El desarrollo de un biocontrolador de plagas depende, primeramente, de la disponibilidad de un agente de control biológico altamente eficiente. Experiencias previas en la aplicación del campo magnético, sugieren que es posible su uso para aumentar la eficiencia de procesos fermentativos de hongos al disminuir los tiempos de fermentación y aumentar la calidad del producto final. Esto implica directamente una mayor producción en menor tiempo y, por tanto, un menor costo. ¹

Una vez identificado el agente de biocontrol, debe diseñarse el método para su producción masiva que permita producir altos niveles de propágulos viables e infectivos. Si se desea un escalamiento industrial que permita obtener las cantidades necesarias para la aplicación de este microorganismo en condiciones de campo, se deben definir los requerimientos químicos y físicos que permitan su producción sin afectar la actividad biocontroladora. ^2,3 El estudio de la cinética microbiana es de particular importancia para la investigación en los campos de microbiología y biotecnología.

La propiedad más importante de un modelo primario es que describa de forma adecuada el crecimiento de los microorganismos y permita obtener estimaciones precisas de los parámetros que caracterizan dicho crecimiento. La variabilidad de las estimaciones depende de la técnica usada para monitorear el crecimiento y del modelo usado. ⁽⁴ Dada la existencia de diferentes modelos primarios, se hace necesario comparar el comportamiento de los mismos a fin de seleccionar el que asegure mejores resultados para un conjunto determinado de datos. Guerra et al. ⁵ indicaron que, aspectos tales como la bondad de ajustes y las propiedades de estimación deben ser tenidos en cuenta en la comparación de modelos competidores.

Cayré et al.⁶ refieren que, entre los modelos microbiológicos predictivos, los modelos de nivel primario describen los cambios de los números microbianos con el tiempo. Estos permiten estimar los parámetros cinéticos que caracterizan dicha curva: tiempo de latencia, máxima velocidad específica de crecimiento y máxima densidad celular. ⁷ Esser et al.⁸ clasificaron a los modelos primarios como: modelos sigmoidales, entre los que se encuentran las versiones modificadas de los modelos Logístico y de Gompertz; ⁹ modelos con una función de ajuste, como los propuestos por Baranyi ¹⁰ y modelos de compartimentos como el propuesto por Hills y Wright. ¹¹

El objetivo del presente trabajo es describir el crecimiento microbiano de Trichoderma harzianum Rifai (A-34) en la fermentación en estado sólido bajo condiciones de estimulación del crecimiento por la acción del campo magnético mediante el uso de un modelo primario.

Se empleó Trichoderma harzianum Rifai cepa A-34, proveniente del banco de cepas del Instituto Cubano de Investigaciones de la Caña de Azúcar (ICIDCA), La Habana. Esta cepa es la que se emplea nacionalmente en el Programa de Protección de Plagas. Se conservó en el Laboratorio Provincial de Sanidad Vegetal, Santiago de Cuba y se fortaleció mediante su enfrentamiento con Fusarium sp. para conservar su patogenicidad.

Se utilizó como medio de conservación Agar Papa Dextrosa (PDA, por sus siglas en inglés): Extracto de patata 4,0 g·L^-1, Dextrosa 20,0 g·L^-1, Agar‑agar 15,0 g·L^-1. Se ajustó el pH a 5,5 ± 0,2 con NaOH o HCl 1M y se esterilizó en autoclave durante 15 minutos a 1 atm y 121 °C. A este medio se le ajustó el pH a 5,4 y se esterilizó durante 20 min en una autoclave a 1 atm y 121 °C. Las cepas se incubaron a una temperatura entre 28 y 30 °C.

Para la fermentación en estado sólido se emplearon biorreactores tipo columna empacada con carga de 100 g. En el fondo de cada uno se colocó una base de acrílico con 32 orificios como soporte del sustrato. El aire se distribuyó a cada columna en forma controlada en 2 vkgm (L de aire por kg de medio por min). El proceso de cultivo del hongo fue de 14 días, durante el cual se tomó una unidad experimental cada 12 horas. Se homogenizó el contenido de la columna para garantizar la representatividad de la muestra. Se realizaron tres réplicas por cada experimento.

Se empleó como sustrato para la fermentación en estado sólido bagazo de caña (86 % w/w) proveniente del central “Paquito Rosales”, zafra 2016 - 2017, enriquecido con polvo de arroz (14 % w/w). Se empleó un tamaño de partícula (-3,00 +0,85) mm de bagazo previamente esterilizado durante 40 min a 1 atm y 121 °C. Se ajustó la humedad del medio a 50%.

Se estudió el crecimiento de Trichoderma harzianum Rifai (A-34) tratado con campo magnético y se comparó con el experimento control.

Se realizó el ajuste de los modelos mediante el programa OriginPro (OriginLab Inc.) versión 9.4 (2017). Los modelos seleccionados se muestran en la tabla 1 con la ecuación según la forma que aparece en el programa. No se realizó la reparametrización de los mismos porque estos modelos permiten realizar inferencias directas sobre la interpretación biológica de sus parámetros. ^12,13

Tabla 1

Donde y es la variable dependiente, equivalente al número de células contadas [conidios · g de sustrato^-1]; x es la variable independiente, equivalente al tiempo de fermentación, t [h]; a es el valor asintótico cuando el tiempo crece indefinidamente (aproximadamente equivalente a la concentración final de microorganismos); k es la tangente en el punto de inflexión de la curva de crecimiento, equivalente a la velocidad específica de crecimiento máximo del microorganismo µ_m [h^-1] y x _c es el tiempo en que se alcanza el punto de inflexión o de máxima velocidad de crecimiento [h].

