020 Trabajo Científico
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Recepción: 01 Febrero 2020
Aprobación: 01 Junio 2020
Resumen: Los defoliadores del pino se consideran una plaga forestal importante, que es subestimada por los daños que ocasionan la presencia de otras, como los descortezadores y plantas parásitas. Para el control de plagas, existen plantas bioactivas que pertenecen a la familia Solanaceae, dentro de las cuales se encuentra Datura metel L. por lo que el presente trabajo determinó la mortalidad en larvas de cuarto instar de N. autumnalis S. y establecer el nivel de toxicidad de los extractos metanólicos de hoja, tallo y raíz de D. metel, sobre poblaciones de Pinus leiophylla Schl. y Cham. Para ello, se evaluó la toxicidad de las hojas, tallo y raíz de los extractos metanólicos de D. metel (Solanales: Solanaceae), sobre larvas de cuarto instar de defoliador del pino N. autumnalis a diferentes concentraciones (1, 10, 50 y 100 mg/L) y se tomaron lecturas de mortalidad en intervalos de 2 h (0 a 24 h), a partir de la exposición de las larvas a los extractos metanólicos. El mayor efecto tóxico fue del extracto de raíz (86,0 % de mortalidad, CL50 de 3,68 mg/L), seguido por las hojas (83,3 %, CL50 4,98 mg/L), y tallo (80,0 %, CL50 de 12,79 mg/L), lo que es de gran utilidad para el manejo de la plaga forestal. Los extractos crudos de hojas, tallos y raíces de D. metel contienen alcaloides, los cuales interrumpen el ciclo de vida de las larvas de cuarto instar de N. autumnalis, por lo que pueden utilizarse como biocidas.
Palabras clave: Bosque, Datura metel, extractos, plaga, metabolitos secundarios.
Abstract: Pine defoliators are considered an important forest pest whose damage is underestimated due to the damage caused by others such as debarkers and parasitic plants. For the control of pests, there exist bioactive plants belonging to the Solanaceae family within which Datura metel is found. This work aimed to determine larvae mortality in the fourth instar of N. autumnalis and to establish the level of toxicity of leaf, stem and root methanolic extracts of D. metel, on populations of Pinus leiophylla Schl. y Cham. Thus, the toxicity of the leaf, stem and root methanolic extracts of D. metel L. (Solanales: Solanaceae) were evaluated on fourth instar larvae of the N. autumnalis S. pine defoliator at different concentrations (1, 10, 50 and 100 mg/L). Mortality values were recorded at every 2 h intervals (0 to 24 h) since the larvae were exposed to the methanolic extracts. The highest toxic effect was that on the root extract (86.0 % mortality, LC50 of 3.68 mg/L), followed by that on leaves (83.3 %, CL50 4.98 mg/L), and stem (80.0 %, LC50 of 12.79 mg/L), which is very useful for managing forests pests. The untreated extracts of leaves, stems and roots of D. metel contain alkaloids, which interrupt the life cycle of fourth instar larvae of N. autumnalis, so they can be used as biocides.
Keywords: Forest, Datura metel, extracts, pest, secondary metabolites.
1. INTRODUCCIÓN
El defoliador del pino Neodiprion autumnalis (Hymenoptera: Diprionidae), conocido como mosca sierra, se considera una plaga forestal importante ya que presenta altas tasas de defoliación sobre Pinus spp. y Juniperus spp., y su distribución se considera amplia en Norte América (Gaona et al., 2014; Ciesla y Smith, 2011). Presentan un hábito gregario para alimentarse, y en el cuarto estadio larval causan el mayor impacto consumiendo el arbolado (Sánchez et al., 2012). Los principales daños que producen son la reducción de la superficie fotosintética, alteración en el proceso de transpiración, reducción de la producción de resina hasta en un 50 %, reducción del tamaño de los anillos de crecimiento y la muerte del arbolado (Smith et al., 2012). El daño ocasionado por la mosca sierra ha sido subestimado debido a los impactos ocasionados en los bosques de pino por los descortezadores y plantas parásitas (Nolasco, 2014; Sánchez et al., 2012), lo cual ha repercutido en la salud forestal. Por lo anterior, se necesita aplicar un manejo integrado de plagas donde se incluya el uso de insecticidas orgánicos.
