Para el estudio de estabilidad en el tiempo del medio (evaluación del rendimiento microbiológico) se emplearon cuatro cepas microbianas de referencia de la American Type Culture Collection (ATCC): Salmonella Typhimurium 14028, Salmonella Enteritidis 13076, Shigella sonnei 25931 y Shigella flexneri 12028, procedentes del cepario central del BioCen.

Se utilizó el caldo triptona soya (CTS) (BioCen, Cuba) como medio de enriquecimiento para la preparación del inóculo de los microorganismos utilizados en el ensayo, y el agar triptona soya (ATS) (BioCen, Cuba) para la siembra de las suspensiones bacterianas con el objetivo de cuantificar la promoción, mantenimiento o inhibición del crecimiento. Se empleó el MTCB de OXOID (Inglaterra) como control. Los medios fueron preparados según las especificaciones del fabricante.

Se prepararon soluciones de ambas sales (Na₂HPO₄: 8 g/100 mL y CaCl₂: 100 g/100 mL), según estudios de solubilidad en agua, a partir de los datos disponibles en catálogos y especificaciones de estos reactivos. Se sometieron a distintas temperaturas de trabajo (25 y 70 ºC) y se comprobó la velocidad de dilución según el tiempo. Se determinaron las características organolépticas de la solución en cuanto a transparencia del líquido, presencia de precipitado y cristales y desprendimiento o no de calor.

Se confeccionaron ocho variantes que evaluaron los parámetros definidos como factores que inciden sobre la solubilidad de ambas sales. Tanto el Na₂HPO₄ como CaCl₂ se emplearon según su concentración en la formulación del producto final (1,1 g/L y 0,09 g/L respectivamente) (tabla 2).

Tabla 2 *: Se utilizó 1,1 g/L de Na₂HPO₄ y 0,09 g/L de CaCl₂ para la preparación de ambas soluciones de las sales

Se empleó un baño termostatado (ThermoHaake) y un termómetro de 100 °C (B & C), ambos de procedencia alemana, para lograr una temperatura de trabajo controlada.

Para la determinación del pH se utilizó un pH-metro de superficie (MeterLab, Francia).

Se determinó la cantidad de ambas sales para producir 9 kg y la concentración final de sólidos disueltos según el volumen de agua empleado. Para la mezcla de las mismas se definió el orden de cada una y la temperatura de trabajo para lograr la homogeneidad de la disolución concentrada de ambas sales. La mezcla se filtró en dos ocasiones y se deshidrató por aspersión en un equipo Niro Atomizer (Dinamarca) con una temperatura del aire a la entrada de la cámara de 120 ^oC y a la salida de 72 ^oC. El producto obtenido constituyó el producto intermedio para la confección del MTCB.

Se agregó 50 L de agua desionizada en un tanque de acero inoxidable (100 L de capacidad), a una temperatura de 60 ºC. Se adicionó, 8,332 Kg de Na₂HPO₄, se homogeneizó la solución con agitación constante hasta disolución completa de la sal y se dejó disminuir la temperatura hasta 25 ± 2 ºC. Se preparó la solución de CaCl₂, agregando 1,365 kg en una cubeta de acero inoxidable (10 L de capacidad) que contenía 5 L de agua desionizada a temperatura ambiente (25 ± 2 ºC).

Ambas sales se pesaron en balanza técnica (Sartorius, Alemania) y se disolvieron en agua, por separado. Las disoluciones se homogeneizaron con la ayuda de un electro agitador portátil (IKA, Alemania).

Se agregó la solución de CaCl₂ sobre la solución de Na₂HPO₄ contenida en el tanque de acero inoxidable, de manera gradual, bajo agitación constante (a 1000 rpm) con ayuda de un electroagitador (ANTICO OLINDO E CESARE, Italia), durante 20 minutos a temperatura ambiente. La mezcla se mantuvo en reposo por 1 h.

Se procedió a filtrar dos veces la mezcla de sales por filtración intermitente, en un filtro prensa (SENorion, Alemania) con un grupo de seis placas filtrantes SA-395 y a una presión de 0,5 kgf/cm², en cada proceso. El líquido se recuperó en un contenedor de acero inoxidable de 100 L, se midió el índice de refracción con un refractómetro (Atago, Japón) a temperatura de 25 a 30 ºC y se determinó la transparencia de la solución por el método de la observación visual.

La mezcla filtrada se pesó en una balanza técnica (Sartorius, Alemania) y se pasó a la máquina de secado por aspersión (NiroAtomyzer, Dinamarca) con capacidad para 33 kg. Se secó por espacio de 1 h, a una temperatura de entrada de aire en el equipo de 120 ºC y de salida de 72 ºC. El polvo resultante (producto intermedio) se pesó y se depositó en bolsas de nylon selladas herméticamente.

