Este estudio se realizó en la estación experimental del Colegio de Postgraduados, campus Montecillo, estado de México, localizada a 19°29’ N, 98°53’ W y 2 250 msnm. La miel provino de Ecatzingo y Amecameca, estado de México (mieles oscura y clara, respectivamente), y de Jiutepec, estado de Morelos (miel ámbar). Estas poblaciones se conocen por su alta calidad y gran diversidad de mieles de abeja en la región central de México.

La actividad antioxidante (AA) se evaluó por medio de la capacidad captadora de radicales del DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil), de acuerdo con el método de Brand-Williams y col. (1995). Para ello, se mezclaron 2 g de miel con 10 cm³ de metanol (Sigma Aldrich) y se dejó reposar en baño de agua a 30 °C durante 30 min (Baño con agitación, Thermo Fisher Scientific, modelo 2870, Walthman, MA, USA). La mezcla se agitó usando un equipo vortex (Genie 2, Scientific Industries, modelo G560, NY, USA) y se filtró a través de papel filtro Whatman No. 4. Posteriormente, a 1 cm³ del filtrado y a 1 cm³ de agua destilada se les agregaron por separado 3 cm³ de solución de DPPH (0.042 g de DPPH, Sigma Aldrich, más 100 cm³ de metanol), y cada solución se agitó durante 10 s. Estas dos soluciones se denominan DPPH con filtrado y DPPH con agua, respectivamente. Las soluciones se dejaron en la oscuridad a temperatura ambiente por 20 min y se centrifugaron a 2 000 rpm durante 10 min (Centrífuga Clínica serie 428-7181 Damon/IEC, Needham, MA, USA). Finalmente, se midió la absorbancia a 515 nm contra un blanco de metanol (Espectrofotómetro Thermo Fisher Scientific, Modelo Genesis 10S VIS, Madison WI, USA). Todos los reactivos usados fueron grado analítico o grado HPLC (por sus siglas en inglés: High Pressure Liquid Chromatographic). La actividad antioxidante (AA) se calculó como porcentaje de inhibición de la absorbancia del DPPH usando la siguiente ecuación:

AA = (absorbancia del DPPH con agua - absorbancia del DPPH con filtrado) × 100/(absorbancia del DPPH con agua)

La miel de abeja con la mayor actividad antioxidante se empleó para adicionarla a las muestras de carne cruda molida de conejo.

Para obtener la carne de conejo, a fin de elaborar las muestras se obtuvieron aleatoriamente 8 conejos de un lote de 80 (un conejo por jaula de 30 cm de ancho × 60 cm de largo × 40 cm de alto), los que se engordaron con una dieta comercial de 30 d a 69 d de edad. Consumieron alimento y agua ad libitum en comederos de tolva y en bebederos automáticos. Al final del periodo de engorda, los 8 conejos se sacrificaron de acuerdo a la Norma Oficial Mexicana (NOM-033-SAG/ZOO-2014) e inmediatamente las canales se identificaron y almacenaron a 4 °C durante 24 h. Posteriormente, el músculo longissimus dorsi (lomo) se removió de cada canal, se empacó al vacío, y por razones de mercado, se almacenó a - 20 °C. Después de 10 meses de almacenamiento, la carne se descongeló a temperatura ambiente y se molió usando malla de 3.18 mm (Torrey M-12-FS, Monterrey, México). Posteriormente, se prepararon las muestras de carne de conejo adicionando y homogenizando 0 g de miel/100 g de carne molida (control) o 2 g de miel/100 g de carne molida; para cada tratamiento se obtuvieron 32 réplicas (32 muestras de carne con miel y 32 sin miel provenientes de 8 canales diferentes). Finalmente, las muestras se envasaron en bolsas negras de polietileno dentro de un contenedor de polipropileno y se almacenaron a 4 °C durante 0 d, 3 d, 6 d y 9 d. Toda manipulación se realizó con la limpieza y desinfección apropiadas. Las temperaturas de - 20 °C para 10 meses y de 4 °C para 0 d a 9 d de almacenamiento concuerdan con lo recomendado por Agustini y col. (2001) y James y James (2014).

La AA se midió, como en el caso de las mieles, de acuerdo con el método de Brand-Williams y col. (1995). Se usaron 5 g de muestra de carne cruda provenientes de cada una de las muestras de carne molida para el día correspondiente de almacenamiento, mezclando y homogenizando con 5 cm³ de metanol.

