Introducción

Los espermatozoides de los teleósteos difieren de otros vertebrados en características como forma de la cabeza, longitud, posición del flagelo, número de mitocondrias y ausencia generalizada del acrosoma (Lahnsteiner y Patzner, 2008). Una característica de los espermatozoides con fecundación externa es que son inmóviles aún después de la espermiación y su activación metabólica depende del medio acuático, determinada por la concentración de iones característicos de cada especie en conjunto con la osmolaridad, a través de una gama de mecanismos, modulada por la membrana, aumento de pH intracelular y alteración del gradiente intracelular que permite, iniciar la movilidad para fecundar al óvulo (Browne et al., 2015; Lahnsteiner y Patzner, 2008).

Por tanto, el conocimiento de la fisiología del espermatozoide es esencial para la conservación del germoplasma a través de la criobiología, herramienta biotecnológica que permite el mantenimiento de gametos a largo plazo con numerosas aplicaciones como: i) selección genética, ii) conservación de especies silvestres y amenazadas, iii) sincronización y disponibilidad de gametos aún fuera de la etapa reproductiva, iv) reducción del número de reproductores en especies cultivadas y v) disminución en la transmisión enfermedades de tipo parasitario (Dietrich et al., 2014; Öğretmen et al., 2016).

La criopreservación de espermatozoides ha sido estudiada en más de 200 especies de peces y crustáceos obteniendo resultados favorables pero variables (Ciereszko et al., 2013; Dietrich et al., 2014; Nahiduzzaman et al., 2012), por lo que, cada protocolo es específico para la especie de interés y en algunos casos se alcanzan tasas de fertilización cercanas a las de semen fresco (Medina et al., 2005).

Por lo anterior, debido a que la criopreservación de espermatozoides involucra procesos intracelulares que afectan la supervivencia y la capacidad fecundante, el objetivo de la presente revisión es dar a conocer la fisiología del espermatozoide de teleósteos y proponer la aplicación de protocolos para su criopreservación.

Espermatozoide de teleósteos

El espermatozoide tiene la función de transportar el material genético al ovocito para lo cual está equipado con estructuras como: cabeza, pieza media y flagelo, la cabeza, contiene el núcleo y por lo tanto el ADN paterno, en la pieza media se inserta el flagelo que varía en longitud (Eddy, 2006).

Una característica distintiva en los teleósteos son las mitocondrias que varían en número, por lo regular se ubican en la pieza media, aunque en algunos peces se pueden localizar cerca del núcleo. No obstante, e independientemente de su posición, su función es suministrar la energía necesaria para el movimiento flagelar. Todas estas características han permitido estudiar y comparar la ultraestructura en múltiples teleósteos (Lahnsteiner y Patzner, 2008).

Espermatogénesis

La célula germinal masculina se produce en la gónada, testículos, que en los teleósteos son estructuras saculares pareadas en posición ventral a la vejiga natatoria, por su estructura histológica se reconocen dos tipos: lobulares y tubulares (Rodríguez, 1992).

La espermatogénesis es el proceso en el cual las espermatogonias crecen, se dividen por meiosis, y se diferencian en espermatozoides (Billard et al., 1982). La duración en los teleósteos se ve influenciada por la temperatura del agua y es corta en contraste con los mamíferos (Nóbrega et al., 2009).

De acuerdo con Carrillo et al. (2009) y Grier y Uribe (2009), la espermatogénesis se puede dividir en dos etapas:

· Etapa 1: Proliferación. Consiste en la proliferación mitótica de las espermatogonias que dan origen a los espermatocitos primarios, éstos entran en meiosis I dando lugar a dos células llamadas espermatocitos secundarios, que ya son haploides y al dividirse, en la meiosis II, generarán cuatro espermátidas también haploides, que suelen ser de morfología variable.

· Etapa 2: Maduración o espermiogénesis. En esta etapa las espermátidas se diferencian en espermatozoides, pierden citoplasma, conservan mitocondrias y núcleo y a partir del centriolo desarrollan el flagelo.

Una vez maduros, los espermatozoides son liberados del testículo y se acumulan en el conducto eferente, listos para ser expulsados al medio exterior y fertilizar a los gametos femeninos.