Se realizó la evaluación de las características fisicoquímicas y organolépticas al producto intermedio (Base de sales para MTCB, ESP 1449) de manera paralela, en los laboratorios de investigaciones de Medios de Cultivo y de Control de Calidad de BioCen (tabla 3), cuyo Sistema de Calidad está certificado por las ISO 9001:2015, por la compañía británica Lloyd’s Register Quality Assurance y la Oficina Nacional de Normalización (ONN) de Cuba.

Tabla 3 * Se pesan 0,12 g de la base de medio en 100 mL de agua destilada o desionizada

Se empleó el método gravimétrico descrito por la Farmacopea de los Estados Unidos, ⁷ depositando el polvo del producto intermedio en pesa filtros de porcelana. El secado de ambos materiales se realizó en una estufa (Heraeus, Alemania) al vacío (Ecuación 2).

donde:

PD: pérdida por desecación.

A: pesa filtro con muestra.

B: peso de la muestra.

C: pesa filtro vacío.

Se observó alta solubilidad en agua del CaCl₂ (100 g/100 mL) y baja disolución de Na₂HPO₄ (8 g/100 mL) a temperatura ambiente (entre 25 y 30 ºC). Se evidenció el doble de la solubilidad, y aumento de la velocidad de dilución, al elevar la temperatura (> 70 ºC), en todas las variantes de las soluciones de sales. Se determinó que el Na₂HPO₄ demora en disolverse totalmente, en ambas temperaturas de trabajo, en comparación con CaCl₂. En ambas sales, preparadas de manera independiente, se observó desprendimiento de energía en forma de calor y no se evidenció producción de precipitado al final de la reacción (tabla 4).

Los resultados en esta etapa demuestran las diferencias en la solubilidad de las sales en estudio. Estudios realizados por Barros y colaboradores en el 2009 ⁸ refieren que el CaCl₂ es una sal totalmente soluble en agua, en comparación con el Na₂HPO₄.

Tabla 4 ST. Amb: solución sometida a temperatura ambiente; SAT: solución sometida a altas temperaturas; *: concentración de 100 g/100 mL; **: concentración de 8 g/100 mL; a: dilución rápida; b: dilución lenta; c: dilución muy rápida; AP: ausencia de precipitado; DC: desprendimiento de calor; Pr: principio de la reacción;

PC: presencia de cristales; Fr: final de la reacción.

Se comprobó que las temperaturas de trabajo no influyen significativamente sobre la solución de CaCl₂, la cual no muestra variabilidad en sus características físicas, aunque se logra obtener la solubilidad en menor tiempo a temperaturas superiores.

En el caso de la solución de Na₂HPO₄ se logra mayor solubilidad a mayor temperatura que la ambiente.

Para el empleo de ambas sales en la elaboración del producto intermedio, que garantizara la producción de 9 kg de MTCB, es necesario disminuir la concentración de Na₂HPO₄. Lo anterior responde a lo que plantean distintos autores, que a mayor concentración de esta sustancia en una mezcla con una solución de CaCl₂, mayor será la formación de Ca₃(PO₄)₂. Esta sal es un compuesto muy poco soluble, con una Kps de 2.83 x 10^-30. ⁹ Es resultado de la reacción del Na₂HPO₄ y el CaCl₂ en una disolución, que por ser poco soluble en agua, precipita. ⁴

Se observó menor opalescencia, formación de precipitado, y cristales salinos en la mezcla de las soluciones de CaCl₂ y Na₂HPO₄ sometida a temperaturas entre 3 a 8 °C con respecto a las mezclas de las sales a temperatura ambiente (28 °C) y por encima de los 70 °C. Se evidenció mayor incompatibilidad de las sales a medida que la disolución era sometida a temperaturas superiores.

Resultados similares obtuvo Sinitsyna y colaboradores en el 2005 ¹⁰ cuando demostraron que las temperaturas altas disminuyeron la solubilidad del Ca₃(PO₄)₂, evidenciado en una mayor formación de precipitado. Lo anterior se justifica en que a medida que la temperatura aumenta, se produce una mayor disociación del ión Ca, por lo que se encuentra más disponible para unirse al fosfato, aumentando la velocidad de reacción y produciendo la precipitación del Ca₃(PO₄)_2.^11-14

La mezcla de sales sometida a un pH entre 4 y 5 no reveló opalescencia, precipitado ni formación de cristales salinos. Similares resultados se obtuvieron con la disolución a pH entre 6 y 7, solo que en este caso se evidenció leve opalescencia del sobrenadante. La mezcla sometida a pH alcalino (8-9) mostró marcada incompatibilidad entre ambas soluciones con una evidente opalescencia del sobrenadante y formación de precipitado depositado en forma de sedimento en el fondo del recipiente.

