Se utilizaron las siguientes variables y niveles:

Sustratos ricos en pectina: Pulpa de café (P) y mesocarpo de naranja (M).

Como invariantes de los experimentos se consideraron las siguientes:

Microorganismo: Se empleó la cepa de levadura Kluyveromyces marxianus CCEBI 2011, suministrada y conservada por la Colección de Cultivos del CEBI, Universidad de Oriente.

Se utilizaron dos réplicas por cada variante y dos controles sin inocular.

La levadura se propagó en frascos cónicos de 250 mL de capacidad, conteniendo 100 mL de medio YPD (extracto de levadura 1 %, peptona 2 %, glucosa 2 %) durante 18 h. Se tomaron entonces 30 mL del cultivo, se centrifugaron (5000 rpm, durante 5 min) y se desechó el sobrenadante. La biomasa se resuspendió en 6 mL de agua destilada estéril, quedando así cinco veces más concentrada que en el cultivo de propagación.

Los ensayos de fermentación se efectuaron en frascos cónicos de 100 mL conteniendo 75 mL (cultivos estáticos) o 25 mL (cultivos agitados) del medio de cultivo basal, a los cuales se añadió el sustrato correspondiente. Los frascos se inocularon e incubaron por 24 h a 32 ºC.

Después de 24 h de fermentación, los cultivos se homogenizaron, se tomaron 10 mL de la suspensión y se centrifugaron a 3000 rpm por 30 min a 4°C. Se llevó el sobrenadante a tubos termorresistentes provistos de tapa con cierre hermético y el sedimento se lavó dos veces con 5 mL de agua destilada, se resuspendió y se homogenizó en 5 mL de agua destilada. Se tomaron tres alícuotas de 1 mL de esta suspensión para la realización del conteo celular. Todos los cultivos se conservaron en congelación (-20 ºC).

Determinación de la concentración de biomasa microbiana

La concentración de biomasa se determinó mediante conteo directo al microscopio óptico (400X) utilizando una cámara de conteo celular Füchs-Rosenthal (altura capilar de 0.2 mm y 1/16 mm. de área del cuadrante). La concentración celular (en cél/mL) se convirtió a concentración másica multiplicando por el factor de conversión 1,41x10-9 mg/cel, determinado experimentalmente en el laboratorio.

Se calculó según la siguiente expresión:

donde

x: biomasa formada

Si: concentración inicial de azúcares reductores

Sf: concentración final de azúcares reductores

Se utilizaron los siguientes métodos:

Determinación de azúcares reductores: Método de Somogyi-Nelson /6/.

Previo a la determinación de la actividad enzimática, el sobrenadante de los cultivos conteniendo la enzima se clarificó mediante precipitación con etanol. Para ello se utilizó 1 mL del sobrenadante del cultivo, se enfrió en baño de hielo y se precipitó con tres volúmenes de etanol absoluto helado. Se homogenizó rápidamente por inversión y se incubó en hielo nuevamente por espacio de 10 minutos. Se centrifugó durante 10 minutos y se desechó el sobrenadante, el precipitado se lavó dos veces con etanol absoluto helado y por último se disolvió en 4 mL de buffer acetato 50 mM (pH 5). Se conservó en congelación (aproximadamente -10 ºC).

Como sustrato para el ensayo enzimático se utilizó ácido poligalacturónico (Sigma) a 5 g·L^-1, en tampón acetato de sodio 50 mM (pH 5). La mezcla de reacción estuvo conformada de 0,1 mL de la enzima y 0,4 mL de sustrato, para un volumen total de 0,5 mL. La reacción se desarrolló por espacio de 10 min a 37 ºC. La actividad enzimática se estimó de la pendiente de la recta de regresión correspondiente a la curva de avance de la reacción enzimática, dada como concentración de extremos reductores vs. Tiempo de reacción. Una unidad de actividad enzimática se definió como la cantidad de enzima que cataliza el incremento del poder reductor de la mezcla de reacción en 1 µmol·min-1, expresado como ácido galacturónico, bajo las condiciones de ensayo especificadas.

El análisis estadístico se realizó con ayuda del paquete estadístico Statgraphics Centurion XV (Stat Point, Inc., USA).

El crecimiento microbiano es un elemento fundamental a considerar en un proceso fermentativo ya que, como consecuencia de él, tiene lugar las transformaciones bioquímicas del sustrato debido a la actividad metabólica de las células microbianas. Este proceso puede ser caracterizado por dos parámetros básicos: uno relacionado con la velocidad a que tiene lugar, que es la velocidad especifica de crecimiento (µ) y otro relacionado con la estequiometria del proceso, o sea, con la eficacia en que es aprovechado el contenido energético del sustrato, que es el rendimiento de crecimiento o rendimiento biomasa/sustrato (Yx/s).