En el testículo también se encuentran células somáticas denominadas:

· Células de Sertoli: Ubicadas dentro de los túbulos seminíferos, conocidas también como células nodrizas, debido a que se encargan de dar soporte estructural y nutritivo, sintetizan proteínas como las fijadoras de andrógenos (ABP: por sus siglas en inglés, Androgen Binding Protein) necesarias para transportar esteroides a través del torrente sanguíneo hacia las células blanco, además de otras proteínas como la inhibina y activina. Las células de Sertoli también actúan como barrera para impedir el contacto entre las células germinales y el sistema vascular, así como de fagocitar residuos de espermatozoides (Grier y Uribe, 2009; Rodríguez, 1992; Tabares et al., 2005).

· Células de Leydig: ubicadas en la periferia de los túbulos, su función principal es la síntesis de testosterona, así como producir otros esteroides necesarios para la espermatogénesis y la expresión de caracteres sexuales secundarios (Grier y Uribe, 2009; Rodríguez, 1992; Tabares et al., 2005).

Morfología del espermatozoide

La estructura del espermatozoide en teleósteos revela alta diversidad morfológica, la cual se refleja en la forma y dimensión de la cabeza; número, forma y localización de las mitocondrias; la forma y tamaño de la fosa nuclear y del núcleo; el arreglo de los centriolos para formar la pieza media y número de flagelos (Figura 1) (Lahnsteiner y Patzner, 2008).

Los espermatozoides de algunas especies presentan cabeza esférica, ovoide o alargada, la forma del núcleo es variable y ésta relacionada con la complejidad de la espermatogénesis y espermiogénesis (Billard, 1986; Billard, 1990a; Grier, 1981; Lahnsteiner y Patzner, 2008; Rodríguez, 1992).

La pieza media está formada por un flagelo rodeado por una vaina mitocondrial; el número de mitocondrias presentes es dependiente de la especie y del hábitat reproductivo (Coward et al., 2002). El flagelo consta de un cilindro delgado y largo que sobresale de la cabeza, con un rango de 25-100 μm de longitud y 0,4-1 μm de diámetro, el cual contiene: el axonema, principal organelo activo responsable del movimiento del espermatozoide (Ulloa-Rodríguez et al., 2017) y en algunos peces como los de la familia Apogonidae esta reportada la presencia de dos flagelos (Lahnsteiner y Patzner, 2008).

Los flagelos se forman por el axonema compuesto por 9 microtúbulos dobles en la periferia y dos microtúbulos centrales, formando la estructura clásica 9+2 pares de microfibrillas y una membrana plasmática que confiere al espermatozoide la capacidad dinámica para regular diferentes actividades celulares y rutas de señalización que pueden conducir a la activación de la movilidad (Tabares et al., 2005; Warner y Satir, 1974), además de formar una especie de aleta en el plano horizontal confiriéndole una forma acintada (Cosson et al., 1999). Tabares et al. (2005) reportaron que es posible que esta estructura se haya formado evolutivamente para favorecer el movimiento del espermatozoide bajo ciertas condiciones acuosas.

En los teleósteos la espermiogénesis de acuerdo con Wootton y Smith (2014), se clasifica en tres tipos, atendiendo la posición del flagelo con relación al núcleo.

· Tipo I: Los centriolos migran aproximándose al núcleo, arrastrando tras de sí al flagelo y a la membrana celular, formándose el canal citoplasmático. En la superficie nuclear se forma una hendidura y el núcleo gira 90º con respecto al axonema del flagelo; los centriolos se dirigen adentro de la fosa, alojándose total o parcialmente, teniendo como resultado que el eje del flagelo sea perpendicular al núcleo.

· Tipo II: No hay rotación nuclear, el diplosoma migra en la dirección del núcleo, pero no entra en la fosa, y el flagelo se ubica asimétricamente.

· Tipo III: El flagelo es central, no hay rotación nuclear, tampoco hay formación de la fosa nuclear ni del canal citoplasmático (Madhavi et al., 2015; Quagio y Olivera, 2008).

Por otra parte, la cabeza, se diferencia de otros vertebrados por la carencia de acrosoma, adaptación funcional por la presencia del micrópilo en el ovocito (Bustamante et al., 2016), orificio que permite la entrada del espermatozoide al óvulo y producir la singamia (Ramírez-Merlano et al., 2010). No obstante, hay reportes de presencia de acrosoma en Sarcopterigios, que corresponden a los peces con aletas lobuladas de las subclases: Actinistia, Cladistia y Dipnoi o peces pulmonados, y dentro de los Actinopterigios están los Chondrostei, peces con esqueleto principalmente cartilaginoso y escamas de tipo ganoide, como el peje lagarto (Lahnsteiner y Patzner, 2008).

