Se trabaja con un BSCTA con perfil de flujo constante en dos variantes. La variante I es de una sola etapa y es bien conocida. Al tanque se alimenta un flujo constante durante todo el proceso hasta que se llena el volumen efectivo, luego de lo cual se realiza la cosecha del producto. En la variante II el volumen efectivo del biorreactor se divide en dos partes y se aplica una política de alimentación para la primera parte con el fin de maximizar la producción de biomasa, tal como se desprende de ^[18] . Para la otra, cambia la política de alimentación y se persigue maximizar la producción de la proteína. El diseño persigue como objetivo establecer los flujos óptimos para alcanzar la meta de cada etapa.

Se trata del reportado por ^[14] , relacionado con una célula de hibridoma productora de un anticuerpo en producción a escala industrial. Es el mismo proceso analizado en ^[18] .

Se realizó una optimización de ambas variantes, simple etapa y doble etapa, antes de comparar los sistemas de cultivo celular (SCC) estudiados.

El programa MATLAB v.7.01 fue usado como plataforma para la simulación- optimización. La solución de las ecuaciones diferenciales ordinarias del modelo se realizó con la herramienta ode15s, recomendable para sistemas de ecuaciones diferenciales de escalas temporales variables (del tipo stiff en inglés). La optimización fue realizada con la herramienta patternsearch . Esta lleva a cabo un método eficaz de búsqueda directa de la región del óptimo. La programación se realizó según el modelo macroscópico para cada variante y se representaron gráficamente los resultados.

En el caso de la variante de dos etapas, una variable muy importante es la fracción del volumen total del fermentador que sería destinada a cada etapa. Es por eso que se realizó el diseño óptimo de la operación variando la fracción de volumen de la primera etapa en el rango de 0 a 1. La Fig. 3 evidencia que en la mayor parte de su intervalo, el aumento de esta variable produce una dependencia monótona creciente en la productividad. En los extremos, sin embargo, la productividad decrece bruscamente, sobre todo en el extremo superior. Este resultado resultó inicialmente sorprendente.

Fig. 3 Fig. 3 Dependencia de la productividad anual con la fracción de volumen (Variante II).

En busca de evidencias para explicar este comportamiento fue construida la Fig. 4, que contiene los perfiles de concentración de las diferentes variables para una f_V igual a la unidad. Esto quiere decir que la primera etapa fue fed- batch y que la segunda etapa fue discontinua (batch), o sea, no se alimentan nutrientes. Este sería un caso extremo, próximo al estado en el que ocurre la inflexión en los extremos de la Fig. 3, cuando f_V es casi la unidad. Nótese en la Fig. 3 cómo, al comenzar la segunda etapa, las concentraciones de glucosa y glutamina caen bruscamente. En estas condiciones la concentración de biomasa viable es cercana a 1,2 x 10⁶ células/mL, lo que produce una demanda de nutrientes que no se puede satisfacer ante una baja disponibilidad de nutrientes en el tiempo restante. De aquí que los resultados en el extremo derecho de la Fig. 3 se deben al desequilibrio que tal extremo genera entre demanda de nutrientes y su disponibilidad.

En el caso del extremo inferior izquierdo de la Fig. 3, la explicación es semejante y viene dada por el efecto de dilución que se logra en la segunda etapa debido al desequilibrio entre la baja demanda de nutrientes basada en la cantidad mínima de células conseguidas en la primera etapa, debido al pequeño volumen de ésta.

Fig. 4 Fig. 4 Dinámica del SCC semicontinuo de dos etapas (fV = 1).

Al calcular el aumento relativo de la productividad del cultivo en simple y en doble etapa (Fig.5) en función de la fracción de volumen f_V, se observa que para valores menores de 0,53 no se consigue un efecto positivo, o sea, no existe superioridad de la segunda variante.

La pregunta que surge ahora es: ¿cuál sería entonces el nivel óptimo de este factor? El factor socio-económico decide, en última instancia, la decisión que se tome. Hacia el futuro habría que plantearse la solución de este problema teniendo en cuenta la variable costo de producción o alguna otra relacionada con los indicadores de eficiencia de la inversión, si ese fuera el caso.

Fig.5 Fig.5 Dependencia del incremento de la productividad anual con fV (Variante II).

La función objetivo utilizada en este trabajo (productividad volumétrica), aunque tiene una estrecha relación con el desempeño económico del proceso, no siempre coincide con el óptimo de costo mínimo. Los autores consideran que la variable f_V requiere de una función objetivo de costo para una mejor precisión del diseño. Como el alcance de este trabajo solo llega hasta demostrar que hay diferencias entre las variantes de simple y doble etapa, entonces, para los fines de ilustración se escogió un valor de f_V de 80 %. Este valor garantiza una superioridad en productividad de un 30 % de la variante II respecto a la variante I, tal como se ilustra en la Fig.5.