El MDA se midió por duplicado de acuerdo a la técnica de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico (TBARS, por sus siglas en inglés: thiobarbituric acid reactive substances), con algunas modificaciones (Shin y col., 2011). Se agregaron 50 cm³ de agua grado HPLC y 0.2 cm³ de solución con 7.2 g/100 cm³ de butilhidroxitolueno (BHT) (0.72 g BHT + 10 cm³ de metanol) a 10 g de muestras de carne cruda. La mezcla se homogenizó usando una licuadora convencional (Sunbeam-Oster, modelo 465-42, 0462-13, Fort Lauderdale, FL) y se dejó reposar en la oscuridad a temperatura ambiente por 15 min. Después, 1 cm³ de esta mezcla se dejó reaccionar con 2 cm³ de una solución 2 M de TBA/TCA o ácido tiobarbitúrico/ácido tricloroacético (0.1154 g de TBA + 40 cm³ de una solución con 15 g de TCA/100 cm³ = 15 cm³ de TCA aforados a 100 cm³ con agua grado HPLC). Los tubos de ensayo se mezclaron con vortex (GENIE2, Scientific Industries, modelo G560, NY, USA) y se incubaron en baño de agua a 50 °C durante 10 min. Inmediatamente después, los tubos se enfriaron y se centrifugaron a 2 000 rpm durante 10 min (Centrífuga Clínica serie 428-7181 Damon/IEC, Needham, MA, USA) y finalmente, la absorbancia del sobrenadante se midió a 530 nm (Espectrofotómetro Thermo Fisher Scientific, Modelo Genesis 10S VIS, Madison WI, USA). Con base en una curva estándar de metoxipropano, el cual se convierte a malondialdehído cuando reacciona con la solución de TBA/TCA, los datos se expresaron como mg de MDA por kg de carne fresca.

Debido a que la formación de MDA es directamente proporcional a la oxidación de lípidos (Velasco y Williams, 2011; El-Gogary y col., 2018), una menor concentración de MDA indica una mayor estabilidad oxidativa.

Los datos de actividad antioxidante de los tipos de miel fueron analizados usando un diseño completamente al azar, con tres tratamientos: miel oscura, ámbar y clara, y una muestra de miel se consideró la unidad experimental que se corrió con 8 repeticiones. Se usó el Paquete estadístico para ciencias sociales (SPSS, por sus siglas en inglés: Statistical Package for the Social Sciences) (SPSS, 2011) versión 8.0, bajo el procedimiento del modelo general lineal.

Los datos de las muestras de carne se analizaron bajo un diseño completamente al azar de 8 tratamientos: 0 g de miel/100 g de carne a 0 d, 3 d, 6 d y 9 d y 2 g de miel/100 g de carne a 0 d, 3 d, 6 d y 9 d de almacenamiento a 4 °C.

Una muestra de carne fue la unidad experimental (32 unidades experimentales con 2 g de miel y 32 con 0 g de miel). En cada muestra de carne se evaluaron AA y MDA por duplicado en el laboratorio, cuyo promedio se asignó a cada unidad experimental.

Todas las comparaciones de medias se realizaron empleando la prueba de Tukey (P < 0.05).

La miel oscura mostró la más alta AA, como porcentaje de inhibición de la absorbancia del DPPH, en comparación con las mieles clara y ámbar (Figura 1).

Figura 1
Actividad antioxidante como porcentaje de inhibición de la absorbancia del radical DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidracil) en tres muestras de miel: obscura, ámbar y clara.
a,b y cLetras distintas indican diferencias significativas (Tukey, P < 0.05). Las barras negras se refieren al error estándar de la media.

Figure 1
Antioxidant activity as inhibition percentage of the DPPH radical (2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl) absorbance in three samples of honey: dark, amber and clear.
a,b and cDifferent letters indicate significant differences (Tukey, P < 0.05). Black bars refer to the standard mean error.

Tanto en la carne control como en aquella con 2 g de miel (Figura 2), al avanzar los días de almacenamiento refrigerado disminuyó la AA.

Figura 2
Actividad antioxidante (AA) en muestras de carne cruda de conejo. Las muestras se prepararon con 0 g de miel/100 g de carne y 2 g de miel oscura de abeja/100 g de carne, y se mantuvieron 0 d, 3 d, 6 d y 9 d a 4 °C hasta su análisis.
^{a,b y c}Letras distintas indican diferencias significativas entre los 8 tratamientos (Tukey, P < 0.05). Las barras negras se refieren al error estándar de la media.

Figure 2
Antioxidant activity (AA) in raw rabbit meat samples. Samples were prepared with 0 g and 2 g of dark bee honey per 100 g meat, and they were kept for 0d, 3d, 6 d and 9d at 4°C until analyzed.
^{a,b and c}Different letters indicate statistically significant differences among the 8 treatments (Tukey, P < 0.05). Black bars refer to the standard mean error.

En la carne con 2 g de miel, que contenía más antioxidantes, la disminución de AA fue menor (P < 0.05) que en la carne control los días 3 y 6. Sin embargo, en el día 9 de almacenamiento, la capacidad antioxidante de la miel disminuyó y las muestras con 2 g de miel mostraron valores similares de AA a las muestras control (Figura 2).

La carne control y las muestras con 2 g de miel presentaron un incremento en la concentración de MDA al avanzar los días de almacenamiento (Figura 3). No obstante, el día 6 se observó una menor concentración de MDA (P < 0.05), estimada en un 25 % menos en la carne con 2 g de miel al compararla con la carne control. Finalmente, la concentración de MDA de la carne control disminuyó significativamente el día 9 de almacenamiento y presentó un valor similar al de la carne con 2 g de miel.