De acuerdo al tipo de fertilización, interna o externa, los espermatozoides de los teleósteos pueden dividirse en dos grupos: introespermatozoides y aquaespermatozoides (Jamieson, 1991; Tabares et al., 2005). En familias con desarrollo vivíparo y fertilización interna, por ejemplo, Cottidae, Embiotocidae o Poecilidae, el espermatozoide es del tipo introespermatozoides; que en general poseen un núcleo alargado y una pieza media relativamente grande con numerosas mitocondrias; la cabeza mide alrededor de 10 µm, la pieza media 5 µm y el flagelo entre 30 a 40 µm. Aunque, algunas especies con fecundación interna como en la familia Goodeidae (Sebastiscus marmoratus; Cuvier, 1829) presentan espermatozoides con morfología similar a los de fertilización externa (Lahnsteiner y Patzner, 2008).

Los espermatozoides de fecundación externa, los aquaespermatozoides, tienen una organización más simple. En su mayoría presentan cabeza ovoide o esférica que mide 5 µm en su extensión máxima, la pieza intermedia es pequeña y mide 2-4 µm de longitud y contiene pocas mitocondrias, entre 1-6 y flagelo entre 30 a 40 µm (Lahnsteiner y Patzner, 2008).

Capacitación espermática

Los espermatozoides de mamíferos maduran y adquieren movilidad durante el paso a través del epidídimo. Métodos similares de maduración y adquisición de la movilidad espermática se han reportado en algunos peces (Inaba, 2008).

En general, los espermatozoides en los peces, obtienen la capacidad fecundante durante la migración espermática a lo largo del conducto eferente, que se acompaña con la producción de plasma seminal con pH básico y rico en bicarbonato (HCO₃^-) que hidrata al espermatozoide (Mochida et al., 1999; Schulz y Miura, 2002).

La hidratación y migración de los espermatozoides también están reguladas por el sistema endocrino y aunque los espermatozoides en el testículo han completado la espermiogénesis, en algunas especies todavía son incapaces de fertilizar al óvulo (Schulz y Miura, 2002).

Los espermatozoides de peces con fecundación externa se encuentran inmóviles en el testículo y en el conducto espermático y solo al tener contacto con un medio acuoso se vuelven metabólicamente activos, ya que responden a condiciones fisicoquímicas como cambios en la presión osmótica, balance iónico, temperatura y pH, perdiéndose pocos segundos después (Alavi y Cosson, 2005;2006; Bustamante et al., 2016). Los medios que son hiper o hiposmóticos con relación al líquido seminal desencadenan la movilidad de los espermatozoides en teleósteos y se determina a través de la sensibilidad a la osmolaridad y concentraciones iónicas. Este fenómeno está relacionado con las actividades de canales iónicos en la membrana y gobierna los mecanismos de movilidad de los axonemas (Alavi y Cosson, 2006).

De acuerdo con Alavi y Cosson (2006) en Salmonidae y Acipenseridae los iones de K⁺ son clave en la movilidad en combinación con la presión osmótica y en otras especies la movilidad se evita cuando la presión osmótica es alta como en la familia Cyprinidae, o baja en peces marinos.

Los cationes, principalmente divalentes, tales como Ca²⁺ son antagonistas con el efecto inhibidor de K⁺ sobre la movilidad (Alavi y Cosson, 2006). En muchas especies, el influjo de Ca²⁺ y el flujo de K⁺ o Na⁺ a través de canales iónicos específicos cambian el potencial de membrana y eventualmente conducen a un aumento en la concentración de AMPc en la célula, que constituye la iniciación de la movilidad a partir de la osmolaridad, presión osmótica y concentraciones de iones de K⁺, Ca²⁺, Na⁺, HCO₃^- y Mg²⁺ (Alavi y Cosson, 2006).

Inhibición y activación de la movilidad espermática

La osmolaridad y la composición iónica del plasma seminal previenen la movilidad en los conductos espermáticos y es dependiente de cada especie (Billard, 1986).