Para la validación estadística de los modelos, se estudiaron los valores residuales por los criterios: Criterio de Información de Akaike (AIC, por sus siglas en inglés), R² ajustado, X ² (Chi-cuadrado), Mínimo cuadrado de los residuos y Prueba de Fisher. Se comprobó la normalidad de los residuos mediante la prueba de Kolmogorov- Smirnov. ⁵

Se obtuvo el comportamiento del conteo de conidios en función del tiempo de fermentación de los experimentos tratados magnéticamente y sin tratamiento magnético (figura 1). El número de conidios inicial fue de 2,79·10⁷ ± 7,59·10⁶ conidios/g de sustrato. El crecimiento alcanzó un valor máximo de 1,26·10⁹conidios/g de sustrato en el experimento con tratamiento magnético para 120 h de fermentación. Los resultados obtenidos en el presente estudio son similares a los obtenidos por Cruz Martínez ¹⁴ en un fermentador de bandejas para Trichoderma koningii en un sustrato compuesto por arroz y salvado de trigo, que obtuvieron valores de concentración de conidios entre 10⁸ y 10⁹ conidios/g de sustrato. Agamez Ramos et al.¹⁵ obtuvieron valores de concentración de conidios en el orden de 10⁹ conidios/g de sustrato en la fermentación en estado sólido de Trichoderma sp. sobre sustratos a base de cabecilla de arroz y de semilla de algodón enriquecidos con melaza y urea. Elósegui Claro et al.¹⁶ reportaron valores del orden de 10⁹ conidios/g de sustrato para Trichoderma harzianum Rifai (A-34) con arroz partido y cáscara de arroz como sustrato. En el presente estudio se logran valores similares de concentración de conidios con un sustrato que, a diferencia del arroz, no tiene uso como suplemento alimenticio y esto es un valor añadido de este trabajo.

Fig. 1

donde:

eT: Biorreactor con Trichoderma harzianum Rifai (A-34) tratado magnéticamente y eC: Biorreactor con Trichoderma harzianum Rifai (A-34) sin tratamiento.

Se obtuvieron los coeficientes que describen el modelo de Gompertz y Logístico para los datos de la concentración de biomasa de T. harzianum Rifai (A-34) para el experimento control y el desarrollado con el hongo tratado con campos magnéticos en fermentación en estado sólido aireada a 30 °C (tablas 2 y 3).

Tabla 2

Tabla 3

Existen diferencias significativas entre los valores de velocidad específica máxima de crecimiento de T. harzianum Rifai (A-34) para el experimento control y el desarrollado con el hongo tratado con campos magnéticos en fermentación en estado sólido aireada a 30 °C obtenido mediante los dos modelos. Pla et al.¹⁷ reportaron valores mayores de velocidad específica máxima del crecimiento de Listeria monocytogenes CECT 4031 cuando se emplean los modelos Logístico (0,22 h⁻¹) y Richards (0,32 h⁻¹) comparados con los determinados por el método gráfico (0,15 h⁻¹). Para seleccionar el modelo que mejor ajusta los datos experimentales se realizó la validación estadística de los mismos (tablas 4 y 5).

Tabla 4

Como puede observarse en la tabla 4, el modelo Logístico tiene un menor valor de AIC por lo que es más probablemente correcto.

Tabla 5

A partir de los datos reflejados en la tabla 5, se puede concluir que el modelo Logístico tiene un menor valor de BIC por lo que es más probablemente correcto.

El modelo Logístico ajustó más adecuadamente los datos experimentales, por lo que se selecciona para describir los datos de concentración de biomasa para el experimento control (Ec. 3) y para los datos del hongo tratado con campos magnéticos en fermentación en estado sólido aireada a 30 °C (Ec. 4).

Los valores de k en el modelo representan la velocidad específica máxima de crecimiento y, como se observa, estos resultan superiores para el experimento desarrollado con el hongo tratado con campos magnéticos (0,08 h^-1) comparados con el experimento desarrollado con el hongo sin tratamiento (0,06 h^-1).

Zapata M. et al.¹⁸ indicaron que los campos magnéticos estáticos de moderada intensidad alteran el flujo de iones a través de la membrana plasmática, lo que genera como resultado neto una modificación en la velocidad de reproducción celular.

Al comparar los valores de la constante a de ambas ecuaciones se puede apreciar que la mayor formación de biomasa se encontró para la muestra tratada con 1,22·10⁹ conidios · g de sustrato^-1, lo que representa 1,4 veces más que el obtenido para la muestra control.

Aunque no hay una teoría generalmente aceptada concerniente a las reacciones de microorganismos al campo magnético estático de moderada intensidad, estas son usualmente interpretadas en términos de los cambios ocurridos en la permeabilidad de las membranas. Se ha sugerido que los mecanismos de los efectos campo-inducción en células pueden ser explicados en términos de la cinética de las reacciones bioquímicas, de los enlaces químicos, los estados físicos de las macromoléculas y la modificación indirecta de las reacciones intermedias. ¹⁹

Las expresiones obtenidas en este trabajo, son un aporte importante para describir la cinética microbiana bajo condiciones de estimulación del crecimiento de Trichoderma harzianum Rifai (A-34) por la acción del campo magnético en la fermentación a partir bagazo de caña en la fermentación en estado sólido.