Introducción

La enfermedad de Alzheimer (EA) es un problema de salud pública que se agravará debido a que la expectativa de vida de las personas tiende a aumentar a nivel mundial.^1,2 La EA es la demencia neurodegenerativa de mayor frecuencia, pues afecta aproximadamente al 2% de la población en países industrializados y de forma predominante a las personas mayores de 70 años. Algunas proyecciones epidemiológicas apuntan que para el 2050, 68% de los 131.5 millones de casos de demencia se encontrarán en países en desarrollo, como México. En el año 2015 la Secretaría de Salud reportó 860 mil casos a nivel nacional y, según datos recientes, nuestro país vive un envejecimiento acelerado, pues mientras en 2010 las personas de 65 años o más representaban un 6% de la población, en el 2016 aumentaron a un 15%. La prevalencia de esta enfermedad es del 3% en individuos entre 60 y 70 años, lo cual alcanza un 40% en personas mayores de 85 años.³

La EA se caracteriza por la presencia de depósitos extraneuronales de proteína beta-amiloide (Aβ) y marañas neurofibrilares de proteína tau intracelulares,⁴ así como por una pérdida sináptica y neuronal. La disminución en la densidad sináptica se refleja en la pérdida de la mayoría de los componentes de las vesículas sinápticas y los péptidos almacenados en estas.⁵ Esta pérdida sináptica puede llegar a ser hasta de un 75% en el hipocampo y parece ser un evento previo a la muerte neuronal.⁶ De hecho, la pérdida de la proteína sinaptofisina, la cual está asociada a las terminales sinápticas, es un evento temprano en la EA.

El papel de la proteína beta-amiloide en la patogenia de la EA se ha visto apoyado por su asociación tanto con la EA familiar como esporádica. Experimentos in vitro han mostrado que la proteína beta-amiloide y su fragmento activo 25-35 (Aβ25-35) poseen efectos neurotóxicos directos o exacerban los efectos dañinos de otros insultos neurotóxicos. Una de las alteraciones más consistentes en la EA es la reducción en el consumo de glucosa previo al daño neuronal. Varios grupos han reportado, en el cerebro de pacientes con EA, una disminución en la utilización de glucosa, lo cual relaciona un mayor grado de demencia con una reducción mayor del metabolismo energético.⁷ También se ha encontrado que aquellos pacientes predispuestos genéticamente a la EA tienden a desarrollar cambios en el metabolismo cerebral antes de iniciar con la sintomatología.⁸ Es interesante el hecho de que aquellos pacientes con impedimento cognoscitivo leve y una reducción en el metabolismo energético cerebral frecuentemente desarrollan EA; adicionalmente, se ha propuesto que la reducción del metabolismo glucolítico podría vaticinar el desarrollo de deficiencias cognoscitivas en sujetos normales envejecidos.^9,10

Para estudiar el papel de las deficiencias en el metabolismo energético dentro de los procesos neurodegenerativos, en el presente trabajo utilizamos compuestos capaces de generar daño metabólico en las terminales sinápticas y mimetizar así una deficiencia energética. El primero de estos es el ácido 3-nitropropiónico (3-NP), el cual es una toxina que interfiere con la síntesis de ATP, al inhibir a la enzima succinato deshidrogenasa, con lo cual induce el desacoplamiento mitocondrial. El otro compuesto seleccionado es el inhibidor irreversible de la enzima gliceraldehido 3-fosfato deshidrogenasa, yodo acetato (IA). Además, se evaluó el efecto protector de moléculas con diversas propiedades (sustrato energético, priruvato; antioxidante, vitamina E; y un atrapador de radicales libres, la alfa-fenil-N-ter-butil nitrona [PBN]).

