Se utilizó la cepa 3166 del hongo Lecanicillium sp. mantenida en el laboratorio de microbiología de la UEB Bioprocesos Cuba 10, ICIDCA. La cepa fue transferida a tubos de cultivo con medio Agar-Papa-Dextrosa e incubada durante 10 días a 28 ( 2 ^ºC para asegurar el crecimiento y esporulación, manteniéndose en refrigeración a 5 ^ºC.

Los experimentos se realizaron en un fermentador Biolafitte de 10 litros de volumen total con 7 litros de volumen efectivo con operación discontinua y con incremento o cultivo por lote alimentado. El medio fue seleccionado de acuerdo a los resultados obtenidos en el diseño factorial desarrollado anteriormente y teniendo en cuenta la disponibilidad de las materias primas, seleccionando el medio número 3.

Para los cultivos discontinuos se fijaron los parámetros de agitación y aireación de acuerdo al procedimiento tecnológico para la producción del hongo Lecanicilliun spp. ^(9,7 Las condiciones de operación fueron las siguientes:

Aireación: 0,7 vvm

Agitación: 300 rpm, para el modo de lotes incrementados se aumentó a 400 rpm después del segundo incremento.

pH: el pH inicial fue ajustado a 8,5 utilizando NaOH 2 mol L^-1 y durante la fermentación se ajustó cuando estuvo por debajo de 5,0

Temperatura: 28 ± 2 ºC

Densidad de inóculo: 10%, a una concentración inicial de 10⁶ esporas mL^-1

Los cultivos por lote alimentado se realizaron mediante 2 incrementos en la fase de crecimiento exponencial, específicamente a las horas 16 y 24 de cultivo, debido a que las concentraciones de aminoácidos aportados por la bactopeptona pudieran actuar como represores de la síntesis de proteasas. Se propuso evaluar la siguiente estrategia: preparar el medio inicial a una concentración de 7 g.L^-1 de bactopeptona, el primer incremento 5 g.L^-1 de sacarosa y 5 g.L^-1 de bactopeptona y el segundo incremento con 5 g.L^-1 de bactopeptona.

Debido a la importante participación de las proteasas alcalinas en la efectividad del NEMACID^® sobre el control de nemátodos fitopatógenos formadores de agallas Meloidogyne sp. se procedió a estudiar diferentes alternativas en la producción de estas enzimas.

En un primer estudio se evaluó el crecimiento del hongo Lecanicillium sp. utilizando diferentes valores de pH inicial, como uno de los factores ambientales de mayor incidencia en la producción de proteasas alcalinas, los resultados se muestran en la tabla 3.

Tabla 3.

SD: Desviación estándar

Act. Prot: actividad proteolítica

MSG: materia seca gravimétrica

Letras iguales indican que no hay diferencias significativas para un 95% de confianza.

Letras diferentes indican que hay diferencias significativas para un 95% de confianza.

El análisis de varianza por ANOVA arrojó, de forma general, que las condiciones de pH inicial afectan significativamente los cultivos de Lecanicillium sp. no obstante, el conteo de viables se mantiene en el orden de titulación de 10⁸ esporas totales mL^-1, similares a los obtenidos bajo las condiciones de pH= 6,5, pH óptimo reportado para el crecimiento de este hongo. En cuanto a la producción de biomasa, se observa una disminución de la MSG con el aumento del pH, similar comportamiento presenta el rendimiento biomasa/sustrato, sin embargo, la actividad proteolítica de los filtrados aumenta con el incremento del pH inicial del cultivo, estos resultados evidencian que las condiciones de pH evaluadas inclinan el proceso de fermentación a la formación de producto y no a la producción de biomasa, por tanto, el pH es considerado un factor ambiental que influye en la producción de las proteasas alcalinas por el hongo Lecanicillium sp. Comportamientos similares han sido obtenidos utilizando diferentes microorganismos.^10,11,12

Teniendo en cuenta los resultados obtenidos, se propuso establecer un pH inicial de 8,5 en las experiencias posteriores, ya que bajo estas condiciones se logra incrementar la actividad enzimática con un buen crecimiento del hongo. Es importante destacar que, aunque en este trabajo no es objetivo alcanzar altos niveles de crecimiento del hongo Lecanicillium sp, se considera necesario mantener una buena producción del mismo ya que constituye el principio activo del VERTICID®, utilizado eficientemente en el control biológico.

En la figura 1 se muestra la influencia del pH inicial de los cultivos con la cinética de actividad enzimática de los filtrados de Lecanicillium sp. durante 72 horas de fermentación. Como se puede observar en la figura, la mayor actividad proteolítica se obtiene en el intervalo de tiempo entre 32 y 48 horas de fermentación, mostrándose cinéticas similares para todos los casos, el aumento en la actividad enzimática se sugiere como consecuencia de una mayor producción de proteasas alcalinas. Comportamientos similares fueron obtenidos por otros autores ⁸ con otros géneros de hongos entomopatógenos, utilizando también medios con melaza de caña, con la diferencia que, bajo estas condiciones de pH inicial, se logra la máxima producción enzimática seis horas antes, incrementándose la productividad del proceso en un 33%.