Estos resultados coinciden con lo reportado por diferentes autores que plantean que un pH en 6,5 de la disolución, disminuye la precipitación del Ca₃(PO₄)₂^15,16 y que a pH más ácidos (<5) la estabilidad del Ca con las sales inorgánicas de PO₄ es mayor ¹¹, y por tanto se incrementa la solubilidad ^9,17. Otros investigadores explican que un aumento del pH disminuye la solubilidad del Ca y el P, ya que habría mayor disponibilidad de H₂PO4, por lo que aumenta la probabilidad de precipitación con el Ca. ^{10,11,12,18,19}

Se observó mayor opalescencia y formación de precipitado al añadir la solución de Na₂HPO₄ sobre la solución de CaCl₂, que realizando la operación inversa. En este otro aspecto, la investigación coincide con la literatura consultada, que refiere no añadir el PO₄ y el Ca de manera secuencial, además de que aconseja realizar la mezcla de ambas sales añadiendo de manera primaria la sal PO₄, después los otros elementos de la formulación y por último el Ca, siempre agregándolo de manera suave para evitar precipitación local. ^11,20

En el caso del estudio realizado no se añadieron en el producto intermedio, el C₂H₃NaO₂S y el NaCl, los cuales podrían ser los microelementos claves para evitar la formación de precipitado, o al menos atenuar en gran medida su aparición en la disolución.

Los resultados en esta etapa de trabajo demostraron que la concentración de ambas sales, la temperatura, el tiempo, el pH y la presencia de otros elementos en la mezcla, son factores que influyen en la solubilidad del Ca en presencia de las sales inorgánicas de PO₄. Esta conclusión fue clave para la determinación de la metodología a emplear y los indicadores a tener en cuenta en cada paso de los procedimientos utilizados para la confección de la Base de Sales para el MTCB, como producto intermedio. Es importante destacar que existen otras condicionantes durante el proceso de producción, que pueden incidir en la compatibilidad de la mezcla de ambas sales como son las interacciones físico-químicas de los elementos y materias primas que conforman la formulación del medio de cultivo, los materiales empleados y el ambiente donde se realizan los procesos de producción.

Se observó un líquido transparente, en las disoluciones sometidas a temperatura de 70 °C, tanto en la solución de Na₂HPO₄ al 17 % (8,3 kg/50 L), como en la de CaCl₂ al 27 % (1,4 kg/5 L). El total de sólidos en la solución fue de 9,7 kg para un volumen total de agua de 55 L, quedando la mezcla a una concentración final aproximada del 18 %.

La baja solubilidad del Na₂HPO₄, su elevada concentración en el medio de cultivo, la posibilidad de que al mezclarla con el CaCl₂, produjera mayor precipitado, unido al inconveniente de emplear mayores volúmenes de agua en la mezcla, impuso la necesidad de disminuir a la mitad la concentración de este reactivo en el producto intermedio. La alta solubilidad de la sal de Ca, permitió emplearlo en su totalidad en la base de sales.

Se evidenció un líquido opalescente de color blanco y presencia de precipitado, luego de mezclar la solución de CaCl₂ (1,4 kg/5 L) sobre la de Na₂HPO₄ (8,3 kg/50 L). Se observó un aumento considerable de la temperatura del líquido, que de la inicial (60-70 °C) pasó a ser entre 80 y 85 °C. El peso total de la dilución resultó en 64,69 kg.

A pesar que se empleó el orden de mezcla recomendado por la literatura, la secuencialidad de ambas sales, sin que entre ellas mediara algún micro o macro elemento, la imposibilidad de disminuir el pH a menos de cinco, y el encontrarse la disolución a una temperatura superior a la ambiental, favoreció a una mayor interacción de ambas sales y que se detectara la incompatibilidad y la formación de Ca₃(PO₄)₂. Esto está en plena correspondencia con estudios realizados por Delgado y Díaz en el año 2005, ²¹ que plantean que por la naturaleza inorgánica de estas sales, tienden a disociarse con mayor facilidad y solo el mantenimiento del pH y la temperatura en niveles más bajos, unido a evitar el contacto directo de ambos electrolitos a altas concentraciones, evita la formación de precipitado.

