Introducción

Las infecciones por Streptococcus spp., constituyen una de las patologías más severas para el cultivo de tilapia a nivel mundial, causando mortalidad y pérdidas económicas (Evans et al., 2006). Los primeros reportes por infecciones del género Streptococcus comienzan en la década de los 50 en Japón, en los 90 en Israel y varios países de Europa; y en el año 2000 se reporta para varios países de Latinoamérica (Amal y Zamri-Saad, 2011; Evans et al., 2006; Figueiredo et al., 2012; Hoshino et al., 1958; Inglis et al., 1993; Jiménez et al., 2007; Klesius et al., 2000; Ortega et al., 2017; Plumb, 1999; Plumb et al., 1974; Wantanabe et al., 2002).

Desde el año 2009 se han reportado brotes por Streptococcus spp., en 13 países de Latinoamérica (Sheehan, 2009), siendo S. agalactiae la especie bacteriana más común (Musa et al., 2009; Suanyuk et al., 2005). En Guatemala anualmente se alcanza mortalidades promedio de 20% a 30% en granjas infectadas con dicho patógeno y en casos extremos se llega a tener una mortalidad hasta del 90% (Marroquín-Mora y García-Pérez, 2016). Para el control de las infecciones de S. agalactiae se han utilizado diversos antibióticos, siendo oxitetraciclina y florfenicol los indicados para tratar dicho patógeno (Gaikowski, 2009), aunque el uso indiscriminado puede causar un desbalance en la dinámica de los microorganismos que cohabitan en el estanque de cultivo (Gomez-Gil et al., 2000), y pueden llegar a provocar resistencia antimicrobiana (Musa et al., 2009). Por lo tanto, las terapias con antibióticos están siendo descartadas, como parte de tratamientos curativos y preventivos en la acuicultura.

Una opción viable para el control de enfermedades bacterianas en la acuicultura es el uso de fitoterapéuticos, los cuales cumplen con funciones inmunológicas y antibacterianas a través de sus estructuras celulares (Chakraborty y Hancz, 2011; Harikrishnan et al., 2011; Olusola et al., 2013; Shankar-Murthy y Kiran, 2013; Sutili et al., 2017).

Estudios recientes han demostrado que el orégano posee alta actividad antimicrobiana (Dorman y Deans, 2000; Hammer, et al., 1999; Lambert, et al., 2001; Pascual et al., 2001; Shan et al., 2007), aunque sus propiedades antibacterianas dependerán del material vegetal, distribución geográfica, época de cosecha, entre otras características (McGimpsey et al., 1994). El orégano guatemalteco conocido como Lippia graveolens (Kunth), según diversos estudios han demostrado que su composición fitoquímica contiene: monoterpernos (β-phellandrina, carvacol, 1,8-cineol, p-cimeno, alcanfor, metil-timol y timol), sesquiterpenos (α-Humuleno, β-cariofileno, β-bisaboleno, aromadendreno), flavonoides (pinocembrina, naringenina), y taninos entre otros metabolitos secundarios (Jayves-Reyes et al., 2006; Pérez-Sabino et al., 2011), los cuales poseen propiedades antimicrobianas, y pueden llegar a ser alternativas viables para el tratamiento de agentes infecciosos.

El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto de la incorporación del extracto de orégano guatemalteco L. graveolens Kunth, para la prevención de la infección por S. agalactiae en tilapia.

Material y Métodos

Cepa bacteria

La cepa bacteriana de S. agalactiae utilizada para el presente estudio fue aislada en un sistema intensivo de cultivo de tilapia, en organismos con signos clínicos de estreptococosis. La bacteria fue identificada a través de pruebas bioquímicas rápidas (Microgen^® Strep), para bacterias Gram positivas, en el Laboratorio de Sanidad Acuícola (LSA) del Centro de Estudios del Mar y Acuicultura (CEMA). La cepa bacteriana identificada fue conservada en agar tripticasa soja agar (TSA) + 5% de sangre de carnero a 4°C, hasta ser utilizada.

Preparación del extracto de orégano: Lippia graveolens Kunth

El extracto de orégano fue elaborado en el Centro Universitario del Oriente (CUNORI), de la Universidad de San Carlos de Guatemala. El extracto vegetal fue extraído a través de la metodología propuesta por Rodas et al. (2015). En resumen, el extracto fue preparado a partir de 1000 g de material vegetal seco, con la técnica de fluido supercrítico. Se utilizó dióxido de carbono (CO₂) como solvente a presión de 1300 psi y se agregó etanol 95% (EtOH 95%) como co-solvente, durante 30 minutos a temperatura de 45 ºC. Posterior a la extracción, el extracto obtenido se diluyó con una solución de dimetilsulfóxido al 5% (DMSO) para obtener una concentración final del extracto de 100000 ppm. El extracto se almacenó en recipientes de vidrio color ámbar a temperatura ambiente de 28 ± 2 °C.

Actividad antimicrobiana

La actividad antimicrobiana del extracto de orégano, se determinó a través de la modificación del método perforación en pocillo, descrito por Alderman y Smith (2001). En resumen, se realizó una suspensión bacteriana de S. agalactiae (10⁸ CFU/mL) y se inoculó 100 µL en agar Müller Hinton (MHA: Merck). Posteriormente, se perforaron 6 pocillos de 5 mm de diámetro con ayuda de una pipeta Pasteur estéril, y se vertió 50 µL del extracto.

