Evaluación del efecto de tres hidróxidos en la calidad de diafanización de peces de cola de espada (Xiphophorus helleri)

Evaluation of three hydroxides on the quality of swordtail fishes diaphanization Xiphophorus helleri

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La producción de peces ornamentales ha sido uno de los más rentables tipos de acuacultura (Tamaru y cols., 2001). Es innegable que la producción de peces de ornato ha tenido un impacto positivo en la economía global, en particular en países en desarrollo donde esta actividad es un importante generador de empleos e ingresos (Ramírez y cols., 2010). Por ello el conocimiento que se obtenga, en diversos aspectos de los peces de ornato dará opciones para la mejora de su manejo; los peces ornamentales, como el pez cola de espada, han sido estudiados desde diversos enfoques; entre ellos su anatomía.

En México, el pez cola de espada debido a su marcado dimorfismo sexual (que en machos se caracteriza por la extensión ventral de la aleta caudal, llamada cola de espada) y su coloración tiene demanda en este mercado (Lazcano-Barrero, 1992).

Es un pez fusiforme, de entre 7 y 10 cm, presenta cráneo alargado y columna vertebral dividida en 15 torácicas y 14 caudales; de las cuales salen 31 espinas neurales, 31 hemales y 15 costillas. Además, la facilidad de su manejo, mantenimiento, reproducción y tamaño hace que estos peces sean ampliamente utilizados como sujetos de experimentación (Marañón, 1999). Uno de ellos, es el sistema óseo, característica principal de los vertebrados, por ello nos hemos centrado en estudiar y aplicar diferentes técnicas que muestren el esqueleto sin dañar los huesos ni cambiar el arreglo estructural con la finalidad de observarlos y estudiarlos. Por ello, en este trabajo se utiliza la técnica de diafanización o transparentación propuesta por Dawson (1926) y modificada por Gersenowies y Sánchez en 2010.

La técnica de diafanización de Dawson (1926), que ha sido empleada desde los años 70 (Cortés-Delgado y cols., 2009) permite evidenciar el hueso para su estudio (Rodríguez, 2012). Usa el aclaramiento del músculo a través de la digestión alcalina con hidróxidos y rojo de alizarina con el fin de teñir los huesos, el cual es un colorante que se fija a los fosfatos de calcio que se encuentran en el hueso (Cortés-Delgado y cols., 2009).

La técnica original de Dawson (1926) utiliza hidróxido de potasio (KOH) para conseguir el efecto mencionado; sin embargo, existen técnicas modificadas como es el caso de Pérez y Sánchez en 1983, donde cambiaron la técnica original por hidróxido de sodio (NaOH) al 3% y 10% de formol, dando mejores resultados en organismos pequeños. Otra variación es la que se hizo en la “Técnica modificada de Dawson”; donde se sumerge al espécimen en KOH con aclaramiento en hidróxido de amonio (NH₄OH) junto con glicerina (Coronado, 2014). Aunque se han realizado distintas modificaciones a la técnica de diafanización de Dawson, pocos artículos mencionan las propiedades que tienen los hidróxidos y colorantes que se utilizan en la técnica por lo que los mencionaremos brevemente a continuación.

El KOH es una sustancia fuertemente alcalina que al disolverse en agua genera calor por lo que puede ocurrir una vigorosa reacción que lo vuelve corrosivo, lo cual resulta útil en este tipo de trabajos (Coronado, 2014).

Una solución de NaOH permite la observación por diafanización, y sirve para ablandar el tejido, además no solo mantiene la forma y tamaño, sino que también hace desaparecer las inclusiones celulares que no permiten observar con claridad los haces musculares (Dawson, 1926).

Tomando en cuenta que la presión de vapor del NH₄OH es alta este tiende a evaporarse, y por tanto la solución disminuye la concentración del hidróxido y el efecto puede no ser el esperado.

El rojo de alizarina (1,2-dihidroxiantraquinona) es un colorante que se obtiene de la raíz de la rubia y es utilizado en ensayos bioquímicos para determinar cuantitativamente por colorimetría, la presencia de deposición calcificada por las células de un linaje osteogénico, los depósitos de calcio en el sistema vascular, crecimiento y edad del hueso (Coronado, 2014). Esta técnica se fundamenta en la formación de complejos poco solubles y coloreados entre algunos colorantes y metales en estado iónico como calcio (González, 2011).

El objetivo de este trabajo fue utilizar diferentes soluciones aclarantes a base de KOH, NH₄OH y NaOH, para observar y comparar sus efectos sobre la diafanización del pez óseo cola de espada Xiphophorus helleri .