El plasma seminal no sólo inmoviliza a los espermatozoides, también proporciona los nutrientes necesarios para el metabolismo, así como su protección (Ingermann, 2008). Las mitocondrias, hasta entonces, se encuentran con bajo potencial de membrana con el fin de preservar las pocas reservas energéticas y disminuir la formación de compuestos de oxidación endógenos que pondrían en riesgo la integridad de membranas o compuestos citoplasmáticos (Alavi y Cosson, 2006; Tabares et al., 2005).

Por lo tanto, la movilidad de los espermatozoides de peces de tipo aquaespermatozoides depende de la osmolaridad y ionicidad del agua, debido a que los activan a través de una serie de mecanismos que incluyen el cambio y función de la morfología de la membrana celular, aumento del pH intracelular y alteración del gradiente entre concentración extra e intracelular de iones y osmolitos (Alavi y Cosson, 2006; Browne et al., 2015).

En algunos cíclidos como la tilapia (Oreochromis niloticus Linnaeus, 1758) se ha detectado la presencia de un factor de inmovilización del espermatozoide en el plasma seminal, una glicoproteína de alto peso molecular denominada SPPI 120, Mr = 120.000, que es secretada por las células de Sertoli y células epiteliales del conducto espermático, y que también está unida a la cabeza del espermatozoide (Mochida et al., 1999).

La SPPI 120 existe en plasma seminal, como homopolímero de Mr = 1.000.000, por lo cual, la cuantificación de ésta glicoproteína puede ser un parámetro de calidad del espermatozoide (Ciereszko, 2008).

La activación de la movilidad, implica la respuesta a los cambios iónicos, que conducen en última instancia a la transducción de señales intracelulares y finalmente, la maquinaria móvil, el axonema, que es activado mediante la fosforilación de las subunidades asociadas con las dineínas responsables de la conversión de energía química de hidrólisis de ATP a energía mecánica para llevarla a cabo, la cual es dependiente del número de mitocondrias y de las reservas energéticas disponibles (Browne et al., 2015; Gagnon y de Lamirande, 2006; Inaba, 2008).

La criopreservación en el contexto de la reproducción

La criobiología es la ciencia que trata de conservar la vida a bajas temperaturas, la cual frena o ralentiza los procesos biológicos. La posibilidad de suspender la actividad celular durante un tiempo indefinido y lograr una posterior activación ha sido una herramienta fundamental para la conservación y reproducción de numerosas especies.

La criopreservación del semen en peces implica, en primer lugar, mezclarlo con diluyentes que eviten la activación espermática y, segundo la utilización de crioprotectores que minimicen el daño que producen los cristales de hielo durante la congelación y descongelación (Maria et al., 2006).

Actualmente esta técnica presenta numerosas aplicaciones como: i) conservar el semen, ii) sincronizar la disponibilidad de gametos, iii) reducir el número de reproductores, iv) reducir el riesgo de trasmisión de enfermedades principalmente de tipo parasitario, v) conservar la variabilidad genética, vi) facilitar el transporte de especies, vii) protección de especies amenazadas o en peligro de extinción, y viii) disponibilidad de espermatozoides durante todo el año, independientemente de la temporada y estado de madurez sexual de los peces (Dietrich et al., 2014; Öğretmen et al., 2016).

El éxito de la criopreservación de células y tejidos se logró en el siglo XX, con la introducción del glicerol como agente crioprotectante (ACP) durante el proceso de congelación (Polge et al., 1949), y posteriormente con el descubrimiento del dimetil sulfóxido (DMSO) (Lovelock y Bishop, 1959), así como por la sustitución a partir de la década de los 50 de nieve carbónica que alcanzaba -79 ºC por nitrógeno líquido con el que se logran -196 ºC (Paz, 2009).

En la acuicultura, la criopreservación de espermatozoides dio inicio con Blaxter (1953) quien fertilizó huevos de arenque (Clupea harengus Linnaeus, 1758) con semen congelado. A partir de entonces se ha mostrado cada vez mayor interés por esta técnica, principalmente en especies de interés comercial.

Con base en las distintas revisiones bibliográficas, hasta la fecha, se ha intentado la criopreservación de más de 200 especies de peces y crustáceos con resultados favorables, pero variables, por lo que, cada protocolo debe ser estandarizado de acuerdo a la especie de interés (Nahiduzzaman et al., 2012; Paz, 2009).

