Los reactivos y disolventes utilizados fueron puros para síntesis de las firmas Merck, Panreac y Sigma-Aldrich. El agua utilizada en todos los experimentos fue destilada.

Los espectros infrarrojos con transformada de Fourier (FT-IR) se registraron en un equipo ATI Mattson Genesis Series FTIR. El tamaño (d) y el diámetro hidrodinámico (d_h) de las Gd₂O₃NPs fueron determinados mediante Microscopía Electrónica de Transmisión (TEM) —JEM-1010, JEOL—, y Dispersión Dinámica de la Luz (DLS) —Zetasizer AT, Malvern Panalytical—, respectivamente. La cantidad de materia orgánica en la superficie de las Gd₂O₃NPs se determinó mediante Análisis Termogravimétrico (TGA) —Thermogravimetric Analyzer SF^®, Mettler Toledo, USA—. La determinación del contenido de Gd(III) y la relaxitividad longitudinal (r₁) de las Gd₂O₃NPs se determinaron con un equipo de resonancia magnética SIEMENS Magnetom Allegra 3T.

Para realizar la determinación por RMI de la c(Gd) se digieren las muestras (rel. H₂O₂:HNO₃ 1:2, v/v) y se enrasan a volumen final de 1,5 mL con agua destilada. Las imágenes de RMI se obtuvieron con una secuencia de pulso Recuperación de Inversión Eco de Espín (IR-SE). Los tiempos de repetición (TR) empleados fueron 8 500 y 10 000 ms; el tiempo de eco (TE) 13 ms y los tiempos de inversión (TI) estuvieron entre 23 ms y 6 800 ms. Se emplea el ToolBox de MATLAB “KRelax” (desarrollado en CNEURO y registrado en el CENDA, en donde se procesan las imágenes obtenidas que permiten calcular los valores de intensidad y desviación estándar de la región de interés (ROI) seleccionada. A partir de la curva de relajación longitudinal (Intensidad vs. TI) obtenida, se aplica el algoritmo de Levenberg-Marquardt, y se deducen los valores de T₁ para cada ROI. Asimismo, a partir de la curva de velocidad de relajación longitudinal (R₁= 1/T₁, R₁ vs. c(Gd)) obtenida, se interpolan en ella los valores de R₁ de las muestras analizadas para determinar la c(Gd). La curva de calibración de Gd(III) confeccionada abarcó un intervalo de concentración entre 0 y 2 mmol/L del elemento.

A 10 mL de una dispersión acuosa de Gd₂O₃@PEGdiCOOH₆₀₀NPs se adicionan 5 mL de DMF, y se elimina el agua mediante rotoevaporación. A esta disolución se adicionan, de forma consecutiva, N¹-(2-aminoetil)-N⁴-(1-naftil)succinimida (Amylovis^®-204, 22 mg, 77 μmol), HOBT (25 mg; 0,19 mmol) y EDC (25 mg; 0,13 mmol), previamente disueltos en DMF (850, 500, 1 000 μL, respectivamente). La mezcla se agita durante 24 h. Luego se dializa, ultrafiltra y centrifuga en condiciones similares a las descritas anteriormente. La dispersión acuosa se conserva a 5 ºC.

Los espectros FT-IR de las Gd₂O₃NPs recubiertas con PEGdiCOOH_600Da y conjugadas al Amylovis^®-204 se muestran en la figura 2. Para las Gd₂O₃@PEGdiCOOH₆₀₀NPs, la presencia en el espectro FT-IR (figura 2A) de una banda poco intensa en los 583 cm^-1 se atribuyó a 𝜈_Gd-O, evidenciando la formación del núcleo de óxido metálico. Según los informes de Ahrén y col., ¹⁴ la poca intensidad de la banda se corresponde con Gd₂O₃NPs con tamaños inferiores a los 10 nm. Asimismo, las bandas en 3 447 cm^-1 (𝜈_OH), 2 910-2 875 cm^-1 (𝜈_Csp3-H), 1 456 cm^-1 (δ_CH2) y 1 100 cm^-1 (𝜈^as _COC) se corresponden al polímero tipo PEG que recubre el núcleo de las NPs. La banda en 1 744 cm^-1 (𝜈_C=O) indica la presencia de grupos carboxilos libres.

En la figura 2A, las otras dos señales en el intervalo 1 450-1 650 cm^-1 corresponden a las bandas 𝜈^as _COO ^- (1 633 cm^-1) y 𝜈^s _COO ^- (1 470 cm^-1). Se conoce que los modos de coordinación del grupo carboxilato (COO^-) se definen por la separación (Δ) de estas bandas.^14-15 Esta diferencia en las Gd₂O₃@PEGdiCOOH₆₀₀NPs es de 163 cm^-1. Sobre la base de este valor, el modo de unión de los grupos carboxilato del recubrimiento al núcleo debe ser tipo puente.