Se trabajaron 250 ejemplares de pez cola de espada Xiphophorus helleri , divididos en 4 grupos para el manejo de los diferentes hidróxidos. Fueron sacrificados sumergiéndolos en agua fría con éter para posteriormente realizar el siguiente procedimiento:

1. a) Se colocaron en formol al 4% neutralizado con borato de sodio durante 24 h, para el proceso de fijación. Se lavaron y dejaron en agua por otras 24 h. Se tomaron medidas morfométricas (cm) (Fig. 1 y Tabla 1). Se evisceraron y descamaron.

2. b) Se realizó una deshidratación del organismo mediante un tratamiento con etanol en concentración ascendente (20%, 40%, 60%, 80%, 90% y 96%, durante 24 h cada uno).

3. c) Proceso de Diafanización: se dividieron en 4 grupos. El primer grupo se colocó en KOH al 4% durante 72 h, el segundo grupo fue en NH₄OH al 4% durante 3 semanas, el tercero en NaOH al 4% por 12 h y el cuarto en NaOH al 2% también por 12 h. A todas las soluciones se les agregó 0,01 g de Rojo de Alizarina para la tinción del tejido óseo.

   Una vez terminado el proceso de diafanización se colocaron en un tren ascendente de glicerina (20%, 40%, 60%, 80%, 90% y 100% 24 horas en cada uno) para terminar el aclarado del tejido muscular.

Figura 1
Pez cola de espada completo en el cual se indican las medidas morfométricas.

Tabla 1
Medidas morfométricas tomadas.

A continuación, se presentan los valores promedio de las medidas morfométricas (cm) de los 250 peces cola de espada sometidos al proceso de diafanización (Tabla 2):

Tabla 2
Valor promedio de las medidas morfométricas (cm) del pez cola de espada sometido a diferentes tratamientos de diafanización.

En el proceso de evaluación de los resultados del proceso de diafanización con los cuatro diferentes tratamientos observamos lo siguiente:

Tratamiento con KOH

Tras el tratamiento de KOH 4%, se observó que el tono muscular del pez es más firme que en el caso de los otros dos hidróxidos.

La transparentación con KOH permitió apreciar el esqueleto completamente teñido y bien definido, lo que facilitó observar cada uno de los huesos (Figs. 2 y 3).

Figura 2
Región cefálica del pez cola de espada con el tratamiento de KOH.

Figura 3
Pez cola de espada transparentado con el tratamiento de KOH.

Tratamiento con NH₄OH

Uno de los aspectos importantes a considerar es que durante el tratamiento con NH₄OH en los peces se observó un incremento en el volumen corporal; por múltiples causas, como puede ser el cambio en la presión osmótica. Asimismo, hubo cambio de coloración: color lila opaco sin diafanización, aspecto único observado con el empleo de este hidróxido (Fig. 4).

Figura 4
Pez cola de espada durante el tratamiento con NH₄OH. Se observa el cambio de coloración y el aumento de volumen en la musculatura.

Figura 5
Pez cola de espada transparentado con el tratamiento de NH₄OH.

Figura 6
Región cefálica del pez cola de espada con el tratamiento de NH₄OH.

Para continuar con el procedimiento se pasaron a la glicerina y se transparentaron en un periodo de dos semanas más. Esto difiere del proceso con KOH.

Después de terminado el procedimiento, se observó el esqueleto de manera definida y con la coloración homogénea en todas partes del organismo. La musculatura perdió firmeza, lo cual los volvió frágiles (Figs. 5 y 6).

Tratamiento con NaOH 4%

Después de transcurrir las 12 horas se completó la tinción. El tratamiento con NaOH 4% fue el más eficaz; sin embargo, el tejido muscular perdió rigidez volviendo frágiles a los organismos y fragmentándolos en algunos casos. Su esqueleto tomó una coloración rojiza homogénea (Figs. 7 y 8).

Figura 7
Pez cola de espada transparentado y fragmentado con el tratamiento de NaOH 4%.

Figura 8
Región cefálica del pez cola de espada con el tratamiento de NaOH 4%.

Tratamiento con NaOH 2%

Con el fin de contrarrestar el efecto dañino de NaOH 4% se optó por reducir la concentración a 2%. Sin embargo, los resultados no fueron los esperados: se obtuvo poca tinción de los huesos, no se consiguió la diafanización y el tejido muscular nuevamente perdió firmeza. De modo que no hubo éxito aparente en el uso de este hidróxido (Figs. 9 y 10).

Figura 9
Pez cola de espada transparentado con el tratamiento de NaOH 2%.

Figura 10
Región cefálica del pez cola de espada con el tratamiento de NaOH 2%.