Cada protocolo de criopreservación implica varios parámetros que deben ser estandarizados y evaluados para mejorar la supervivencia de los espermatozoides, ya que durante este proceso se ocasionan daños irreversibles a nivel celular, afectando su calidad y tasas de supervivencia (Aramli et al., 2015; Bernáth et al., 2016; Dietrich et al., 2016; Judycka et al., 2016a). Entre ellos se incluyen: i) composición del diluyente, ii) agente crioprotector, iii) concentración del agente crioprotector, iv) unidad de envasado (criopaja), y v) velocidad de congelación y descongelación; los cuales deben ser evaluadas con el fin de crear un protocolo exitoso para la especie de interés, de tal manera que, todas estas variables puedan interactuar para garantizar la viabilidad del espermatozoide (Aramli et al., 2015; Bernáth et al., 2016; Judycka et al., 2016b; Öğretmen et al., 2014).

Por tal motivo, el número insuficiente de espermatozoides viables durante la criopreservación es razón de incertidumbre, cuando se necesita fertilizar grandes cantidades de óvulos, se estima que el número de espermatozoides necesarios para una fertilización exitosa es de al menos 10 veces más, en contraste con semen fresco, por eso se necesitan grandes volúmenes de semen criopreservado (Billard, 1992; Ciereszko et al., 2013).

Diluyentes

Son soluciones isotónicas cuyo fin es imitar el medio en que se encuentran los espermatozoides dentro del testículo o conducto eferente, para mantener la inactividad de los espermatozoides e incrementar el volumen seminal sobre todo en especies cuya producción es en microlitros (Ohta y Izawa, 1996; Sieme et al., 2016).

Dichas soluciones están basadas principalmente en la composición química del plasma seminal de la especie, porque deben mantener inmóviles a los espermatozoides por periodos cortos donde la presión osmótica y el pH deben ajustarse para favorecer la supervivencia espermática (Valdebenito et al., 2009).

Entre las soluciones diluyentes se utilizan azúcares como: sacarosa, maltosa, trehalosa, galactosa, fructosa y glucosa, así como, NaCl, cuya efectividad es dependiente la osmolaridad y concentración iónica para cada especie, además de soluciones salinas tamponadas como: tampones fosfato, tris o bicarbonato potásico (Paz, 2009).

Entre los diluyentes más utilizados están: Diluyente Ginzburg Fish Ringer, Solución salina balanceada Hanks (HBSS), Diluyente Erdah y Graham, Solución de sacarosa, glucosa, fructuosa (Dietrich et al., 2016; Nynca et al., 2016, 2017; Ramírez-Merlano et al., 2010). A la fecha los diluyentes y crioprotectores han sido reportados como factores clave para la viabilidad celular (Nynca et al., 2016).

Crioprotectores

Los crioprotectores son sustancias hidrosolubles de baja toxicidad, cuya finalidad es mantener la viabilidad celular, previendo el daño celular durante el proceso de congelación y descongelación al disminuir la formación de cristales de hielo. Su entrada a la célula produce la salida de agua intracelular y disminuye la temperatura de nucleación del hielo, evitando que se formen cristales en el interior antes de que la célula se deshidrate (Paz, 2009; Sieme et al., 2016).

No obstante, el crioprotector no solo está diseñado para la prevención de la criogénesis sino también ayuda a la célula a iniciar la movilidad subsecuentemente cuando el espermatozoide es descongelado y empieza a mover el flujo de ATP hacia el flagelo (Ramírez-Merlano et al., 2010).

Los crioprotectores se dividen en dos tipos de acuerdo a la permeabilidad de la membrana a) permeables: metanol (MET), etanol, propanol, propilenglicol (PG), glicerol y dimetil sulfóxido (DMSO) y b) no permeables: glucosa, lactosa, sacarosa (Paz, 2009; Ramírez-Merlano et al., 2010).

En el campo de la acuicultura el DMSO, el MET y el PG han sido probados en diferentes concentraciones con el objetivo de establecer el tiempo de equilibrio necesario para proteger las células de la toxicidad, deshidratación y formación de cristales de hielo (Nahiduzzaman et al., 2012; Routray et al., 2007).

Además de los permeables y no permeables podemos encontrar agentes naturales como: yema de huevo; que es lipoproteica, o proteicas como la leche en polvo, albúmina de suero bovino (BSA) o extractos proteicos de soja, que ejercen protección específica sobre la membrana plasmática (Paz, 2009).

