la- boratorio de microbiología de la Universidad Privada Norbert Wiener, durante el año 2016. El propóleo fue obtenido bajo el control de calidad de un Químico Farmacéutico - UNMSM, durante el mes marzo del 2016, certificado por Hierbamiel Perú S.A.C. y de procedencia del valle de Oxapampa-Pasco, ubicado a 1814 msnm, luego, el propóleo en estado natural, fue trozado en pedazos pequeños y enseguida se deposi- tó en un envase de vidrio ámbar conteniendo alcohol de 70°, de tal manera que el solvente cubriera todo los fragmentos del propóleo; se dejó en maceración a temperatura ambiente, protegido de toda fuente de luz y con agitación diaria durante una semana, enseguida se filtró (figura 1), luego, se llevó a estufa a 50°C, para evaporación del alcohol 70° y así obtener extractos concentrados de propóleo (figura 2).

Figura 1.

Figura 2.

Las sustancias experimentales obtenidas fueron el extracto etanólico de propóleo al 15% y 30%. Para los controles fueron utilizados el gluconato de clorhexidina al 0,12% como control positivo y alcohol etanólico 70° como control negativo (figura 3).

Figura 3.

La activación de la cepa fue realizada tomando una pequeña cantidad de la misma, contenida en la am- polla, con ayuda de una micropipeta hacia un tubo de ensayo que almacenaba caldo tioglicolato de sodio. Luego se colocó dentro de una jarra de anaerobiosis conjuntamente con un sobre generador de CO . Incubándola a 37°C en la estufa por 48 horas. Poste- riormente para su replicación se realizó un sembrado en una placa petri con agar base sangre y se llevó a la estufa por 48 horas en las mismas condiciones de anaerobiosis. Luego se procedió a la observación del Lactobacillus acidophilus a través de un microscopio óptico a un aumento de 100X (figura 4), después se tomó 4 colonias aisladas de la bacteria con un asa de siembra y se transfirió a un tubo de ensayo con 5ml de caldo de tripticasa de soya, controlando la turbidez del inóculo, hasta obtener la misma que la escala de Mc Farland 0,5. Para su posterior sembrado en las placas.

Figura 4.

La disposición de los antibacterianos en la placa petri se muestra en la figura 6.

Figura 6.

La muestra estuvo conformada por 30 cultivos de Lactobacillus acidophilus (figura 4) en placas petri con agar base sangre y en donde se colocó discos de papel Whatman N° 40 estériles de 4 mm de diámetro, embebidos con 10 uL de extracto etanólico de propóleo al 15% y 30% así como gluconato de clorhexidina 0,12% y alcohol de 70° (figura 5). Bajo condiciones de anaerobiosis a 37 °C dentro de la incubadora.

Figura 5.

Finalmente a las 48 y 72 horas se midieron los respectivos halos de inhibición con el calibrador vernier (pie de rey) y los datos fueron consignados en las fichas de registro.

Para el análisis de los datos, se utilizó el programa estadístico IBM SPSS Statistics versión23. Las prue- bas estadísticas usadas fueron Kolmogorov-Smirnov para determinar la normalidad de las muestras,Wil- coxon para prueba de significancia estadística no paramétrica y la t-Student para prueba de significancia estadística paramétrica, utilizando un nivel de significancia p<0,05.

Los halos de inhibición de los extractos etanólicos de propóleo al 15% y 30% sobre las cepas de Lactobaci- llus acidophilus no presentaron distribución normal; mientras tanto el gluconato de clorhexidina al 0,12% presentó distribución normal, mediante la prueba de Kolmogórov-Smirnov. El extracto etanólico de pro póleo (EEP) al 15% presentó una media de 8,15mm, con una desviación estándar (D.S) 0,63 mm a las 48 horas y una media de 11,40mm, con una D.S de 1,12 mm a las 72 horas, encontrándose una diferencia significativa de p<0,022 para ambas muestras (tabla 1).

Tabla 1.

El EEP al 30% presentó una media de 11,75 mm, con una desviación estándar (D.S) de 0,74mm a las 48 horas y una media de 14,25 milímetros, con una desviación estándar de 0,82 mm a las 72 horas. Encontrándose una diferencia significativa de p<0,011. Para ambas muestras (tabla 2).