Fig. 2

En el caso del espectro FT-IR de las Gd₂O₃@PEGdiCOOH₆₀₀-Amylovis^®-204NPs (figura 2B), las señales del derivado de PEG empleado, también se observan. La señal del grupo carbonilo se desplaza a menores valores de número de onda, de 1 744 cm^-1 (𝜈_C=O, ácido carboxílico) a 1 640 cm^-1 (𝜈_C=O, amida), producto de la conjugación del derivado de naftilo. Las bandas en 3 287 cm^-1 (𝜈_NH), 3 084 cm^-1 y 3 049 cm^-1 (𝜈_Csp2-H), 1 400cm^-1 (𝜈_C-N), 790 cm^-1 (δ_NH) y 770 cm^-1 (γ_CH) se corresponden con el derivado de Amylovis^® empleado.⁹ El desplazamiento de la señal 𝜈_NH, en comparación con el Amylovis^®-204 (3 270 cm^-1), es consecuente con la formación de un enlace amida.¹⁶ Una vez conjugado el Amylovis^®-204 al recubrimiento de las Gd₂O₃@PEGdiCOOH₆₀₀NPs, la estabilidad del sistema coloidal disminuyó, manifestándose en la paulatina precipitación de las NPs. Este proceso ocurre de forma más rápida que en sus análogas sin conjugar, lo cual es indeseado para su aplicación final.

La determinación del diámetro hidrodinámico (d_h) de las Gd₂O₃@PEGdiCOOH₆₀₀NPs se realizó a través del registro de los perfiles de DLS (figura 3A, línea verde oscura). Las NPs pegiladas presentaron un d_h de 174 nm, valor inferior a los 200 nm que se describen en la literatura como el d_h idóneo, para que las NPs atraviesen la BHE. El perfil de DLS de las Gd₂O₃@PEGdiCOOH₆₀₀-Amylovis^®-204NPs (figura 3B, línea verde clara) muestra que su d _h es de 156 nm, valor menor al de las NPs pegiladas. Esta disminución se asocia a la naturaleza hidrofóbica del derivado de Amylovis^® conjugado, lo que limita la cantidad de moléculas de agua que interactúan con la NP. Según experiencias previas descritas en la literatura, ¹² estas NPs presentaron d _h de alrededor de 2,5 µm. Las diferencias de los resultados que se obtienen con aquellas descritas en este trabajo se asociaron, fundamentalmente, a la modificación de la metodología de síntesis y el método de purificación de las Gd₂O₃NPs.

Fig. 3

Por Microscopia Electrónica de Transmisión (TEM), y con el programa ImageJ 1.52a, se determinó el tamaño (d) del núcleo de las Gd₂O₃@PEGdiCOOH₆₀₀NPs (figura 3B), siendo este de 6,0 (± 1,0) nm. El valor de d para las Gd₂O₃NPs pegiladas se corresponde con lo esperado por el análisis del espectro FT-IR de las NPs (menos de 10 nm, baja intensidad de la banda 𝜈_Gd-O). Los valores de d suelen ser menores que los d _h , la diferencia entre ambos se asocia a la posible agregación de las NPs (ver imagen TEM, figura 3B) producto de las interacciones existentes entre las cadenas de PEGdiCOOH que las recubren, y a las interacciones de estas con el disolvente (agua). Estas interacciones pueden ser fundamentalmente del tipo hidrofílicas, producto de las características de los monómeros que conforman la cadena de PEG y la polaridad de sus grupos terminales.

En la figura 4 se observan las curvas correspondientes al Análisis Termogravimétrico (TGA) de las NPs pegiladas y conjugadas con Amylovis^®-204. Las curvas del TGA se caracterizaron por la existencia de una primera etapa, donde se produce una pérdida de masa del 7 %, y 5 % para las Gd₂O₃@PEGdiCOOH₆₀₀NPs y Gd₂O₃@PEGdiCOOH₆₀₀-Amylovis^®-204NPs, respectivamente, lo que corresponde a la eliminación de la humedad de la muestra. El menor grado de hidratación de la segunda muestra se corresponde con la hipótesis empleada para explicar su menor d _h , ya que estas interaccionan en menor medida con las moléculas de agua debido al carácter hidrofóbico del recubrimiento. A continuación, para las NPs funcionalizadas con el PEGdiCOOH_600Da, se produce una pérdida de un 81 % de la masa entre los 200 y 600 ^oC, debido a procesos de desorción y descomposición del recubrimiento orgánico. En el caso de las NPs recubiertas con Amylovis^®-204, la pérdida de masa en este intervalo de temperatura, se corresponde con un 84 %. En ambos gráficos de TGA se aprecia, que luego de los 650 ^oC no existen variaciones significativas de pérdida de masa, lo que se corresponde con el núcleo de las Gd₂O₃NPs.