Fig. 1.

Diseño de un medio de cultivo para la producción de proteasas alcalinas por el hongo Lecanicillium sp.

En la tabla 4 se muestran los resultados obtenidos de las variables evaluadas en los experimentos realizados en el diseño factorial 2³.

Tabla 4.

Teniendo en cuenta que el objetivo perseguido en el diseño del plan factorial es obtener altas concentraciones de actividad proteolítica, se puede apreciar en la tabla que los mejores resultados se obtienen en la corrida No. 5, cuando se utiliza una relación C/N=1, almidón como fuente de carbono y harina de soya como fuente de nitrógeno, lográndose una actividad proteolítica de 0,24 mg mL^-1.

Para la variable respuesta Actividad Proteolítica como parámetro de mayor interés en el estudio, se construyó el grafico de Pareto el cual se muestra en la figura 2, apreciándose el orden de significación de los factores analizados.

Fig. 2.

El gráfico indica que la relación C/N y la fuente de nitrógeno son los factores que mayor nivel de significación tienen sobre la producción de la enzima, estos resultados corroboran los obtenidos en estudios realizados con diferentes microorganismos en la producción de proteasas alcalinas.^13,14,15,16 Otros autores obtuvieron las mejores concentraciones utilizando similar relación C/N con diferentes cepas de Bacillus.^17,18 Por otro lado, se puede observar que también son significativas, pero en un menor grado las interacciones fuente de nitrógeno y fuente de carbono, y la relación C/N y fuente de nitrógeno. En estudios realizados con cinco aislados de Lecanicillium sp, se plantea la ausencia de represión en la biosíntesis de enzimas proteolíticas por el uso de diferentes fuentes hidrocarbonadas.¹⁹ Además, del gráfico se infiere, que la producción de enzimas proteolíticas se favorece con la utilización de la Relación C/N=1 y el uso de harina de soya como fuente de nitrógeno de acuerdo al diseño desarrollado. Se muestra que la actividad enzimática presenta tendencia al incremento cuando se emplea la relación C/N=3 con bactopeptona como fuente de nitrógeno en el medio.

En la figura 3 se muestra el estimado de la superficie de respuesta del modelo. Se puede observar que la respuesta aumenta a medida que disminuye la relación C/N, obteniéndose un pico bien pronunciado hacia esta respuesta y un comportamiento más ligero hacia el uso de diferentes fuentes de nitrógeno, siendo estos factores los que más influyen en la actividad proteolítica.

Para el conteo de viables el análisis de Pareto muestra (figura 4) el nivel de significación de los factores evaluados. Se observa que la fuente de nitrógeno, la fuente de carbono y la interacción entre ellos, son los factores de mayor significación sobre el conteo de viables y en un menor grado de significación la interacción relación C/N y fuente de carbono. De acuerdo al diseño utilizado, el conteo de viables se incrementa con la utilización de bactopeptona como fuente de nitrógeno y de almidón como fuente de carbono en los cultivos del hongo Lecanicillium sp. Se observa, además, que la relación C/N utilizada en el diseño no es significativa para la viabilidad del microorganismo.

Fig. 3.

Fig. 4.

El gráfico de Pareto presentado en la figura 5 muestra los niveles de significación de los factores evaluados sobre el pH final de los cultivos. Se puede observar en el gráfico que todos los factores evaluados resultan significativos sobre el pH final de los cultivos, no resultando significativa la interacción relación C/N con la fuente de carbono. El efecto de los factores estudiados presenta un orden de significación sobre el pH final de los cultivos muy similar al observado para la actividad proteolítica, lo cual pudiera evidenciar una relación directa entre estas variables de respuesta. Además, se observa similar tendencia en el gráfico de respuesta de la figura 6 .

Fig. 5.

Del gráfico se interpreta también que el empleo de una relación C/N = 1, el uso harina de soya como fuente de nitrógeno y sacarosa como fuente de carbono, así como la combinación de bactopectona como fuente de nitrógeno y la relación de C/N = 3 favorece el incremento del pH final de los cultivos del hongo Lecanicillium spp.

Fig. 6.

De forma general, el análisis estadístico del plan factorial evidenció que los factores de mayor significación sobre la actividad proteolítica, como expresión de la producción de proteasas alcalinas por el hongo Lecanicillium sp, fueron la relación C/N y la fuente de nitrógeno, estos mismos factores favorecen el incremento del pH final del cultivo, lo cual sugiere que existe una correspondencia de la presencia de proteasas alcalinas con valores alcalinos de pH. Es importante destacar que con el uso de este medio (No. 5) el pH presenta muy poca variación durante el proceso de fermentación, manteniéndose en el intervalo de valores alcalinos.