La concentración celular y de biomasa a las 24 h de fermentación fue menor en el residual pulpa de café para los cultivos estáticos (anóxicos), independientemente de la concentración de glucosa inicial en el medio de cultivo (20 ó 100 g/L), no siendo así para el caso de los cultivos agitados, donde la concentración de biomasa fue significativamente superior en los medios con pulpa de café (tabla). Esto sugiere una mayor velocidad de crecimiento de la levadura, en condiciones de oxigenación y en presencia de pulpa de café, lo cual se corresponde con el metabolismo preferentemente respiratorio de la especie Kluyveromyces marxianus 9 y al origen de la cepa utilizada en este estudio, la cual fue aislada de residuales del beneficio húmedo del café, mediante enriquecimiento en presencia de un extracto de pulpa de café 10.

Ver a continuación la figura 1.

Figura 1 Figura 1 1. Rendimiento de biomasa en cultivos agitados (A) y estáticos (E) con mesocarpo de naranja (M) y pulpa de café (P) a concentraciones de glucosa(G) de 20 g/L y 100 g/L

Tabla 1 Tabla 1 Concentración celular y de biomasa en los diferentes medios de fermentación

Para los cultivos estáticos o anóxicos, se obtuvo un menor crecimiento en los medios donde la concentración de glucosa fue de 20 g/L, comparado a los de 100 g/L, en correspondencia con la mayor disponibilidad de la fuente de carbono y energía el medio de cultivo. Este resultado indica que la levadura tolera bien concentraciones de etanol del orden del 4 % (v/v) (considerando un 40 % de rendimiento alcohólico), sin inhibición apreciable del crecimiento. Serrat y col. 11 plantearon la posibilidad de producir concomitantemente alcohol enzima poligalacturonasa con esta levadura, utilizando concentraciones de glucosa de 100 g/L.

Según puede observarse en la figura 1, los cultivos agitados presentan un mayor rendimiento de biomasa, alrededor de 10 veces mayor que el de los cultivos estáticos. Esto se corresponde con la mayor eficiencia energética de los procesos respiratorios con respecto a los fermentativos. Sin embargo, resulta notable que para el caso de los cultivos estáticos en presencia de pulpa de café como sustrato, el rendimiento de biomasa aumenta casi cuatro veces cuando la concentración de glucosa inicial se incrementa de 20 a 100 g/L. Aunque en primera instancia resulta difícil explicar este comportamiento, debido a los múltiples factores que pueden estar implicados, podría suponerse la acumulación intracelular de compuestos energéticos de almacenamiento (p.e, glicógeno) ante el exceso de fuente de carbono y la limitación de fuente de nitrógeno 12 o de sustancias intracelulares con efecto protector, como la trehalosa, ante el incremento de la concentración de etanol en el medio 13.

La concentración de azúcares reductores inicial en los cultivos fue, aproximadamente, un 50 % superior en los medios conteniendo mesocarpo de naranja con respecto a los que contenían pulpa de café (ver figuras 2 y 3). Este incremento es causado por la extracción de azúcares solubles presentes en el mesocarpo durante el proceso de esterilización, lo cual se corresponde con el elevado contenido de azúcares en este material 4.

Figura 2 Figura 2 Concentración de azúcares reductores y neutros en cultivos con pulpa de café (P) y mesocarpo de naranja (M)

Figura 3 Figura 3 Concentración de azúcares reductores y neutros en cultivos con pulpa de café (P) y mesocarpo de naranja (M)

Entre estos azúcares que contribuyen al incremento del poder reductor se encuentran la glucosa y la fructosa, presentes en cantidades importantes 4; también las sustancias pécticas aportan al incremento del poder reductor, aunque en menor grado debido a su elevado grado de polimerización. En todos los cultivos donde la concentración de glucosa fue de 20 g/L, independientemente del nivel de oxigenación, se produjo un consumo casi total de los azúcares reductores inicialmente presentes (figuras 2 y 3). Estos azúcares, constituidos por la glucosa presente en el medio basal y los azúcares incorporados al medio por los sustratos, son utilizados por el microorganismo como fuente de carbono y energía para su crecimiento. Este resultado es importante, desde el punto de vista práctico, pues nos indica la eficacia de proceso fermentativo conducido por K. marxianus CCEBI 2011, que en apenas 24 h agotó la fuente de carbono presente en el medio del cultivo. Esto también se traduce en un impacto ambiental mucho menor de los sustratos fermentados, debido a su bajo contenido de azúcares potencialmente fermentables.

En la figura 2 se presenta la concentración de azúcares reductores y neutros en cultivos con pulpa de café (P) y mesocarpo de naranja (M) a concentraciones de glucosa (G) de 20g/L en cultivos agitados (A) y estáticos (E).

En la figura 3 se presenta la concentración de azúcares reductores y neutros en cultivos con pulpa de café (P) y mesocarpo de naranja (M) a concentraciones de glucosa (G) de 100g/L en cultivos agitados (A) y estáticos (E).