Efectos de la criopreservación en el espermatozoide

Daño morfológico

La calidad espermática está determinada entre otros factores por su morfología, existe una correlación positiva entre los espermatozoides anormales y la disminución de fertilidad, debido a ello, la evaluación de la magnitud de los daños morfológicos es esencial después de la criopreservación para determinar la pérdida de la capacidad fecundante, debido a la influencia significativa, entre la morfología, integridad y función del espermatozoide (Bustamante et al., 2016; Cabrita et al., 2005; Ramírez-Merlano et al., 2010).

Esta reportado que la criopreservación provoca daños irreversibles al espermatozoide, tales como la ruptura de la membrana plasmática en la cabeza, pieza media, flagelo y mitocondrias, ocasionados por la formación de cristales de hielo y por el consecuente flujo de agua al interior de la célula (Drokin et al., 1998; Martínez y Pardo, 2010; Ramírez-Merlano et al., 2010; Zhang et al. 2003).

Hay reportes donde analizaron el efecto del crioprotector en la morfología espermática, por ejemplo, Felizardo et al. (2010) utilizaron cuatro combinaciones de crioprotectores permeables y no permeables: DMSO + yema de huevo, DMSO + lactosa, MET + yema de huevo y MET + lactosa. Los resultados indicaron que las muestras tratadas con lactosa como crioprotector extracelular fueron las que presentaron mayor frecuencia de anormalidad versus yema de huevo. Entre las principales alteraciones se reportaron: cabezas aisladas, microcefalia, macrocefalia, flagelos enrollados, rotos, fracturados y aislados.

Así mismo, Ramírez-Merlano et al. (2011) indicaron las mismas alteraciones morfológicas en espermatozoides de Pseudoplatystoma metaense Bleeker, 1862, al emplear DMSO y MET postdescongelación; y Martins (2008) evidenció microcefalia en espermatozoides de Zungaro jahu Ihering, 1898, al utilizar DMSO (Tabla 1). Sin embargo, Lahnsteiner et al. (1992) reportaron que los cambios en la morfología pueden producirse antes de la congelación o inmediatamente después del contacto con el diluyente, aumentando a medida que se prolonga el tiempo de exposición al crioprotector, por lo cual es necesario evaluar la morfología antes y después de la incorporación del crioprotector.

Integridad de la membrana

La membrana plasmática es una estructura constituida por una bicapa lipídica que delimita a la célula, juega un papel fundamental en la respuesta del espermatozoide al entorno, regular actividades celulares y rutas de señalización que conducen a la activación de la movilidad (Márián et al., 1993; Tabares et al., 2005).

De acuerdo con Paz (2009) durante la criopreservación espermática la estructura de la membrana plasmática puede perder su estructura lipídica, cuando los lípidos que la componen alcanzan su punto de transición, la membrana puede desorganizarse, empaquetándose para formar pequeñas micelas, afectando a la permeabilidad y otras funciones celulares ya que los lípidos se desorganizan y las proteínas que hay entre ellos formando canales de permeabilidad o moléculas de reconocimiento, se ven afectados.

La superficie celular tiene regiones o dominios diferentes con funciones específicas, la pérdida del mosaico fluido durante la congelación conlleva a que esta regionalización se pierda, afectando la recepción y envío de señales que inician la movilidad, o el reconocimiento de la membrana entre los gametos (Paz, 2009).

En este sentido, el uso de un crioprotector adecuado resulta fundamental para evitar daños en la integridad de la membrana, por ejemplo, Dietrich et al. (2014) evaluaron el efecto de la glucosa y MET sobre la criopreservación en trucha (Oncorhynchus mykiss Walbaum, 1792) reportando el 50% de espermatozoides con membrana plasmática intacta tras la descongelación, resultados similares a los obtenidos por Ustuner et al. (2016) para la misma especie al utilizar yema de huevo más plasma seminal.

En otro estudio, Viveiros et al. (2015) reportaron el efecto del metilglicol, MET y DMSO sobre la integridad de la membrana en espermatozoides de la piracanjuba, o salmón de rio (Brycon orbignyanus Valenciennes, 1850) y del curimba (Prochilodus lineatus Valenciennes, 1836). Los resultados mostraron mayor porcentaje de integridad de la membrana con metilglicol al 10% con 57% ± 11 y 78% ± 14 al suplementar el medio con glucosa (Tabla 1).