Métodos

Obtención de sinaptosomas

Se utilizaron ratas Wistar machos de tres meses y 20-24 meses de edad, con base en los lineamientos de investigación en materia de salud (Secretaría de Salud, México), con la aprobación del Comité Local de Ética para el Manejo de Animales. La purificación de la fracción sinaptosomal se realizó mediante centrifugaciones diferenciales, a partir de la modificación del método de Löscher.¹¹ Tanto la corteza como el hipocampo se disecaron en frío; los tejidos fueron homogenizados por separado en una solución de sacarosa 0.32 M y HEPES 5 mM, pH 7.2. Los homogenizados se centrifugaron a 4500 rpm durante 10 minutos. El sobrenadante se colocó en 1 mL de sacarosa 1.2 M y se centrifugó a 50 000 rpm durante 30 minutos. Se colectó la interface del gradiente y se llevó a un volumen de 2 mL con sacarosa 0.32 M. Finalmente la fracción se colocó sobre 1 mL de sacarosa 0.8 M y se centrifugó a 50 000 rpm durante 30 minutos. El pellet, correspondiente a la fracción sinaptosomal, fue resuspendido en buffer Locke conformado por (mM): NaCl 154, KCl 5.6, CaCl2 2.3, MgCl2 1, NaHCO3 3.6, glucosa 5, HEPES 5 a pH 7.2. Las alícuotas contuvieron 50 µg de proteína sinaptosomal y se incubaron a 37 ºC en un baño con agitación durante tres horas bajo los distintos tratamientos: fragmento activo 25-35 de péptido beta-amiloide (Aβ25-35) 50 µM en presencia o ausencia de IA 5 µM, 3-NP 10 µM y de las diferentes combinaciones con piruvato 1 mM, vitamina E 250 µM y PBN 10 µM.

Evaluación de la actividad óxido-reductora mitocondrial

La actividad de la cadena respiratoria mitocondrial se evaluó mediante la cuantificación de las sales de formazán, generadas a partir de la reducción del 3-(3,5-dimetiltiazol-2-il)-2-5-difenil tetrazodio (MTT), un compuesto soluble capaz de incorporarse a las mitocondrias por la acción de deshidrogenasas en presencia de NADH.¹² Transcurrido el periodo de incubación de los sinaptosomas con las diferentes condiciones experimentales, se agregó MTT (5% v/v) a una concentración final de 10 mM y se incubaron durante una hora más. Finalmente las muestras se centrifugaron a 5000 rpm durante cinco minutos y se agregaron 500 µl de isopropanol ácido. Las muestras se leyeron en un espectrofotómetro a una longitud de onda de 570 nm.

Estadística

Los resultados mostrados representan el promedio de 5 a 10 experimentos independientes ± error estándar (ES). Las diferencias significativas se obtuvieron al analizar los datos con análisis de varianza de una vía (ANOVA), seguido de una prueba post-hoc Bonferroni y Tukey, en el programa Origin 5.0.

Resultados

En la primera serie experimental comparamos el efecto de la exposición al Aβ25-35 50 µM sobre la susceptibilidad tejido-específica de terminales sinápticas de corteza cerebral e hipocampo a partir de animales de tres y 20-24 mese de edad. Como se muestra en la figura 1, los sinaptosomas obtenidos de animales jóvenes no muestran un efecto importante sobre su actividad mitocondrial al ser expuestos al Aβ25-35, mientras que en los sinaptosomas de 20-24 meses de edad la sola presencia de Aβ25-35 es capaz de inducir una importante reducción de la actividad óxido-reductora mitocondrial, aun en condiciones basales. Es de resaltar que los sinaptosomas derivados de tejido hipocampal muestran una mayor susceptibilidad (↓ 37.9%) en comparación con aquellos que son corticales (↓ 22.8%).

Efecto de la Aβ25-35 sobre la función mitocondrial de sinaptosomas aislados a partir de ratas de tres y 20-24 meses. Los datos representan el porcentaje en relación con el control ± SEM de tres determinaciones independientes hechas por triplicado

Figura 1
Efecto de la Aβ25-35 sobre la función mitocondrial de sinaptosomas aislados a partir de ratas de tres y 20-24 meses.

