Artículo Original
Efecto inhibitorio de la fracción metanólica del propóleo de Oxapampa en diferentes genotipos aislados de Streptococcus mutans en niños con caries*
Inhibitory effect of the methanolic fraction of Oxapampa propolis on different isolated genotypes of Streptococcus mutans in children with caries
Efeito inibitório da fração metanólica da própolis de Oxapampa em diferentes genótipos de Streptococcus mutans isolados de crianças com cárie
Mayra Lizeth Vargas Gil
Pablo Alejandro Millones Gómez
Lidia Yileng Tay Chu Jon
Ana Cecilia Valderrama Negrón
Ingrit Elida Collantes Diaz
Dora Jesús Maurtua Torres dora.maurtua@upch.pe
Efecto inhibitorio de la fracción metanólica del propóleo de Oxapampa en diferentes genotipos aislados de Streptococcus mutans en niños con caries*
Revista Estomatológica Herediana, vol. 34, núm. 4, pp. 307-315, 2024
Universidad Peruana Cayetano Heredia. Facultad de Estomatología
Recepção: 18 Agosto 2022
Aprovação: 03 Outubro 2024
RESUMEN
Objetivo: Determinar el efecto inhibitorio de la fracción metanólica del propóleo de Oxapampa, Perú, en diferentes genotipos de Streptococcus mutans en niños diagnosticados con caries.
Materiales y métodos: Se recolectaron 150 muestras de hisopado oral, las cuales fueron sembradas para el aislamiento de S. mutans y luego identificadas por pruebas bioquímicas de fermentación de carbohidratos, Api 20 Strep (bioMérieux) y PCR convencional. Las 138 cepas aisladas e identificadas de los pacientes y el control de S. mutans ATCC® 25175™ se enfrentaron a la fracción metanólica por el método de difusión en disco, teniendo como control positivo clorhexidina al 0,12 % y control negativo agua Milli-Q y DMSO (1:1).
Resultados: Se encontró que el diámetro de inhibición de las cepas extraídas de los niños diagnosticados con caries frente a la fracción metanólica mostró mayor diámetro (14,13 mm) en relación con la cepa de S. mutans ATCC® 25175™ (10,16 mm) con diferencias estadísticamente significativas. En la genotipificación de las 138 cepas con los diferentes primers específicos (c, e, f y k), se encontró que el 63,77 % pertenecía al genotipo c, el 21,73 % a los genotipos c y e, y el 14,50 % a los genotipos c y f.
Conclusiones: La fracción metanólica del propóleo de Oxapampa presenta actividad inhibitoria en cepas de S. mutans aisladas y genotipificadas en niños diagnosticados con caries. Además, presenta mayor actividad inhibitoria en las cepas obtenidas de los niños en comparación con el S. mutans ATCC® 25175™.
Palabras clave: Streptococcus mutans+ extracto propóleo+ caries dental+ inhibición bacteriana.
ABSTRACT
Objective: To determine the inhibitory effect of the methanolic fraction of propolis from Oxapampa, Peru, on different genotypes of Streptococcus mutans in children diagnosed with caries.
Materials and methods: 150 oral swab samples were collected, seeded for isolation of S. mutans and then identified by biochemical tests of carbohydrate fermentation, Api 20 Strep (bioMérieux) and conventional PCR. The 138 strains isolated and identified from patients and the S. mutans ATCC® 25175™ control were confronted with the methanolic fraction by the disk diffusion method, having as positive control 0.12% chlorhexidine and negative control Milli-Q water and DMSO (1:1).
Results: It was found that the inhibition diameter of the strains extracted from children diagnosed with caries against the methanolic fraction showed greater diameter (14.13 mm) in relation to the strain of S. mutans ATCC® 25175™ (10.16 mm) with statistically significant differences. In the genotyping of the 138 strains with the different specific primers (c, e, f, and k), it was found that 63.77% belonged to genotype c, 21.73% to genotypes c and e, and 14.50% to genotypes c and f.
Conclusions: The methanolic fraction of Oxapampa propolis presents inhibitory activity on S. mutans strains isolated and genotyped in children diagnosed with caries. In addition, it presents greater inhibitory activity in strains obtained from children compared to S. mutans ATCC® 25175™.
Keywords: Streptococcus mutans, propolis extract, dental caries, bacterial inhibition.