Daño mitocondrial

La función de las mitocondrias en la activación espermática, es suministrar energía en forma de ATP necesaria para mantener la movilidad (Medina et al., 2005). Estudios previos han confirmado que la criopreservación puede dañar la mitocondria, por ejemplo, Boryshpolets et al. (2007) demostraron que la congelación y descongelación de espermatozoides de (Cyprinus carpio Linnaeus, 1758) llevó a una reducción del contenido de ATP de 46 nmol ATP/10⁹ espermatozoides a 10 nmol ATP/10⁹.

Otros estudios han reportado el efecto de la criopreservación sobre el porcentaje de mitocondrias funcionales, porque su número se reduce significativamente como fue el caso en la dorada roja (Pagrus major Temminck y Schlegel, 1843) (Liu et al., 2007); trucha arco iris (O. mykiss) (Ogier de Baulny et al., 1997) y bagre europeo (Silurus glanis Linnaeus, 1758) (Ogier de Baulny et al., 1999) (Tabla 1). No obstante, Restrepo et al. (2013) demostraron que a pesar de que la criopreservación altera la integridad mitocondrial, las mitocondrias retienen la capacidad de preservar el acoplamiento respiratorio requerido para la síntesis de ATP.

Sin embrago, O'Connell et al. (2002) indicaron que el daño mitocondrial durante la criopreservación en el esperma de peces es variable y se requiere de un protocolo específico, ésta hipótesis, se demuestra para los espermatozoides de la especie humana en que la técnica convencional de criopreservación es eficiente, como para preservar estas estructuras (Honeyfield y Krise, 2011, Labbé et al., 2001).

Esta reportado que la funcionalidad de las mitocondrias depende de la integridad de sus membranas, del acoplamiento de la fosforilación oxidativa y el transporte de electrones hacia el oxígeno, para que puedan proveer energía a la célula, por tal motivo el metabolismo energético mitocondrial es la fuente de generación de especies reactivas de oxígeno (ERO) (Kowaltowski et al., 2009).

Los complejos mecanismos redox en el microambiente mitocondrial, son capaces de controlar la producción de ERO a niveles requeridos para la funcionalidad normal de este organelo. Sin embargo, las situaciones de estrés oxidante que causan daño en la membrana mitocondrial, pueden perjudicar la eficacia respiratoria promoviendo la liberación de ERO (Ferramosca et al., 2013).

Movilidad espermática

La duración de la movilidad espermática en peces de fecundación externa varía de pocos segundos a minutos en función de la especie estudiada (Alavi y Cosson, 2005, 2006); y es uno de los parámetros que presenta mayor correlación con las tasas de fertilización.

En los últimos años se ha incrementado el interés por la preservación espermática tanto desde un punto de vista conservacionista como comercial, con el objetivo de alcanzar tasas de movilidad postdescongelación similares a las muestras en fresco. Los mejores resultados se han obtenido en ciprínidos, con resultados medios de elevada movilidad postcongelación en especies como Tinca Linnaeus, 1758 (Lujić et al., 2017); Barbodes gonionotus Bleeker, 1849 (Boonthai et al., 2016); Labeo calbasu Hamilton, 1822 (Nahiduzzaman et al., 2012); y C. carpio (Irawan et al., 2010). Así como en los siguientes salmónidos: O. mykiss (Nynca et al., 2017); Coregonus clupeaformis Mitchill, 1818 (Nynca et al., 2016); Thymallus Linnaeus, 1758; Salmo marmoratus Cuvier, 1829 (Horváth et al., 2015); Coregonus lavaretus Linnaeus, 1758, Salmo trutta Linnaeus, 1785, Salvelinus fortinalis Mitchell, 1815 (Judycka et al., 2016b). Sin embargo, los resultados obtenidos en especies marinas distan todavía de lo conseguido en otras especies, lo que implica trabajar en el desarrollo de nuevos protocolos específicos o, al menos, mejorar existentes. Para protocolos específicos de las diferentes familias de teleósteos de agua dulce y agua salada se sugiere revisar a Gallego y Asturiano (2018).

Daño del ADN

La fragmentación del DNA del espermatozoide se considera una característica relevante que determina baja calidad, es imprescindible que, tras la fecundación, la información genética se transmita sin errores a la siguiente generación ya que está correlacionada con la mutagénesis (Figueroa et al., 2013).