Los datos representan el porcentaje en relación con el control ± SEM de tres determinaciones independientes hechas por triplicado

Control *p < 0.001; joven ºp < 0.001

A partir de los resultados anteriores decidimos analizar el efecto del envejecimiento sobre la susceptibilidad sináptica hacia la Aβ_25-35 y nos enfocamos en las terminales nerviosas obtenidas de ratas de 20-24 meses de edad. Los sinaptosomas obtenidos de estos animales fueron sometidos a las mismas condiciones experimentales, previamente reportadas por nuestro grupo en el caso de los sinaptosomas obtenidos de las ratas jóvenes,^13,14 tales como la exposición a dos inhibidores del metabolismo energético, como el IA (5 µM) y el 3-NP (10 µM), así como a compuestos con actividad antioxidantes como el piruvato (1 mM) y la vitamina E (250 µM) o con capacidad de atrapar radicales libres, PBN (10 µM). Dichos tratamientos nos permitieron determinar algunas condiciones capaces de potenciar o reducir los efectos tóxicos de la Aβ_25-35.

Para el caso de los sinaptosomas hipocampales obtenidos a partir de ratas viejas, la exposición a la Aβ_25-35 indujo una inhibición de la actividad mitocondrial del 37.9% en comparación con los sinaptosomas control (ver panel superior de figura 2). El PBN redujo la actividad mitocondrial en un 7.7%, en tanto el piruvato la mantuvo alrededor de los niveles control (105.9%). La vitamina E indujo un incremento en la actividad mitocondrial del 132.1% en relación con los niveles basales del control.

Figura 2
Efecto del IA sobre la función mitocondrial de sinaptosomas aislados a partir de ratas de 20-24 meses.

Papel protector del PBN, la vitamina E y el piruvato en sinaptosomas de hipocampo (panel superior) y corteza cerebral (panel inferior) en presencia y ausencia de la Aβ_25-35. Los datos representan el porcentaje en relación con el control ± SEM de 6-8 determinaciones independientes hechas por duplicado.

Al incubar en presencia de IA la actividad mitocondrial cayó un 21.5%. Mientras que el PBN y el piruvato no presentaron un efecto protector (80.6% y 86.9%, respectivamente), la vitamina E fue capaz de revertir el efecto del IA, con lo que la actividad mitocondrial alcanzó niveles del 67.5% por encima del control.

El tratamiento conjunto de la Aβ_25-35 y el IA no indujo un efecto sinérgico sobre la toxicidad de la Aβ_25-35, por lo que la inhibición de la actividad mitocondrial bajo estas condiciones fue del 37%, mismo porcentaje que el inducido por la Aβ_25-35 por sí misma. Bajo estas condiciones el PBN (61%) y el piruvato (65.2%) fueron incapaces de proteger del daño. En el caso de la vitamina E, esta fue capaz de revertir los efectos deletéreos del tratamiento conjunto mencionado, lo cual incrementó la actividad mitocondrial en un 14% por arriba de los niveles controles.

Los sinaptosomas de corteza cerebral obtenidos a partir de ratas viejas e incubados en presencia de Aβ_25-35 mostraron una inhibición de la actividad mitocondrial del 22.8% (figura 2, panel inferior). Bajo condiciones de control, la adición del PBN disminuyó la actividad mitocondrial un 8.3%, mientras el piruvato permitió alcanzar los niveles energéticos basales (99.3%). Al igual que en los casos anteriores, la vitamina E indujo un incremento en la actividad mitocondrial del 39%. Cuando estos sinaptosomas se incubaron en presencia de IA, la actividad mitocondrial disminuyó un 22.5% respecto al control. De la misma forma que en los sinaptosomas del hipocampo tampoco se presentó una potenciación en el daño inducido por la Aβ_25-35. La vitamina E fue capaz de recuperar la actividad mitocondrial control (108.5%), en tanto el piruvato consiguió una protección parcial mínima (86.2%), aunque significativa estadísticamente. El PBN no mostró ningún efecto (77.2%).