Tabla 2.

El gluconato de clorhexidina al 0,12% presentó una media de 6,55 mm, con una desviación estándar (D.S) de 0,15 mm a las 48 horas y una media de 8,00 mm, con una D.S de 0,72 mm a las 72 horas. Encontrándose una diferencia significativa de p<0,051 para ambas muestras (tabla 3).

Tabla 3.

Se usó la prueba de Wilcoxon para muestras inde- pendientes para los extractos etanólicos de propóleo (EEP) al 15%, 30% y prueba T para gluconato de clorhexidina 0,12% a las 48 y 72 horas, hubo diferencia significativa p<0,05 (tabla 4). Observándose la medida de los halos de inhibición por el efecto de los EEP al 15% y 30% comparados con el gluconato de clorhexidina al 0,12% y etanol 70° frente al Lactoba- cillus acidophilus (gráfico 1).

Tabla 4.

Gráfico 1.

En el presente estudio de tipo experimental se buscó evaluar el efecto inhibitorio in vitro del EEP al 15% y 30% sobre cepas de Lactobacillus acidophilus con gluconato de clorhexidina al 0,12%.

Según León et al., los cuales realizaron un estudio sobre el efecto inhibitorio del EEP sobre Candida albicans, Candida glabrata y Candida krusei deter- minando que el extracto etanólico de propóleo al 5% y 25% presento efectividad antifúngica ante Candida glabrata y Candida krusei respectivamente (22).

Díaz et al., demostraron el efecto antibacteriano del EEP al 1%, 5% y 10% frente a cepas de Porphyromonas gingivalis y Fusobacterium nucleatum en compa- ración del gluconato de clorhexidina al 0,2%. Encon- trando que el EEP al 10% presenta mayor actividad antibacteriana que el gluconato de clorhexidina al 0,2% frente a P. Gingivalis (20); por otro lado, Mayta et al., evaluaron el efecto antibacteriano del EEP al 10 y 30%. Sobre cepas de Streptococcus mutans y Staphylococcus aureus. Encontrando que fue menor su efecto inhibitorio que el gluconato de clorhexidina al 0.05%y 0,12% frente a cepas de Streptococcus mutans (21). Este trabajo determinó que el extracto etanólico de propóleo al 30% presentó mayor efecto inhibidor sobre cepas de Staphylococcus aureus en comparación al gluconato de clorhexidina al 0,05%.

Eguizábal et al., realizaron un estudio en el que se usó concentraciones menores demostrando su actividad antimicrobiana del EEP al 0,8%, 20% y 30% en comparación a la clorhexidina al 0,12% frente a cepas de Streptococcus mutans yLactobacillus casei en una muestra de 10 placas para cada cepa, demostrando que a partir de una concentración de 0,8% de EEP ejerce actividad antibacteriana (19). Cayo et al., realizaron un estudio in vitro donde se evaluó el efecto antibacteriano del propóleo frente a cepas de Streptococcus mutans, determinando que a partir de una concentración al 10% de propóleo ejerce acción antibacteriana (26). Sin embargo el estudio de Akca et al., revelaron que el EEP podría ser tan eficaz como la clorhexidina en Bacterias cariogénicas, aunque el efecto bactericida de EEP fue mejor que el de la clorhexidina en L. acidophilus, L. salivarius subsp. salivarius y P. intermedia (31). Estos resultados acerca del EEP en menores concentraciones difieren con nuestro estudio in vitro donde se observó que el EEP al 30% presentó mayor efecto inhibitorio.

El presente trabajo busca brindar una alternativa de solución al problema más prevalente de salud oral del país, que sigue la línea de investigación correspon- diente al uso de los productos naturales, mediante la aplicación de agentes que controlen los factores de riesgo de la caries dental, como el propóleo, aprovechando nuestro recurso natural y su fácil accesibilidad.

En conclusión, la investigación encontró que el extracto etanólico de propóleo al 30% obtuvo mayor efecto inhibitorio in vitro frente a la cepa de Lacto- bacillus acidophilus al cabo de 48 y 72 horas cuando se le comparó con el gluconato de clorhexidina al 0,12%.