Las condiciones óptimas que se consiguen para f_V=80% junto con los resultados de la variante de simple etapa se muestran en la Tabla 1. Esta tabla muestra las grandes diferencias en los niveles óptimos de C_GA entre ambas variantes y entre la primera y segunda etapa de la variante de doble etapa (variante II).

Tabla 1 Tabla 1 Resultados de la optimización para la variantes de simple y doble con (fV=80%)

Nótese las diferencias en las velocidades de dilución estática de la variante de dos etapas. Estas diferencias se deben a la función objetivo que fue utilizada para diseñarlas. Cuando la función objetivo fue maximizar la productividad de AcM, el valor de D. debe ser 0,13 d^-1, sin importar el tipo de sistema de contacto. Sin embargo, cuando el objetivo es maximizar la productividad en biomasa, D_E debe ser de 0,5 d^-1. Este resultado coincide con las predicciones realizadas por los autores en el trabajo anterior ^[18] : altas velocidades de dilución favorecen la formación de biomasa y bajas favorecerán la producción del AcM.

La Fig. 6 evidencia que en la región cercana al óptimo existe poca sensibilidad de la productividad cuando cambian los valores de las variables estudiadas. Se comporta como si apareciera una saturación del proceso que no produce inhibición, pero que tampoco permite mejorar el desempeño del proceso. Este comportamiento sería muy interesante desde el punto de vista del costo de operación, pues tendería a producir un mínimo a partir del máximo de productividad alcanzado.

Fig. 6 Fig. 6 Dependencia de la productividad de AcM con la velocidad de dilución estática y la concentración de glucosa en la alimentación (variante II).

Los resultados de la simulación del comportamiento de la dinámica del sistema en dos etapas, en las condiciones óptimas (Tabla 1), para una fv de 0,8 (Fig. 7), indican que la concentración de células viables alcanza en la primera etapa un valor de células/mL. Esta concentración, aunque aún baja, cuando se compara con lo alcanzado en la variante de simple etapa resulta superior en un 21,43 %. La concentración del AcM al finalizar el proceso alcanza un nivel de 4,1 g/L. Este valor es un 58 % mayor que el valor máximo alcanzado en la variante de simple etapa, lo que demuestra la mejora lograda con la estrategia de cultivo en doble etapa.

Las concentraciones de glucosa y glutamina se acumulan a más del doble en comparación con la variante de simple etapa, mientras que las de lactato y las de amonio están muy por encima de los rangos reportados en la literatura como nocivos para el crecimiento celular. Estos resultados indican que el cultivo en doble etapa con flujo constante no resuelve tampoco la acumulación de estas sustancias nocivas para la célula. A pesar de esto se logra una mejoría notable del proceso en cuanto a productividad. Estas condiciones de nocividad no provocan un cambio significativo en la sensibilidad del proceso según se observa en la figura 6.

Según se ha reportado ^[18] , las condiciones que favorecen el aumento de la productividad de AcM son aquellas que garantizan que en la primera etapa sea máxima la velocidad específica de crecimiento para elevar la productividad en biomasa y una segunda etapa que tenga alta la concentración de biomasa y baja velocidad específica de crecimiento.

Fig. 7 Fig. 7 Dinámica para la variante II en condiciones óptimas con un fv de 0,8.

La Fig. 8 contiene las evidencias que explican las causas de los mejores resultados obtenidos en la optimización y la coincidencia con lo antes predicho ^[15] . En la variante II, la velocidad específica de crecimiento (Fig. 8A) es superior en su primera etapa, situada entre el tercero y el quinto día, comparada con el sistema de simple etapa (variante I). Esto explica por qué se alcanza una mayor concentración de biomasa en esta primera etapa que la conseguida en todo el sistema de simple etapa.

Al pasar a la segunda fase de la variante II, esta variable cae por debajo de la variante I, produciendo mejores condiciones para producir mayor cantidad de AcM ^[18] . Estas observaciones se reflejan en la velocidad de producción del AcM (Fig. 8 B), que pasa a ser superior en la variante de doble etapa sólo al entrar a su última fase. La velocidad específica de muerte celular (Fig. 8 C) y la velocidad de lisis celular (Fig. 8 D) confirman la particularidad del escenario productivo creado en la variante II, favorable a una mayor productividad en el AcM. En la primera etapa de la variante II ambas variables están por debajo de la variante I, lo que permite lograr el aumento de biomasa y luego en la segunda etapa, estas variables empeoran respecto a la variante I. Este cambio de escenario tiene como causa que el proceso en esta fase ya no prioriza maximizar la biomasa sino la síntesis de AcM. Los resultados indican que el incremento en productividad conseguido es significativo con una modificación tan simple del proceso, consistente en operar con dos flujos en el cultivo fed- batch.

Queda pendiente para próximos trabajos diseñar el proceso de doble etapa pero en operación continua con perfusión.

Fig. 8 Fig. 8 Factores que explican el aumento de la productividad en dos etapas: Var I se refiere al proceso en simple etapa y Var II se refiere al proceso en doble etapa.