El tratamiento conjunto de la Aβ_25-35 y el IA redujeron la actividad mitocondrial en un 30.5%. Aunque esta reducción fue significativa en relación con la sola exposición a la Aβ_25-35, la potenciación de su toxicidad no fue tan importante en comparación con lo reportado en ratas jóvenes. Asimismo, tanto el PBN como el piruvato fueron incapaces de proteger del daño (76.3% y 83.6%, respectivamente). La presencia de la vitamina E llevó la actividad mitocondrial 19.7% por encima de los niveles control.

Los sinaptosomas aislados a partir del hipocampo de ratas viejas también fueron incubados en presencia de 3-NP (lo cual se muestra en la figura 3, panel superior) y se observó que la actividad mitocondrial decae un 15.5%. El PBN no fue capaz de proteger bajo estas condiciones (82.3%). En este caso, la vitamina E comprobó sus efectos benéficos al incrementar la actividad mitocondrial en un 39.9% por arriba de los valores control, mientras el piruvato demostró que tenía un efecto protector parcial (90.7%), el cual fue significativo estadísticamente.

Figura 3
Efecto del 3-NP sobre la función mitocondrial de sinaptosomas aislados a partir de ratas de 20-24 meses.

Papel protector del PBN, la vitamina E y el piruvato en sinaptosomas de hipocampo (panel superior) y corteza cerebral (panel inferior) en presencia y ausencia de la Aβ25-35. Los datos representan el porcentaje en relación con el control ± SEM de 6-8 determinaciones independientes hechas por duplicado

El tratamiento conjunto de la Aβ_25-35 y el 3-NP redujo la actividad mitocondrial en un 27%. En este caso tanto el PBN (71.3%) como el piruvato (79%) fueron incapaces de proteger del daño. En cambio la vitamina E revirtió sus efectos, además de incrementar la actividad mitocondrial un 29.4% por encima de los niveles control.

También en la figura 3 se muestra el efecto del 3-NP sobre los sinaptosomas obtenidos de la corteza de ratas viejas, al reducir su actividad mitocrondrial un 16.3%. La adición de PBN no mostró ningún efecto (79.3%). Con la presencia de piruvato se consiguió una protección parcial mínima (91.1%), la cual fue significativa estadísticamente. La vitamina E (113.7%) fue capaz de revertir el efecto del 3-NP.

El tratamiento conjunto de Aβ_25-35 y el 3-NP redujo la actividad mitocondrial en un 22.6%. Bajo estas condiciones el PBN no mostró ningún efecto protector (76.3%). La vitamina E fue capaz de revertir el daño e incrementar la actividad mitocondrial 23.1% por encima de los niveles control, en tanto el piruvato presentó una protección parcial bajo dichas condiciones (86.7%).

Al comparar los porcentajes de actividad de las muestras obtenidas a partir de los animales viejos (20-24 meses) con los datos obtenidos en un estudio previo que nuestro grupo realizó en animales jóvenes (tres meses), se observa que dichos porcentajes no eran significativamente distintos entre sí. Por lo tanto se decidió analizar la razón de actividad viejos/jóvenes (V/J) y así comparar la actividad mitocondrial en respuesta a los distintos tratamientos entre ambas poblaciones.

En el cuadro I se muestra la razón V/J de la actividad óxido-reductora mitocondrial, al comparar las unidades crudas (unidades arbitrarias de absorbancia a una longitud de onda de 570 nm), las cuales fueron obtenidas de los ensayos realizados tanto en sinaptosomas hipocampales como en los obtenidos a partir de la corteza cerebral (cuadro II) de animales viejos en relación con las mismas condiciones, pero en sinaptosomas de animales jóvenes. Se observa una evidente reducción de la actividad mitocondrial dependiente de la edad y de manera tejido-específica. Los datos apuntan al hipocampo como la región más susceptible al daño.