La mezcla de sales contó con un peso inicial de 64,69 Kg, donde el proceso de filtrado mostró una solución opalescente, con presencia de partículas minúsculas en suspensión y ausencia de precipitado. El refiltrado de la dilución permitió obtener un líquido totalmente transparente, con una cantidad final del concentrado de 57,0 kg, un índice de refracción de 1,354 y un total de sólidos de 8,5 kg, para una representación aproximada del 15 % en la mezcla. El rendimiento del proceso resultó en un 88 %.

El valor de la concentración total de la mezcla se considera aceptable para el filtrado y secado por aspersión, teniendo en cuenta que Valiente y colaboradores en el 2015 ²² plantean, que lo ideal es que las soluciones posean de 20 a 30 % de sólidos totales disueltos.

Se obtuvo 4,35 kg de producto seco, en el proceso de secado por aspersión, lo que representó un rendimiento real de 51,2 %. Estos resultados concuerdan con los estudios realizados a pequeña escala de dos lotes de la base de sales realizados en la etapa piloto del MTCB, donde en cada proceso de filtrado y secado por aspersión, se obtuvo la mitad del producto inicial con un rendimiento entre 50 y 52 %.

Aunque se observa una reproducibilidad de los resultados, a diferentes escalas de producción del producto, es necesario determinar si otros elementos en el proceso inciden en el rendimiento. López y colaboradores en el 2009 ²³ plantearon que uno de los factores críticos para un mayor provecho en el proceso de secado, es el adecuado contenido de sólidos totales. Por lo que una alta concentración de sólidos totales, evita una pérdida considerable del soluto e incrementa el rendimiento del producto final. Otro factor que favorece el rendimiento del proceso, es la temperatura de entrada y de salida; por lo que a un aumento de la misma, garantiza que a escalas superiores se obtengan rendimientos mayores. ²⁴

Si tomamos en cuenta lo referido por Edrisi y colaboradores en el año 2016, ²⁵ podemos considerar de adecuado el rendimiento en nuestro estudio. Esto se debe a que secadores por aspersión en pequeña escala con rendimientos entre 60 y 80 % pueden dar indicio de rendimientos más altos en posteriores secados a escalas superiores de producción.

Se obtuvo un polvo de color blanco con una apariencia fina, deshidratada, homogénea, fluida, sin presencia de grumos o partículas extrañas insolubles. La apariencia de la base de sales en una solución al 0,12 % fue transparente, sin presencia de precipitados. La pérdida por desecación se estableció en 0,5 %, encontrándose por debajo del límite de aceptación (≤ 7,0 %).

Se obtuvo una apariencia del polvo satisfactoria, lo cual es consecuencia del empleo de la máquina de secado por aspersión. Esta tecnología es un proceso continuo y controlado, con tiempos cortos de secado, que garantiza un polvo fluido y soluble, homogéneo, que preserva sus propiedades fisicoquímicas, y da como resultado una excelente presentación del producto final. ²⁶

Se comprobó la efectividad del proceso tecnológico en eliminar el Ca₃(PO₄)₂ de la mezcla de sales, al observarse una solución transparente, sin presencia de precipitado. La pérdida por desecación mostró resultados satisfactorios, con valores inferiores al 7 %.

Determinar la humedad fue un paso fundamental, debido al efecto que tiene la misma para mantener la calidad del producto, además que influye directamente en el costo de producción, ^27,28,29 lo que garantiza una mayor estabilidad durante la conservación y evita la interacción química y la degradación de sus componentes ³⁰.

La inclusión de la base de sales en el MTCB experimental evidenció, luego de la preparación y esterilización por vapor fluente, un medio semisólido de apariencia homogénea y ausencia de precipitado. No se observó diferencias significativas, en cuanto a características organolépticas y fisicoquímicas, con el medio de referencia empleado como control (MTCB de OXOID, Alemania).

Se observó crecimiento abundante de S. Typhimurium, S. Enteritidis, S. sonnei y S. flexneri en placas de ATS, luego de ser conservadas las cepas en el MTCB de BioCen (Cuba) y el medio control (OXOID, Alemania), por un período de uno, 16 y 49 días a temperatura ambiente.

No se observó deterioro ni pérdida de las características macroscópicas típicas de los microorganismos en ninguna de las siembras realizadas, mostrando las respuestas bioquímicas y serológicas esperadas en las pruebas de identificación presuntiva y confirmatoria. No se observó diferencias cualitativas significativas, en cuanto a número y características culturales de las colonias desarrolladas, de los microorganismos provenientes del MTCB de BioCen (Cuba) y de OXOID (Alemania).

Los resultados en esta etapa evidencian la efectividad de la metodología y de los procedimientos empleados en todo el proceso productivo, para eliminar la sedimentación, originada por el producto de incompatibilidad de la mezcla de sales, sin afectar la funcionalidad microbiológica del producto final.