RESUMO
Objetivo: Determinar o efeito inibitório da fração metanólica da própolis de Oxapampa, Peru, sobre diferentes genótipos de Streptococcus mutans em crianças com diagnóstico de cárie.
Materiais e métodos: 150 amostras de swab oral foram coletadas, semeadas para isolamento de S. mutans e depois identificadas por testes bioquímicos de fermentação de carboidratos, Api 20 Strep (bioMérieux) e PCR convencional. As 138 cepas isoladas e identificadas dos pacientes e o controle S. mutans ATCC® 25175™ foram desafiados com a fração metanólica pelo método de difusão em disco, tendo clorexidina 0,12 % como controle positivo e água Milli-Q e DMSO (1:1) como controle negativo.
Resultados: Verificou-se que o diâmetro de inibição das cepas extraídas de crianças diagnosticadas com cárie contra a fração metanólica apresentou maior diâmetro (14,13 mm) em relação à cepa S. mutans ATCC® 25175™ (10,16 mm) com diferenças estatisticamente significativas. Na genotipagem das 138 cepas com os diferentes primers específicos (c, e, f e k), verificou-se que 63,77 % pertenciam ao genótipo c, 21,73 % aos genótipos c e e, e 14,50 % aos genótipos c e f.
Conclusões: A fração metanólica da própolis de Oxapampa apresenta atividade inibitória sobre cepas de S. mutans isoladas e genotipadas em crianças diagnosticadas com cárie. Além disso, apresenta maior atividade inibitória em cepas obtidas de crianças em comparação com S. mutans ATCC® 25175™.
Palavras-chave: Streptococcus mutans, extrato de própolis, cárie dentária, inibição bacteriana.
INTRODUCCIÓN
La caries dental es una enfermedad de etiología bacteriana que constituye un problema de salud pública, y que se caracteriza por la destrucción de los tejidos dentales ocasionada por la acción de ácidos producidos por bacterias presentes en la placa dental. Los principales microorganismos implicados son Streptococcus mutans y S. sobrinus, aunque también participan Lactobacillus y Actinomyces. De estos, el primero es el patógeno más asociado a la caries 1, ya que provoca la desmineralización del esmalte dental e incluso, en algunos casos, su pérdida. Esto se da por un desequilibrio en la composición del esmalte dental como consecuencia del metabolismo de los carbohidratos que producen ácidos, así como por la actividad del biofilm bacteriano formado, lo cual causa dolor, infección o pérdida del diente 2-5
El S. mutans es un diplococo Gram positivo, dispuesto en cadena, anaerobio facultativo, catalasa negativo y no móvil. Puede producir ácidos láctico, fórmico y propiónico debido a la fermentación de glucosa, lactosa, sacarosa, rafinosa, manitol, inulina y salicina, lo que reduce el pH de 7 a 4,2 en aproximadamente 24 horas, provocando, a su vez, la desmineralización del esmalte dental 6 En medios de cultivo como el agar mitis salivarius (MRS), enriquecido con bacitracina (200 U/uL), telurito de potasio al 1 % y sacarosa al 10 %, las colonias de S. mutans presentan una morfología mucoide, convexa, con bordes claros y un punto oscuro. Esta especie se ha subclasificado por serología en varios serotipos según sus propiedades inmunológicas y biológicas, siendo los principales los siguientes: c, e, f y k 6,7
Investigaciones sugieren que el serotipo c es el progenitor de S. mutans, mientras que e y f habrían surgido por mutaciones 7). Estos serotipos están compuestos por un esqueleto de ramnosa y cadenas laterales de glucosa 8 Respecto al genotipo k, estudios recientes indican que este se distingue por una notable reducción en la cantidad de cadenas laterales de glucosa, lo que resulta en una menor cariogenicidad debido a alteraciones en varios antígenos proteicos de su superficie 8; además, presenta una mayor supervivencia en la sangre por su menor susceptibilidad a la fagocitosis 9
Por otro lado, el propóleo es una sustancia resinosa y pegajosa de origen natural, recolectada y procesada por las abejas Apis mellifera a partir de exudaciones de árboles y plantas 10 Esta sustancia ha sido ampliamente reconocida por sus propiedades antisépticas, debido a su actividad antibacteriana, antiviral y antifúngica. Su componente activo más destacado, el éster fenetílico del ácido cafeico, es responsable de sus efectos antimicrobianos y antiinflamatorios. Además, presenta propiedades inmunoestimulantes, antialérgicas, remineralizantes y antioxidantes.