Comparación

Con base en la Tabla 2 los resultados nos permiten afirmar la diferencia en la calidad de diafanización aplicando los distintos tipos de hidróxido. Los óptimos fueron con el tratamiento de hidróxido de potasio, siendo el más eficiente: mejor calidad, y rapidez en el proceso; a diferencia del hidróxido de amonio, el cual tomó cerca de un mes y, aun así, los resultados no fueron los esperados, hubo coloración en los huesos pero el tejido muscular se dañó. Los resultados menos satisfactorios se obtuvieron con el tratamiento de hidróxido de sodio 4%, ya que en un lapso de 12 horas los peces tomaron coloración morada, pero el tejido muscular comenzó a deshacerse y desprenderse lejos de diafanizarse, lo cual generó peces en un estado poco útil para su posterior estudio. Para mejorar la calidad en la diafanización con NaOH, se trabajó como alternativa experimental el cuarto grupo al 2% durante 6 horas; a pesar de ello no se consiguió la transparentación, pues también quedaron destruidos y los huesos no alcanzaron el color esperado, por lo que no fueron organismos útiles para estudios anatómicos (Tabla 3).

Al observar la tabla podemos ver las tres etapas del proceso de diafanización en cada uno de los aclarantes probados en este trabajo, de manera comparativa. Como se puede ver, en el caso del KOH no hay cambios significativos, desde el inicio hasta el final del proceso se conserva la forma del pez, mientras que en el caso del NH₄OH desde el inicio presenta un cambio evidente en su estructura y coloración. En el intermedio aumenta su volumen y al finalizar el proceso el volumen se ve disminuido y con poca coloración en los huesos. En el tratamiento con NaOH 4% el daño al tejido muscular es notable desde el inicio, pero al intermedio del tratamiento el efecto ha dañado el tejido muscular casi en su totalidad, y al final, la pérdida del músculo ocasiona que se pierdan elementos óseos, como en este caso, las aletas y costillas. A pesar de que se redujo la concentración del NaOH desde el inicio también se ve el daño al tejido muscular; en el intermedio aun es evidente el daño, al final no es tan agresivo como en NaOH 4%, por lo que no se pierden elementos óseos pero pierde la forma.

Tabla 3
Comparación de los tratamientos durante la diafanización.

Los tres hidróxidos que se usaron con la misma concentración tiñeron los huesos, pero no en todos los casos hubo diafanización del músculo.

De acuerdo con Dawson, el NaOH es recomendado para la diafanización en plantas y vertebrados de mayor tamaño que el pez cola de espada, produciendo resultados satisfactorios. Sin embargo, en el presente trabajo duró menos de un día; fue muy agresivo para el músculo y lo digirió completamente llegando a desarticular los huesos. Tomando en cuenta que el hidróxido de sodio en ambas concentraciones, dañó el tejido y ocasionó que se deshiciera, este tratamiento resultó poco útil para organismos de la talla y contenido de grasa, equivalentes a las del pez empleado en este estudio.

Al contrario de los resultados obtenidos por Rivera y cols. en 2014 (NH₄OH con glicerina), en este trabajo (NH₄OH 4%) el proceso llevó más tiempo y los resultados no fueron satisfactorios. Al igual que Coronado en 2014, por lo tanto, no recomendamos el empleo del NH₄OH al 4%, para fines equivalentes a los del presente estudio. O en su defecto, se sugiere incrementar la concentración del hidróxido, o bien emplearlo en otro tipo de vertebrados.

Consideramos que dados los resultados el mejor tratamiento es el de hidróxido de potasio al 4%, porque no solo tiñó al esqueleto del pez sino también se diafanizó el músculo sin que perdiera su tono muscular ni su estructura en general, generando un organismo completo para el estudio anatómico. Cabe mencionar que se tuvo ventaja en cuanto al tiempo de diafanización (que fue de 3 días); a comparación de otros trabajos, como en el artículo elaborado por Tamayo y cols. en 2012, quién también obtuvo una diafanización exitosa pero su proceso de transparentación con KOH al 2% fue de 8 ocho días.

Los tres tratamientos son efectivos para lograr la tinción de los huesos. Por el contrario, el proceso de diafanización del músculo fue diferente.

El tratamiento de NH₄OH no es recomendable para estos peces. Se consiguió la transparencia muscular pero el organismo perdió rigidez debido al exceso de tiempo en el hidróxido.

El grupo en el que se usó NaOH fue rápido más no efectivo. El hidróxido es muy agresivo, y a pesar de que se redujo la concentración no hubo mejoría en los resultados finales. Podría ser recomendable en organismos de mayor talla.

Finalmente, con el tratamiento de KOH se obtuvieron los resultados más favorecedores: transparencia, tinción ósea y tratamiento de menor duración.