La existencia de una gran cantidad de recubrimiento en la superficie de las Gd₂O₃NPs es evidente en ambos casos. La cantidad de materia orgánica pudiera ser la causa de la alta agregación que se observa en las imágenes TEM y la marcada diferencia entre los valores de d _h y d. Estos resultados evidencian la necesidad de optimizar los procesos de síntesis (relación PEGdiCOOH/Amylovis^®-204) y purificación (tiempo de centrifugado, volumen de diálisis) de las Gd₂O₃@PEGdiCOOH₆₀₀-Amylovis^®-204NPs.

Fig. 4

La caracterización magnética de los sistemas nanométricos descritos, resulta clave para validar su aplicabilidad como AC para RMI. Las relaxitividades longitudinal y transversal (r₁ y r₂, respectivamente) y su relación (r₂/r₁), constituyen parámetros importantes para la selección del AC adecuado. Los AC T₁ empleados en RMI deben poseer una relación r₂/r₁ cercana a la unidad, buscándose siempre el más alto valor de r₁. Este valor está modulado por la mayor o menor interacción de las moléculas de agua con los iones paramagnéticos Gd(III). Es por ello, que los recubrimientos de estos compuestos deben ser seleccionados de forma adecuada, pues por un lado tienen la función de minimizar la toxicidad del ion; y por otro, no deben afectar el mecanismo de propagación del efecto paramagnético.^17-18

Tabla 1

En este trabajo, los resultados de las mediciones de relaxitividad (tabla 1) confirman las propiedades magnéticas de las Gd₂O₃NPs sintetizadas. Las Gd₂O₃@PEGdiCOOH₆₀₀NPs mostraron valores de r₁ similares a los descritos en la literatura y superiores al del Magnevist^®, complejo de Gd(III) de mayor empleo como AC en la práctica clínica actual. Esto corrobora que las NPs obtenidas fueron capaces de modificar la velocidad de relajación de los protones de las moléculas de agua, medio en el que se realizaron los estudios.

Al comparar los valores de r₁ de las Gd₂O₃NPs pegiladas con los de las Gd₂O₃@PEGdiCOOH₆₀₀-Amylovis^®-204NPs, se observa una disminución de dichos valores. Esto se asocia a la presencia de Amylovis^®-204, cuya naturaleza hidrofóbica dificulta la migración de las moléculas de agua, desde el seno de la disolución a la superficie del núcleo de las Gd₂O₃NPs (figura 5). En el espectro FT-IR de las Gd₂O₃@PEGdiCOOH₆₀₀-Amylovis^®-204NPs (figura 2B) no aparece la señal de vibración 𝜈_C=O del grupo carboxilo(-COOH). Esto indica, que el grado de conjugación fue total; por tanto, es de esperar que en las Gd₂O₃@PEGdiCOOH₆₀₀-Amylovis^®-204NPs no existan grupos -COOH disponibles. Esta cobertura hidrofóbica en las NPs (figura 5) afecta el valor de r₁, el cual disminuye casi cuatro veces respecto a las NPs pegiladas. Una posible solución a esto sería controlar la cantidad de Amylovis^®-204 conjugado a las Gd₂O₃NPs.

Fig. 5

Es conocido, que las NPs con elevados d_h, o la poca estabilidad coloidal (procesos de agregación), generan elevados valores de relaxitividad transversal (r₂). Esto puede propiciar que la relación r₂/r₁ sea superior a la unidad, aspecto no favorable para el desarrollo de ACs T₁ basado en Gd(III). En este trabajo, debido a la poca estabilidad coloidal de las Gd₂O₃@PEGdiCOOH₆₀₀NPs y las Gd₂O₃@PEGdiCOOH₆₀₀-Amylovis^®-204NPs, no fue posible determinar, de forma confiable, los valores de r₂ para los sistemas obtenidos. Sin embargo, los resultados de r₁ son alentadores para el fin planteado. La optimización de la síntesis y purificación de las Gd₂O₃NPs podría permitir la determinación de los valores de r₂, para evaluar así las potencialidades de las Gd₂O₃@PEGdiCOOH₆₀₀-Amylovis^®-204NPs como ACs T1 para la detección in vivo, por RMI, de las PS características de la EA.