Numerosos estudios científicos han identificado más de 100 componentes del propóleo que actúan sinérgicamente, siendo los flavonoides los más relevantes por su actividad biológica y terapéutica 11 Algunos autores sugieren que esta sustancia inhibe la actividad enzimática de diversas proteínas esenciales para el crecimiento y desarrollo de los microorganismos orales responsables de la caries dental, como el S. mutans y, en menor medida, el Lactobacillus acidophilus (12, 13). Además, otras investigaciones han demostrado que el extracto metanólico de canela y clavo de olor posee actividad antibacteriana contra los microorganismos mencionados 14 De manera similar, se observó que la fracción metanólica del propóleo de Oxapampa mostró actividad in vitro contra el biofilm de S. gordonii ATCC® 51656™ y F. nucleatum ATCC® 10953™ 15
En el presente estudio, se propuso determinar el efecto inhibitorio de la fracción metanólica del propóleo de Oxapampa, Perú, en diferentes genotipos de S. mutans aislados de niños con caries dental.
MATERIALES Y MÉTODOS
Este estudio es de tipo experimental in vitro. La recolección de muestras de niños con caries dental fue realizada previa aprobación del Comité Institucional de Ética en Investigación de la Universidad Peruana Cayetano Heredia (CIEI-UPCH), bajo la Constancia n.° 324-13-18 y Código de Inscripción n.° 102214, con fecha 18 de junio de 2018. El tamaño muestral fue calculado utilizando el programa EPIDAT v. 3.1. Se incluyó a 250 niños que asistieron por primera vez al Centro Dental Docente de la UPCH, con un intervalo de confianza del 95 % y una proporción esperada del 70 %.
Se reclutaron 250 niños sin tratamientos previos contra caries. De este grupo, se seleccionaron 150 niños de entre 6 y 12 años, de ambos sexos. A cada uno de ellos se le realizó un hisopado de la mucosa del carrillo y un raspado de la placa dental blanda en una pieza dental afectada por caries (con al menos una lesión), durante el mes de agosto de 2018. Las muestras fueron transportadas en tubos de ensayo que contenían 3 mL de medio tioglicolato (Merck( 108190) al laboratorio de bacteriología de los Laboratorios de Investigación y Desarrollo de la UPCH, donde fueron incubadas a 37 °C durante 48 horas.
Aislamiento e identificación de S. mutans
Se realizó la siembra en agar mitis salivarius (MS) con bacitracina (200 U/μL), telurito al 1 % y sacarosa al 10 % durante 48 horas en condiciones de anaerobiosis a 37 °C. Posteriormente, se buscaron colonias mucoides, convexas, con bordes claros y un punto oscuro, características del S. mutans. Cada colonia fue transferida a un medio agar cerebro-corazón (BHA) e incubada a 37 °C durante 24 horas para su mantenimiento e identificación posterior. La identificación se realizó mediante coloración de Gram, prueba de catalasa y fermentación de carbohidratos, incluyendo sorbitol, manitol, rafinosa y sacarosa. Para confirmar la presencia de S. mutans, se utilizó el sistema de identificación Api20 Strep (bioMérieux(). Las colonias se conservaron en medio de infusión cerebro-corazón (BHI, Merck(). La determinación de los genotipos se realizó mediante PCR convencional, utilizando como cepa control al S. mutans genotipo c (ATCC® 25175™). Para la extracción del ADN genómico se empleó el kit GenElute Bacterial Genomic DNA (Merck(). La identificación de la especie S. mutans se efectuó utilizando primers específicos smut, seguida de la genotipificación mediante los primers c, e, f y k (tabla 1) 16
Las 150 cepas de S. mutans fueron amplificadas utilizando primers smut en un termociclador, bajo un programa de 25 ciclos, que incluyó una desnaturalización a 96 °C durante 15 segundos, hibridación a 61 °C durante 30 segundos y una extensión a 72 °C durante 1 minuto (figura 1) 17
Figura 1
Electroforesis en gel agarosa 1 % de los productos de amplificación con los primers smut. Fragmento de 137 pb.