En cuanto al conteo de viables, el obtenido con el medio No.5 se considera bajo, evidenciándose que los factores estudiados han favorecido la producción de enzimas y no el crecimiento del hongo. Las observaciones directas del cultivo (imágenes no mostradas) demostraron que bajo estas condiciones se favorece la formación de micelios y no la formación de esporas (blastosporas y conidios), comportamiento que debe estar asociado al polimorfismo que presenta este hongo en diferentes condiciones de cultivo, lo cual pudiera tener influencia sobre la producción de estas enzimas, como ha sido reportado con el hongo B. bassiana, lográndose la mayor producción de proteasas extracelulares en medio semilíquido, cuando es favorecido el crecimiento en forma de micelio.¹³ En contraste, con el hongo Fusarium sp. 5-128 se obtuvieron los mejores resultados cuando las condiciones del medio fueron propicias para la formación de esporas.¹¹

El estudio realizado ha permitido evaluar las potencialidades que presenta la cepa 3166 de Lecanicillium spp. para la producción de proteasas alcalinas, utilizando un medio de cultivo sintético. Sin embargo, se considera necesario evaluar alternativas que permitan obtener formulaciones de medios de cultivo de mayor disponibilidad industrial, teniendo en cuenta estos aspectos y los resultados obtenidos con medio utilizando sacarosa como fuente de carbono, se seleccionó el medio No. 3 para los estudios a nivel de fermentador.

En la tabla 5 se muestran los resultados obtenidos utilizando el medio constituido por sacarosa como fuente de carbono, bactopeptona como fuente de nitrógeno, utilizando una relación C/N=1. Se puede observar, que las condiciones de operación establecidas de agitación y aireación a nivel de fermentador favorecieron la producción de proteasas alcalinas, obteniéndose en el cultivo discontinuo una actividad proteolítica máxima de 0,35 mg.mL^-1, lo cual supera lo obtenido en condiciones de zaranda. Esto pudiera estar asociado a que en el biorreactor se tiene una mejor transferencia de oxígeno facilitando un mejor crecimiento del hongo.

Estos resultados se comparan con las experiencias realizadas con P. lilacinus y P. fumosoroseus,⁸ así como con 8Bacillus subtilis.²⁰ La cinética obtenida se muestra en la figura 7 (a), mostrando que bajo estas condiciones se alcanza la mayor producción de proteasas alcalinas a las 32 horas de cultivo, al final de la etapa logarítmica del crecimiento microbiano, durante esta fase exponencial ocurre la mayor producción específica, disminuyendo ligeramente en la fase estacionaria, resultados que ratifican lo reportado para el hongo Metarirhizium anisoplae, utilizando caseína y glucosa como fuentes de carbono.²¹

Tabla 5.

Las experiencias con cultivos incrementado se realizaron con dos incrementos utilizando niveles de agitación variables, evaluándose una agitación de 300 min^-1 y 400 min^-1 después del segundo incremento, debido a que las condiciones de estudio propician cambios de las características reológicas del sistema durante la fermentación, los resultados mostrados en la tabla 6 evidencian que los niveles de agitación utilizados no producen efectos cortantes importantes sobre el hongo, obteniéndose un conteo de viables de 8,7.10⁸ UFC.mL^-1.

Fig. 7.

Los niveles de agitación variables fueron establecidos también en el procedimiento de producción de este hongo para la obtención de VERTICID®, lográndose resultados satisfactorios.^7,9 Con la estrategia de incremento establecida se logra aumentar la productividad del sistema en un 45%, incrementándose la actividad proteolítica hasta valores de 0,52 mg.mL^-1 en 24 horas de cultivo. Los resultados alcanzados se consideran muy atractivos cuando se comparan con lo reportado en cultivo incrementado con Bacillus sphaericus, el cual es un superproductor de proteasa alcalina extracelular, obteniéndose similar resultado en la actividad proteolítica.²² Por otro lado, el rendimiento biomasa/sustrato Y(x/s) no varía significativamente, demostrándose que la estrategia al utilizar el modo de operación incrementado sigue favoreciendo la producción de enzima y no la producción de biomasa.

La cinética obtenida utilizando el cultivo incrementado se muestra en la figura 7(b), observándose un pico bien definido en la actividad proteolítica después de la primera alimentación, encontrándose en plena fase logarítmica de crecimiento, manteniéndose la mayor producción específica en esta fase, después del segundo incremento se observa un ligero aumento en la producción, encontrándose el cultivo en fase de crecimiento estacionario.