Cuadro I
Razón de actividad de animales viejos frente a jóvenes (V/J).

Actividad óxido-reductora mitocondrial de sinaptosomas hipocampales

Cuadro II
Razón de actividad de animales viejos frente a jóvenes (V/J).

Actividad óxido-reductora mitocondrial de sinaptosomas corticales

Discusión

Se ha propuesto que las alteraciones primarias en la EA pueden ocurrir en las terminales sinápticas y ser uno de los eventos tempranos en la enfermedad.^15,16 Así, el uso de sinaptosomas para estudiar los efectos nocivos de la proteína beta-amiloide de forma directa bajo condiciones metabólicas basales, o al inducir el desacoplamiento del metabolismo energético, puede ser de relevancia en el entendimiento de la etiología de la EA. Numerosos reportes señalan que la administración de la proteína beta-amiloide en la región del hipocampo conduce a severas alteraciones conductuales y bioquímicas, así como a la disminución de las capacidades cognitivas a largo plazo.¹⁷ El análisis globlal de nuestros resultados sugiere que la administración de la proteína beta-amiloide es capaz de inducir cambios en la función sináptica, mientras que la neurodegeneración inducida por esta proteína aparentemente requiere de factores adicionales, como la coadministración de excitotoxinas¹⁸ o de drogas que alteren el metabolismo glucolítico.^19,20

De manera interesante, a diferencia de lo reportado en sinaptosomas de animales jóvenes,^13,14 la administración de la proteína beta-amiloide en terminales nerviosas de ratas viejas tiene un gran efecto por sí misma sobre la disminución de la capacidad óxido-reductora mitocondrial y esto posiblemente refleja cambios asociados al envejecimiento que inducen un manejo inadecuado de los insultos metabólicos, lo cual genera condiciones que favorecen la toxicidad de la proteína beta-amiloide. Entre estas condiciones pueden considerarse el incremento en la acumulación de especies reactivas de oxígeno, la disminución de la función mitocondrial debido a la acumulación de mutaciones en el ADNmt,²¹ un aumento en la carga de calcio interno²² y alteraciones en los mecanismos que regulan el metabolismo de neurotransmisores excitadores como el glutamato.²³ Así, el déficit energético producto del envejecimiento hace que la terminal sináptica sea más susceptible a los estímulos externos al disminuir sus capacidades homeostáticas. Sin embargo, la presencia de los inhibidores metabólicos no fue capaz de producir un efecto sinérgico estadísticamente significativo sobre la toxicidad de la proteína beta-amiloide (como el reportado en los sinaptosomas jóvenes). Esto podría explicarse como una consecuencia del bajo nivel metabólico basal presente en las muestras de 20-24 meses.

Nuestros resultados señalan que los sinaptosomas aislados a partir del hipocampo parecen ser más sensibles a los efectos de la proteína beta-amiloide, bajo las distintas condiciones experimentales, en comparación con los obtenidos de la corteza cerebral. Esta mayor vulnerabilidad, bajo las condiciones anteriormente descritas, apoyaría el hecho de que el hipocampo es de las regiones que más tempranamente y con mayor intensidad se dañan en la EA. Adicionalmente, la toxina glucolítica, IA, parece incrementar de forma más potente la vulnerabilidad hacia la proteína beta-amiloide en comparación con la 3-NP. Estos resultados concuerdan con reportes previos, los cuales indican que en los sinaptosomas la glucosa es usada como la principal fuente energética, y adicionalmente, que el IA efectivamente reduce los niveles de ATP en los sinaptosomas.²⁴ Si algunas alteraciones en la producción energética son capaces de exacerbar la toxicidad inducida por la proteína beta-amiloide, como algunos otros estudios in vitro sugieren,¹⁹ entonces aquellos mecanismos que involucren alteraciones en la función mitocondrial dependiente de la edad, como serían una baja perfusión sanguínea cerebral, la acumulación de la proteína beta-amiloide, y mutaciones del ADN mitocondrial, pudieran contribuir a la patología de la EA.