Las plantas son también fuente de productos metabólicos de importancia comercial que son usados para generar productos cosméticos, farmacéuticos, agroquímicos y de alimentos (Pérez-Alonso y Jiménez, 2011), las cuales están compuestas por dos tipos de metabolitos, clasificados en primarios que son utilizados para el crecimiento y los metabolitos secundarios, que no tienen una función aparente en el metabolismo primario. Éstos últimos tienen una implicación ecológica como parte del sistema de defensa de la planta contra los enemigos naturales (Ortíz et al., 2014). Dentro los metabolitos secundarios se encuentran los alcaloides, un grupo que cuenta con más de 15.000 metabolitos, que tienen en común tres características: 1) Son solubles en agua, 2) Contienen al menos un átomo de nitrógeno en la molécula y, 3) Tienen actividad biológica (Ávalos y Pérez - Urria, 2009).
Las plantas que pertenecen a la familia Solanaceae actualmente son utilizadas para el control de plagas, dentro de las cuales se encuentra D. metel, que contiene varios fitoquímicos neurológicamente activos (Murch et al., 2009), y es utilizado como fuente de narcóticos y medicamentos similares a la Atropa belladonna L. y a Datura stramonium L. (Dabur et al., 2004). Crece preferentemente en suelos nitrogenados, en los que abundan los nitratos y sales amoniacales, lo cual es importante para que las daturas produzcan alcaloides. La planta puede contener hasta 0,25 % de alcaloides, los cuales afectan directamente al sistema nervioso central de todos los vertebrados (Chirinos et al., 2011).
Los extractos de D. metel son efectivos en contra de bacterias, hongos, virus, protozoarios e insectos (García - Gutiérrez et al, 2012). Por lo tanto, el presente estudio tuvo como objetivo determinar la mortalidad en larvas de cuarto instar de N. autumnalis y establecer el nivel de toxicidad de los extractos metanólicos de hoja, tallo y raíz de D. metel, sobre poblaciones de Pinus leiophylla Schl. y Cham.
2. MATERIALES Y MÉTODOS
Colecta de material biológico
Se colectaron 30 plantas de D. metel de 1 m de altura, en el municipio de Nombre de Dios, Durango (23° 51' 32.89" N 104° 14' 41.56" W) y se trasladaron al laboratorio de la Universidad Politécnica de Durango, donde se realizó una separación de la raíz, hoja y tallo, después se pusieron a secar a la sombra a 25 ± 2 °C y HR de 75 ± 4 % durante una semana. Una vez secas, las muestras se pulverizaron en un molino eléctrico (Thomas Wley, modelo 4) hasta obtener partículas uniformes de aproximadamente 2 mm.
Se colectaron manualmente 1450 larvas de cuarto instar de N. autumnalis en árboles de P. leiophylla del Ejido los Bancos Pueblo Nuevo, Durango (23° 39' 3.35" N y 105° 44' 7.22" W) y se utilizaron 1350 para los bioensayos. Las larvas fueron depositadas en cajas plásticas de marca genérica, rectangulares de 20 cm por 30 cm y se alimentaron a base de follaje verde de la misma especie de pino.
Preparación de extractos y bioensayos
Para la extracción de los alcaloides se utilizó 500 mL de metanol por 24 h en condiciones de obscuridad, después se centrifugaron, y los sobrenadantes de los extractos crudos se concentraron por separado a sequedad en un roto-evaporador. Los líquidos viscosos que se obtuvieron se alcalinizaron con hidróxido de amonio (NH4OH) a un pH de 9. Cada muestra se extrajo con 250 mL de cloroformo. Los alcaloides se obtuvieron de la solución de cloroformo con ácido sulfúrico (H2SO4) 1N en forma fraccionada. Una vez obtenidos los extractos crudos, de nuevo se llevaron a desecación por roto-evaporación a vacío, los cuales constituyeron los extractos concentrados de alcaloides.
El extracto clorofórmico fue sometido a ensayos cualitativos, haciéndolos reaccionar con los reactivos de Dragendorf, Mayer y Wagner (Aguilar et al.,2007), aplicando cuatro gotas de cada reactivo sobre los extractos de hoja, tallo y raíz por separado. La coloración obtenida en cada caso varió de acuerdo al reactivo y permitió confirmar la presencia de los alcaloides.