La evaluación del daño del DNA después de la criopreservación permite mejorar los protocolos de criopreservación mediante su optimización para reducir las crio lesiones de la cromatina (Cartón-García et al., 2013) ya que éstas alteraciones podrían tener consecuencias en la progenie (Pérez-Cerezales et al., 2009).

El mecanismo por el cual se produce el daño del DNA durante la criopreservación no está del todo dilucidado, pero se ha atribuido al estrés oxidante, principal responsable de la fragmentación de la cadena de ADN.

Está reportado que las bases nitrogenadas, en particular la guanina, son los principales objetivos del ataque de las ERO, generando 8-hidroxi,2'-desoxiguanosina (8-OHdG), lo cual debilita el enlace entre la guanina y ribosa, dando lugar a la pérdida de la base oxidada, desestabilizando la estructura del ADN y propiciando roturas de hebras localizadas (Aitken et al., 2012; Cabrita et al., 2014; Thomson et al., 2009).

Sin embargo, Kopeika et al. (2004) reportaron que la oxidación de las bases nitrogenadas por efecto del estrés oxidante, no siempre provoca la ruptura de la hebra y estas pueden ser introducidas al embrión, cuando el sistema de reparación de las escisiones presentes en el huevo está activado.

Sikorsky et al. (2004) mencionaron que además del daño a las bases nitrogenadas, las ERO crean sitios abásicos, dímeros de timidina y muchos otros que retrasan la progresión del ADN polimerasa. Aitken et al. (2009) proponen que algunas regiones de cromatina son particularmente propensas a sufrir criolesiones y sugieren que producen baja eficiencia de la remodelación de la cromatina durante la espermiogénesis, lo cual puede crear un estado de vulnerabilidad que permite que las ERO generadas ataquen y fragmenten el ADN durante el proceso de criopreservación.

Los estudios de Kuppusamy y Natesan, (2014) han demostrado el daño al ADN en espermatozoides criopreservados en Pangasianodon hypophthalmus Sauvage, 1878, reportando diferencias significativas (P<0.05) respecto al grupo control (semen fresco); así mismo, Pérez-Cerezales et al. (2009) reportaron en O. mykiss un incremento de 6,1% ± 0,3 a 14% ± 0,6, entre el control y muestras criopreservadas, resultados superiores a los obtenidos por Cabrita et al. (2005) para la misma especie 11,2% ± 9,2 y 30,3% ± 13,9 respectivamente. Así mismo, en Sparus aurata Linnaeus, 1758, Cartón-García et al., (2013) reportaron un aumento mínimo de 2,2% ± 0,2 a 2,5% ± 0,2 (control y criopreservadas), resultados que difieren a los reportados por Cabrita et al. (2005) para la misma especie 31,4% ± 15,8 y 41,4% ± 15,0 respectivamente y en Dicentrarchus labrax Linnaeus, 1758, Zilli et al. (2003) obtuvieron 37,7% ± 11,1 y 65,2% ± 10,2 entre el control y muestras criopreservadas (Tabla 1).

Conclusiones

La fisiología de los espermatozoides de teleósteos varía en función de la familia estudiada, aunque se suele mantener la estructura clásica formada por cabeza, pieza intermedia, pieza principal y pieza final. En los peces de fecundación externa, el movimiento del espermatozoide se inicia al ser liberado al medio acuoso por un choque hiposmótico (en especies de agua dulce) o hiperosmótico (en especies de agua salada). Todas estas diferencias (fisiológicas y morfológicas) dependen de las estrategias reproductivas de cada especie, y son probablemente la causa de la elevada variabilidad que podemos encontrar en teleósteos. Durante la criopreservación se producen una serie de cambios en la estructura y funcionalidad de los diferentes orgánulos celulares, por lo que un gran porcentaje de espermatozoides acaban sufriendo un daño durante la congelación y descongelación. En este sentido, el estudio de la fisiología espermática y la optimización de protocolos de criopreservación se presentan como dos retos para la mejora del conocimiento de la bilogía reproductiva de teleósteos marinos.

Agradecimientos

A los revisores anónimos, a la Universidad Autónoma Metropolitana Unidad Xochimilco y al CONACyT por la beca número 465467.

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Notas de autor

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