En los cultivos donde está presente el residual de naranja y la concentración de glucosa inicial fue de 20 g/L, se apreció un menor consumo de azúcares y, por ende, la existencia de una mayor cantidad de azúcares neutros residuales con respecto a los medios conteniendo pulpa de café (ver figura 2). Este hecho sugiere la existencia, en el mesocarpo de naranja, de azúcares neutros no asimilables por esta cepa de levadura. El contenido de azúcares neutros residuales fue siempre mayor en los cultivos agitados que en los estáticos, lo que pudiera estar asociado a la síntesis de alguna enzima glucohidrolasa (por ej, endoglucanasas) por la levadura, capaza de hidrolizar los polisacáridos estructurales de los sustratos. En levaduras del género Kluyveromyces ha sido descrita la síntesis de β-(1,3)-glucanasas 14 e inulinasas 15, entre otras.

En el caso de los cultivos estáticos, donde la concentración de glucosa inicial fue de 100 g/L, se apreció un mayor consumo aparente de azúcares reductores y neutros en los medios con mesocarpo de naranja con respecto a los que contenían pulpa de café (figura 3). Este resultado, aparentemente contradictorio con lo observado en los cultivos agitados y en los cultivos estáticos, cuando la concentración de glucosa fue de 20 g/L, podrían ser el resultado de la acción hidrolítica de la poligalacturonasa de la levadura, la cual solo se produce en condiciones de anoxia y en proporción directa con las concentraciones de glucosa en el medio 10. Se conoce también que esta enzima actúa preferentemente sobre pectinas de bajo grado de esterificación 10, como es el caso de la pectina de café 16; de modo, que el elevado contenido de azúcares reductores al final de la fermentación pudiera atribuirse, fundamentalmente, a la existencia de oligómeros pécticos (oligogalacturónidos) en el medio, extraídos de la matriz del sustrato. En tanto, el mayor contenido de azúcares neutros residuales observado en los medios con pulpa de café, se corresponde muy bien con el menor crecimiento de la levadura en este medio (tabla). El sustrato pulpa de café se caracteriza por presentar determinados factores de inhibición del crecimiento microbiano, como la cafeína y el ácido cafeico 17.

Uno de los productos biotecnológicos de mayor significación que puede obtenerse con la levaduras K. marxianus CCEBI 2011 es la enzima endo-poligalacturonasa 18. En este estudio se evalúan las potencialidades de los residuales pulpa de café y mesocarpo de naranja como sustratos para la producción de esta enzima, lo cual resulta de gran interés práctico, por constituir una vía para la valorización de estos residuos. En este estudio se consideró solamente a los cultivos estáticos (anóxicos), pues la levadura K. marxianus CCEBI 2011 solo produce la enzima endopoligacturonasa en ausencia de oxígeno 10.

A continuación la figura 4.

Figura 4 Figura 4 Concentración de sustancias pécticas (como ácidos urónicos totales) y actividad enzimática poligalacturonasa en la fracción líquida de los cultivos

Como puede observarse en la figura 4 (A y B), la producción de la enzima por la levadura, para ambos sustratos, fue mayor cuando la concentración inicial de glucosa fue de 20 g/L, no existiendo diferencia significativas (p<0,05) entre los sustratos. Estos resultados no están en concordancia con el carácter pseudoconstitutivo de la síntesis de esta enzima por esta cepa de levadura 10. Si se tiene en cuenta la complejidad que le confiere al sistema la introducción de sustratos de naturaleza química compleja, como son la pulpa de café y el mesocarpo de naranja, podría suponerse la existencia de factores inhibitorios o inactivantes sobre la enzima producida.

La concentración de sustancias pécticas, expresada como ácidos urónicos totales, fue significativamente mayor en los medios que contienen el residual de naranja con respecto a los que se formularon con la pulpa de café (figura 4, A y B). Esto guarda una estrecha relación con la composición informada para estos sustratos 16, 19, donde al mesocarpo de naranja corresponde una mayor concentración de pectina, lo cual es la base de su empleo como una de las materias primas principales en la obtención de este polisacárido a escala comercial. El microorganismo utilizado en este estudio no consume pectinas ni su monómero, el ácido galacturónico 10, por lo que los valores observados son el resultado del aporte de cada uno de los sustratos al medio.

En los cultivos estáticos se observó un mayor acumulado de sustancias pécticas que en los cultivos agitados, siendo superior cuando la concentración de glucosa fue de 100 g/L. Esto se relaciona con el hecho de que en los cultivos limitados de oxígeno, la levadura excreta la enzima endopoligalacturonasa, siendo mayores los acumulados de enzima a medida que se incrementa la concentración de glucosa en el medio. Es decir, el incremento observado en el contenido de sustancias pécticas en los cultivos estáticos puede atribuirse al rol desempeñado por las enzimas pécticas en la extracción de las pectinas presentes en los sustratos. Debe destacarse que se logran incrementos en el contenido de sustancias pécticas del 33 % (mesocarpo de naranja) y 225 % (pulpa de café) en los cultivos estáticos con respecto a los agitados, como consecuencia de la acción de enzima endopoligalacturonasa. La menor extracción de pectinas en el residual de naranja se corresponde con la naturaleza altamente esterificada de estas pectinas 10.