De acuerdo con nuestros resultados, la administración de piruvato protege parcialmente del daño inducido por la proteína beta-amiloide, probablemente al restaurar parte de los niveles energéticos al actuar como sustrato del ciclo de los ácidos tricarboxílicos después de su conversión a A-CoA. También se ha reportado que el piruvato es capaz de incrementar la respiración sinaptosomal, incluso en presencia de glucosa.²⁵

El uso de antioxidantes, como la vitamina E, ha sido reportado en varios modelos de muerte neuronal, tanto en estudios in vitro como in vivo.^26,27 Así, la aplicación de vitamina E es capaz de proteger del daño neuronal inducido por el IA.²⁸ Actualmente, se le utiliza de manera frecuente en el tratamiento de distintas enfermedades (como las neurodegenerativas), ya sea con la intención de retrasar su desarrollo o con fines preventivos. Nuestros resultados confirman que la vitamina E protege ante el daño inducido por la proteína beta-amiloide, al igual que por el de los inhibidores metabólicos. Interesantemente, bajo condiciones de control la vitamina E fue capaz de estimular la actividad reductora mitocondrial. Este efecto podría explicarse debido a su acción protectora sobre el proceso normal de envejecimiento de la preparación sinaptosomal, directamente relacionado con su actividad antioxidante, o a través de un efecto directo al estimular la actividad mitocondrial. En el ciclo de óxido-reducción de la vitamina E, cuando esta se encuentra en un estado oxidado (radical tocoperoxil), parte de las formas reducidas de la coenzima Q se encargan de reducirla, lo cual regenera nuevamente la vitamina E; en consecuencia, se estimularía la cadena transportadora de electrones en la mitocondria. Sin embargo, para apoyar esta interpretación sería necesario valorar, a través de la tasa de respiración mitocondrial, este efecto positivo de la vitamina E.

A pesar de que diversos reportes confirman la eficiencia del PBN como un atrapador de radicales libres^29,30 y neuroprotector,³¹ nuestros resultados muestran que el PBN no tuvo efectos benéficos sobre la preparación sinaptosomal, al inducir incluso una inhibición en la actividad óxido-reductora mitocondrial. Otros autores señalan que en los mecanismos de protección del PBN también están involucradas otras vías celulares, como la regulación de señales de transducción³² o efectos directos sobre la expresión genética.³³

Estos resultados sugieren que la terminal sináptica puede ser particularmente sensible a perturbaciones metabólicas, las cuales pueden exacerbar la toxicidad de la proteína beta-amiloide. De manera interesante, algunos datos sugieren que la sinapsis puede ser un sitio en donde inicie la cascada neurodegenerativa en la EA y, de hecho, la pérdida de sinaptofisina, una proteína asociada a la terminal sináptica, ha sido tomada como un marcador temprano de la neurodegeneración.³⁴ A pesar de que los mecanismos patogénicos que subyacen a la EA no se conocen del todo, estos datos dan un sustento experimental a la hipótesis de que ciertos factores de riesgo, como disfunciones metabólicas y la acumulación de la proteína beta-amiloide, podrían interactuar de manera exacerbada en la EA y que sustratos metabólicos, como el piruvato y compuestos antioxidantes, podrían funcionar como una herramienta terapéutica.

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Notas

Notas de autor

rquiroz@inger.gob.mx

Información adicional

Link PubMed: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29624358

Enlace alternativo

http://revistamedica.imss.gob.mx/editorial/index.php/revista_medica/article/view/2398/2816 (pdf)