Se evaluaron 15 tratamientos: (1, 10, 50 y 100 mg/L), por estructura de la planta utilizando, raíz, tallo, hoja, más un tratamiento testigo (control) a base de agua destilada. Se utilizaron 450 larvas para cada repetición (se realizaron tres repeticiones), para ello se utilizaron en total 1.350 (30 larvas por 15 tratamientos por tres repeticiones). La aplicación de los extractos fue por aspersión, se aplicó con ayuda de un atomizador marca Canyon mediante aspersión manual, y el volumen asperjado total fue de 5 mL por caja (20 cm x 30 cm); Se realizaron lecturas de mortalidad en intervalos de 2 h hasta 24 h de exposición. Se consideraron muertas aquellas larvas que no presentaban movilidad, movimientos anormales o la ausencia de reacción al someter presión en el dorso con un pincel, las larvas consideradas muertas fueron retiradas para evitar posible contaminación (Leal, 2011).
Análisis estadístico
La mortalidad de larvas por tratamiento y repetición fueron sometidos a un análisis de varianza de acuerdo a un diseño completamente al azar con tres repeticiones y las medias aritméticas fueron comparadas por la prueba de Tukey al 5 % de probabilidad. Para el análisis de los datos de las pruebas de toxicidad se calculó la concentración letal media (CL50), con la interpolación lineal de los valores del porcentaje de mortalidad por cada concentración, para ello se utilizó el programa MS-Excel® (Raj, 2010), para el análisis estadístico se utilizó la mortalidad corregida por la fórmula de Abbott.
Donde:
Pc = Porcentaje de mortalidad corregida.
Po = Porcentaje de mortalidad observada.
Pt = Porcentaje de mortalidad en el testigo.
El cálculo de la regresión dosis-mortalidad, así como los estimados de los límites de confianza, se realizaron de acuerdo al análisis Probit. Los probits de trabajo (Yw) se derivan de la ecuación de regresión de la siguiente manera:
Donde:
Y = Probits esperados
P = Proporción esperada
El grado de toxicidad de los alcaloides, fue definido en función a la clasificación de toxicología de Ramírez y Lascaña (2001), ver Tabla 1.
Escala de toxicidad del extracto
3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La Tabla 2 muestra el peso inicial de cada estructura, así como el rendimiento total de extracto crudo. El total de materia seca obtenida fue de 3,15 kg de D. metel. El mayor rendimiento de extracto obtenido se obtuvo de la raíz a pesar de que el tejido húmedo presentó menor peso, seguido por la hoja y el tallo, esto debido al metabolismo del vegetal y composición fitoquímica (Domínguez et al., 2010). El extracto crudo de alcaloides obtenido fue de 527 g (51,5 %), por lo que se considera una planta altamente tóxica, ya que su composición presenta más de 0,05 % de alcaloides con base al peso seco (Jaramillo et al., 2016). Por otro lado, cada estructura analizada de la planta resultó ser positiva en el análisis cualitativo con los tres reactivos aplicados (Dragendorff, Meyer y Wagner). Es decir, se visualiza la presencia de metabolitos secundarios (alcaloides), debido a que se formaron precipitados, al reaccionar las gotas en cada muestra, evidenciando la presencia de alcaloides en los extractos metanólicos del género Datura lo cual coincide con Bofil et al. (2007) y Ríos (2013).
Pruebas cualitativas de la presencia de alcaloides y rendimiento obtenido para cada extracto de D metel
En la Tabla 3 se muestra la mortalidad causada por los extractos de cada estructura a las diferentes concentraciones empleadas. Se observó elevada mortalidad de larvas de N. autumnalis en cada concentración aplicada, la cual pudo haber sido provocada por los alcaloides presentes en el extracto que afectan directamente al sistema nervioso de los insectos, lo que inhibe su crecimiento y a mayores concentraciones les ocasionan la muerte. También, inducen la muda, causa malformaciones o impiden su desarrollo, interfiere en la comunicación sexual, reduciendo la cópula y oviposición o provocan esterilidad en adultos; por tanto, pueden ser parte de algunas estrategias de control, (Bisset et al., 2009; García y Tarango 2009; García - Gutiérrez et al., 2012; Soler et al., 2013).