Figura 3
Concentración de malondialdehído (MDA) en muestras de carne cruda de conejo. Las muestras se prepararon con 0 g y 2 g de miel oscura de abeja, y se mantuvieron 0 d, 3 d, 6 d y 9 d a 4 °C hasta su análisis.
^a,b y ^cLetras distintas indican diferencias significativas entre los 8 tratamientos (Tukey, P < 0.05). Las barras negras se refieren al error estándar de la media.

Figure 3
Malondialdehyde (MDA) concentration in raw rabbit meat samples. Samples were prepared with 0 g and 2 g of dark bee honey, and they were kept for 0 d, 3 d, 6 d and 9 d at 4 °C until analyzed.
^a,b and ^cDifferent letters indicate statistically significant differences among the 8 treatments (Tukey, P < 0.05). Black bars refer to the standard error of mean.

La miel contiene compuestos como a-tocoferol, ácido ascórbico, flavonoides y enzimas como catalasa y peroxidasa, que actúan como antioxidantes naturales y son más abundantes en la miel oscura (Alvarez-Suarez y col., 2014). Su contenido y naturaleza dependen de su origen floral (Alvarez-Suarez y col., 2014; Škrovánková y col., 2019). Por ello, las mieles oscuras tienen mayor AA que las claras (Johnston y col., 2005; Can y col., 2015; Srećković y col., 2019). En este estudio la miel oscura produjo 71.75 % de AA (Figura 1), mientras que Dżugan y col. (2018) reportaron 51.39 % a 85.29 % en miel oscura, valores de AA superiores a los de las mieles claras.

En ambos tratamientos (2 g de miel y 0 g de miel), la mayor AA en carne se presentó el día 0 (> 90 %), mientras que la menor (< 55 %) se observó en el día 9 de almacenamiento a 4 °C (Figura 2). Esto se debe a un aumento de radicales libres por oxidación lipídica, que, a su vez, consumen los antioxidantes naturales de la carne (Shahidi y Udaya, 2007; Kumar y col., 2015). Se ha reportado que mientras mayor es el tiempo de refrigeración, menor es la AA de la carne cruda de lomo de conejo. Según Velázquez y col. (2014), del día 0 al 6 de refrigeración la AA de carne de conejo disminuyó de 70 % a 50 % aproximadamente. En este estudio, la AA en el mismo tipo de carne con 0 g de miel, del día 0 al día 6 de refrigeración a 4 °C disminuyó de > 90 % a < 70 %.

La carne con 2 g de miel presentó valores más altos de AA (73.15 % y 88.17 %) que la carne control (56.16 % y 67.58 %) los días 3 y 6 de refrigeración (Figura 2). Esto se atribuye a la alta cantidad de antioxidantes que la carne adquiere de la miel (Nagai y col., 2006). Los resultados concuerdan con lo reportado por Antony y col. (2006), quienes encontraron que la adición de miel a la carne de pechuga de pavos inhibió la formación de compuestos oxidantes. Los valores de AA los días 3 y 6 de almacenamiento indican que las muestras de carne con 2 g de miel estuvieron mejor protegidas contra la oxidación que las del grupo control. Sin embargo, la capacidad antioxidante de la miel disminuyó para el día 9 de refrigeración.

La concentración de MDA aumentó con el tiempo de refrigeración (Figura 3), debido a que los antioxidantes presentes en la carne pierden su capacidad antioxidante y, en consecuencia, se produce MDA (Shahidi y Udaya, 2007). Cuando se inicia la refrigeración a 4 °C los antioxidantes retardan la oxidación, posteriormente se consumen y se produce la oxidación de lípidos (Possamai y col., 2018) y la formación de MDA. Bobko y col. (2019) reportaron en pavos 0.63 mg/kg a 4.7 mg/kg de MDA para 0 d y 14 d de almacenamiento, respectivamente, valores similares a los del presente estudio.

En la carne control la concentración de MDA aumentó del día 3 al día 6 de almacenamiento. En el día 9, disminuyó la concentración de MDA, probablemente debido a la producción de aminoácidos por hidrólisis de las proteínas, los cuales capturan al MDA, formando bases de Schiff (Wazir y col., 2019).

En el caso de la carne con 2 g de miel, este antioxidante natural mantuvo constante la concentración de MDA desde el día 3 al día 9 de almacenamiento en refrigeración a 4 °C. El día 6 de almacenamiento la miel oscura produjo menor concentración de MDA en la carne que en la muestra control (Figura 3). Esto se debe a que el alto contenido de compuestos con actividad antioxidante de la miel (Galano, 2015) ayuda a prevenir la oxidación de ácidos grasos poliinsaturados y la formación de MDA en la carne (Alasnier y col., 2000;Tao, 2015). Por tanto, con base en los valores de MDA el día 6 de almacenamiento, las muestras de carne con 2 g de miel estuvieron mejor protegidas contra la oxidación que las del grupo control.

En lomo de conejo California × Nueva Zelanda se han reportado valores de MDA de 1.6 mg/kg (Velázquez y col., 2014), similares a los del tratamiento con 2 g de miel del presente estudio (Figura 3).

*Correspondencia:eliseososa@yahoo.com.mx