Para la genotipificación de las cepas, se emplearon los primers c, e y f, que fueron amplificados en el termociclador durante 25 ciclos, con desnaturalización a 96 °C por 15 segundos, hibridación a 61 °C por 30 segundos y extensión a 72 °C por 1 minuto. Para el genotipo k, se realizó un protocolo de 25 ciclos con desnaturalización a 95 °C por 30 segundos, hibridación a 60 °C por 30 segundos y extensión a 72 °C por 30 segundos (figura 2) 18
Figura 2
Electroforesis en agarosa 1 % de los productos de amplificación con los primers c, e, f y k. Fragmento de 727 pb genotipo c, 517 pb genotipo e y 316 pb genotipo f.
Posteriormente, para la determinación de la especie y la genotipificación, los productos de PCR se colocaron en un gel de agarosa al 1 % con buffer tris-acetato-EDTA (TAE 1X), y se realizó una electroforesis a 94 V durante 1 hora. Las bandas se revelaron con bromuro de etidio al 1 % y se visualizaron con un transiluminador UV (modelo High Performance UV Transilluminator TFM-40V), comparándolas con el control. Finalmente, se utilizó 40 mL de la fracción metanólica del propóleo a una concentración de 0,78 mg/mL, proporcionada por el Laboratorio de Bacteriología de la UPCH. Esta fracción fue obtenida mediante la extracción metanólica del propóleo de Oxapampa, en el departamento de Cerro de Pasco, Perú 15
Determinación de la actividad inhibitoria de las cepas genotipificadas de S. mutans
Las cepas genotipificadas y S. mutans ATCC® 25175™ fueron cultivadas en medio BHI durante 24 horas a 37 ºC bajo condiciones de microaerofilia. Se aplicó la prueba de susceptibilidad antibiótica mediante el método de difusión en disco para evaluar la actividad inhibitoria del extracto metanólico de propóleo 19 Las cepas genotipificadas y la cepa S. mutans ATCC® 25175™ se ajustaron a una turbidez equivalente a la escala de McFarland 0.5. Posteriormente, se sembraron en medio BHA (Merck(), y se colocaron discos de papel de filtro de 6 mm (Whatman 3() impregnados con 10 μL de clorhexidina al 0,12 % (control positivo), 10 μL de DMSO y agua Milli-Q (1:1) como control negativo, y 10 μL de la fracción metanólica de propóleo a una concentración de 0,78 mg/mL. Las placas se incubaron a 37 °C durante 48 horas en condiciones de microaerofilia. Finalmente, los halos de inhibición fueron medidos en milímetros (mm) utilizando un vernier calibrado de la marca Truper(.
Análisis estadístico
Los datos obtenidos en la prueba de PCR convencional fueron analizados mediante estadística descriptiva. Los resultados de los halos de inhibición se presentaron en términos de medias, desviaciones estándar y medianas. Se aplicó la prueba t de Student con un nivel de confianza del 95 % (NC = 95%) y un error α = 0,05 para comparar los diferentes serotipos de S. mutans entre la cepa control S. mutans ATCC® 25175™ y las muestras de niños con caries dental.
RESULTADOS
De las 150 muestras recolectadas de los niños diagnosticados con caries, se identificaron 138 cepas de S. mutans a través del primer específico smut (figuras 1 y 2), a las cuales se le realizó la genotipificación con los diferentes primers específicos (c, e, f y k). Se encontró que el 63,77 % pertenecía al genotipo c; el 21,73 %, a los genotipos c y e; y el 14,50 %, a los genotipos c y f, observándose así la presencia de genotipos múltiples y la ausencia del genotipo k (figura 3).
Figura 3
Porcentaje de genotipos individuales y múltiples hallados en el estudio.
En la tabla 2 se muestra el promedio, la desviación estándar y la mediana de los halos de inhibición de S. mutans ATCC® 25175™ y las cepas de los pacientes de niños diagnosticados con caries. Se observa que la fracción metanólica de propóleo responde de manera similar a la clorhexidina frente a las cepas aisladas de S. mutans de los niños con caries. Se encontró, además, que el diámetro de inhibición de las cepas extraídas frente a la fracción metanólica mostró mayor diámetro (14,13 mm) en relación con la cepa de S. mutans ATCC® 25175™ (10,16 mm) con diferencias estadísticamente significativas.