Porcentaje de mortalidad obtenida para cada estructura y concentración aplicada del extracto de D metel
Los metabolitos secundarios extraídos por maceración, con metanol, mostraron una alta actividad insecticida como lo reportaron Hincapié et al. (2008), especialmente en las dos concentraciones más altas de cada estructura vegetal utilizada. Además, cada tratamiento aplicado mostró diferencia significativa entre los tratamientos respecto al testigo (P < 0,05). La estructura que presentó mayor mortalidad fue la raíz la cual mostró una gran efectividad a los 100 mg/L, seguidas de la hoja y el tallo (Tabla 4).
Diferencias significativas entre extractos de D. metel, estructuras y concentraciones aplicadas a las larvas de N. autumnalis.
Las letras distintas significan diferencias estadísticas de los valores de eficacia entre concentraciones y estructuras de la planta.
Las letras distintas significan diferencias estadísticas de los valores de eficacia entre concentraciones y estructuras de la planta.
Al igual que en la tabla anterior, en la tabla 5 se presenta evidencia de la actividad biocida de los alcaloides presentes en la planta; se registró menor consumo de alimento en algunas larvas y el resto que se alimentó presentó intoxicación, provocándoles la muerte. El propósito de determinar la toxicidad de los alcaloides fue conocer la CL50 y CL90expresada como una concentración del bioplaguicida que puede lograr 50 % y 90 % de mortalidad entre las larvas de N. autumnalis (Badii y Landeros, 2007). Esto permitió observar el grado de toxicidad de D. metel que va de una categoría de muy tóxica a moderadamente tóxica (p < 0,05), para la hoja, tallo y raíz. Además, como se visualiza en la Tabla 5 la raíz requirió la concentración más baja para alcanzar la CL50.
Concentración letal media CL50 de los extractos de D metel y la toxicidad mostrada sobre larvas de N autumnalis
El análisis Probit para la medición de la concentración letal (CL50) de D. metel, mostró la proporción de mortalidad larvaria en unidades probit por la función de sus respectivas dosis, desarrollados hasta las 24 h. Todos los gráficos muestran un patrón de respuesta uniforme sobre las concentraciones aplicadas para cada estructura. Sin embargo, en el tallo se observa que la pendiente es menos pronunciada debido a que ocasionó menor mortalidad en comparación con las otras dos estructuras evaluadas (Figura 1).
Figura 1
Mortalidad probit observada por el logaritmo de las concentraciones a las 24 h, empleando el extracto metanólico de las a) raíces, b) tallos y c) hojas de D. metel.
Los extractos de D. metel son excelentes antimicrobianos y se han probado sobre: Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Escherichia coli, Salmonella typhi, Shigella flexneri, Klebsiella pneumoniae, Vibrio cholerae y Pseudomonas aeruginosa (Siva et al., 2011; Gaire y Subedi, 2013; Hossain et al., 2014). También son efectivos en el combate contra insectos plaga, ya que se han reportado efectos semejantes de extractos de D. metel, aplicados sobre saltamontes y hormigas produciendo de 20 % a 60 % de mortalidad y que además en concentraciones altas es más tóxico (Kuganathan y Ganeshalingam, 2011), a su vez Tandon y Sirohi (2010), demostraron que D. metel provoca una mortalidad entre 19 % y 54 % sobre larvas de Culex quinquefasciatus.
Los niveles de infestación son cada vez mayores, ya que el ataque de N. autumnalis se ve favorecido por el cambio climático debido a que los pinos en Durango están pasando por un estrés hídrico (Ciesla y Smith, 2011; Jactel et al., 2011; White, 2014). Consecuentemente, es necesario realizar una búsqueda de alternativas sustentables y eficaces para el manejo de la mosca sierra (Orozco - Santos et al., 2016), debido a que se considera una plaga de principal importancia.
4. CONCLUSIONES
Los extractos crudos de hojas, tallos y raíces de D. metel contienen alcaloides, los cuales producen mortalidad e interrumpen el ciclo de vida de las larvas de cuarto instar de N. autumnalis, por lo que pueden utilizarse como biocidas. El extracto de la raíz presentó los mejores resultados para el control de las larvas, ya que con una baja concentración se puede combatir al 50 % y 90 % de la población (CL50 3,68 mg/L y CL90 210,39 mg/L), seguidos por los extractos de hoja y tallo. Con base en los resultados, se sugiere realizar evaluaciones en campo para determinar el eventual empleo de este tipo de sustancias para el control de la mosca sierra y otros insectos plaga de importancia económica.
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