DISCUSIÓN
Diversos estudios han relacionado la caries dental con la presencia de S. mutans (20). Los niños menores de 12 años son los más afectados, en gran parte debido a un mayor consumo de carbohidratos, lo que genera ácidos que pueden provocar caries. Actualmente, diferentes extractos de plantas y productos naturales están siendo investigados para evaluar su efecto inhibitorio sobre el S. mutans, así como su prevalencia y los genotipos circulantes. Entre los genotipos de este microorganismo, destacan los c, e, f y k. En el estudio de Momeni et al. 21 realizado en 129 pacientes, se encontró que los genotipos c y k fueron los más prevalentes, seguidos de los genotipos e y f. Sin embargo, en el presente estudio, cuya muestra estuvo constituida de 138 pacientes menores de 12 años, el genotipo c fue el más frecuente, seguido de los genotipos e y f, mientras que no se detectó el genotipo k. Momeni et al. 21 sugieren que la presencia del genotipo k se relaciona con cepas que contienen proteínas de unión al colágeno (CBP, Cnm y Cbm), las cuales están asociadas con enfermedades sistémicas.
La identificación de la especie S. mutans, empleando PCR convencional en placa dental blanda en carrillo, tuvo una prevalencia de 92,00 % (138 de 150 niños), que fue mayor que la encontrada por Delgadillo et al. 22 en Perú, quienes evidenciaron un 75,60 % (59 de 78 niños) en saliva. Sánchez-Pérez y Acosta 23 en México, hallaron un 32 % en placa dentobacteriana de la fisura; y Arévalo-Ruano et al. 24 en Colombia, obtuvieron una prevalencia del 14,90 % en saliva. Esta diferencia puede deberse a las múltiples técnicas empleadas para el muestreo, aislamiento e identificación, así como también a la alimentación, consumo de antibióticos, lesión cariosa y clasificación de los distintos tipos de caries presentes en los niños.
Diversos estudios manifiestan que el genotipo c de S. mutans es la principal bacteria asociada a caries 7,25,26 lo que concuerda con el hallazgo en el presente estudio; asimismo, otras investigaciones han encontrado genotipos e en un 20 %, f en un 10 % y k en menos del 5 % 27 resultados que coinciden con el presente estudio, que encontró genotipos c y e en un 21,73 %, genotipos f en un 14,50 % y no se evidenció genotipos k. Además, el estudio previamente citado encontró que más de la mitad de una población de 129 niños presentaba genotipos múltiples, siendo los más frecuentes c y k en un 31 %, seguido de c, e y k en un 11 %, y c y e en un 7,75 % 27 coincidiendo con los hallazgos de este trabajo.
Los halos de inhibición generados por la fracción metanólica del propóleo frente a S. mutans mostraron un mayor diámetro en comparación con los observados en la cepa S. mutans ATCC® 25175™. Esto podría atribuirse a las características de la fracción metanólica, ya que, según Galgowski et al. 28 esta fracción podría contener una mayor concentración de compuestos bioactivos no polares con una actividad antimicrobiana superior.
Entre las principales limitaciones de este estudio, se resalta que la genotipificación fue realizada durante el período de pandemia, lo que ocasionó dificultades logísticas con los proveedores debido a la escasez de insumos. Los tiempos de entrega de los pedidos alcanzaron hasta seis meses para su arribo a Perú, lo cual retrasó significativamente el proceso. Asimismo, el aislamiento de S. mutans presentó desafíos adicionales, dado que esta bacteria puede confundirse fácilmente con Streptococcus sobrinus, para lo cual se requirió del uso de técnicas moleculares avanzadas para asegurar una identificación adecuada y precisa.
CONCLUSIONES
La fracción metanólica del propóleo de Oxapampa presenta actividad inhibitoria en cepas de S. mutans aisladas y genotipificadas en niños diagnosticados con caries, de los cuales el 100 % pertenecía al genotipo c, el 21,58 % al genotipo e, y el 14,39 % al genotipo f, no encontrándose el genotipo k. Además, la fracción metanólica del propóleo de Oxapampa presenta mayor actividad inhibitoria en las cepas obtenidas de los niños, en comparación con el S. mutans ATCC® 25175™.
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Notas
Autor notes
Correspondencia: Dora Jesús Maurtua Torres Contacto: dora.maurtua@upch.pe
Declaração de interesses