Se utilizó como control positivo un sensi disco de oxitetraciclina (Oxi-blend: AVIMEX), y como control negativo se vertió 50 µL de la solución de dimetilsulfóxido al 5%, en uno de los pocillos. Las placas fueron incubadas durante un período de 48 horas a 28 ± 1 ˚C. Finalizado el tiempo de incubación se evaluó visualmente el crecimiento bacteriano alrededor de los pocillos. Se realizaron mediciones del diámetro de inhibición, la interpretación se realizó de acuerdo a los criterios establecidos por Pascual et al. (2001). Se consideró acción antimicrobiana del extracto vegetal cuando se produjo una inhibición igual o mayor al 50% de inhibición con respecto al antibiótico de mayor uso en la acuicultura, en el caso de la Guatemala el antibiótico de mayor uso es oxitetraciclina.

Determinación de la concentración mínima inhibitoria y mínima bactericida

La concentración mínima inhibitoria (CMI) se determinó a través de la modificación de la técnica de microdilución en placa descrita por Alderman y Smith (2001). Se utilizó una placa de 96 pocillos, realizando diluciones seriadas dobles en rangos de 25000 – 0,20 ppm del extracto de orégano. La suspensión bacteriana fue inoculada en cada uno de los pocillos para alcanzar una concentración bacteriana final de 10⁵ CFU/mL.

Las condiciones de cultivo fueron incubación a 28 ± 1 ˚C por 48 horas. Posterior a las 48 horas, se realizó una re-siembra de cada uno de los pocillos, con el fin de cuantificar el número de colonias.

La concentración mínima inhibitoria (CMI) fue definida de acuerdo a los criterios seleccionados por Levison y Levison (2004), en el cual define que CMI como la concentración del antimicrobiano que mantiene la carga bacteriana entre >10² a <10⁶ CFU/mL. Para la concentración mínima bactericida (CMB) se definió como la concentración mínima del antimicrobiano que elimina el 99,9% de la concentración bacteriana.

Diseño del experimento

Se seleccionaron 120 peces de la variedad GIFT (Genetically Improved Farmed Tilapia) con un peso promedio de 11,0 ± 0,2 g. Los peces fueron obtenidos de una empresa comercial, y acondicionados en un tanque de fibra de vidrio de 2000 L en las instalaciones del Centro de Estudios del Mar y Acuicultura (CEMA), por un periodo de 15 días, con el fin de observar el brote de alguna patología.

Posterior al tiempo de acondicionamiento los peces se dividieron en tres tratamientos, los cuales corresponde a un porcentaje de inclusión del extracto de orégano. Las dietas elaboradas poseen una inclusión del 0,5% (ORG_0,5%), 1% (ORG_1%) y 2% (ORG_2%). El cuarto tratamiento denominado control, fue sin inclusión de orégano. Cada tratamiento se trabajó por triplicado con un total de 30 organismos en acuarios de vidrio de 60 L. Las condiciones ambientales para cada uno de los acuarios fueron: oxígeno disuelto ≥3 mg/L y temperatura 30 ± 1°C. Para mantener los niveles de oxígeno se utilizó un sistema de airlift con flujo de agua de 6 L/h, y para la temperatura se utilizó un termostato de 150 W (Marina^®). Diariamente se sifoneó cada acuario para la remoción de heces y material no digerido.

La incorporación del extracto de orégano fue en alimento balanceado de marca comercial a través de una mezcla (v/p) de extracto de orégano y etanol 95% como vehículo de incorporación. La pre-mezcla de orégano fue incorporada homogéneamente utilizando un atomizador. Posterior a la incorporación, se dejó secando el alimento en horno (Yamato DG82:JP), a temperatura de 45 °C por 24 horas. Finalizado el secado, el alimento se almacenó en botes de plásticos oscuros herméticos a temperatura ambiente 28 ± 2 °C. La alimentación de los organismos fue diaria ad libitum, y dividida en tres raciones, iniciando a las 08:00, 11:00 y finalizando a las 15:00.

Evaluación de los parámetros zootécnicos

Para determinar el crecimiento de los organismos para cada uno de los tratamientos, se evaluaron parámetros zootécnicos, cada 15 días, descritos por Zheng et al. (2009):

a) Ganancia de peso (GP%) = 100 x [Peso final (g) – Peso inicial (g)] / Peso inicial (g)

b) Tasa de crecimiento especifico (TCE) = 100 x Ln [Peso final (g) / Peso inicial (g)] / Días en experimento (♯)

c) Factor de conversión alimenticia (FCA) = Alimento suministrado (g) / Ganancia de peso (g).

Desafío a la infección con S. agalactiae

Al finalizar el experimento de 30 días con las dietas experimentales, se realizó un desafío de resistencia con la cepa de S. agalactiae, previamente aislada. Se eligió esta cepa porque en experimentos preliminares demostró ser una cepa virulenta.

La preparación del inóculo bacteriano se realizó en caldo tripticasa soja (TSB), cultivado durante 48 h a 30 °C. El pellet bacteriano fue obtenido a través de centrifugación a 12000 rpm durante 5 min. Posterior a ello, se descartó el sobre nadante y se lavó el pellet bacteriano con solución salina 0,85%, dicho procedimiento se repitió tres veces, con el fin de remover productos extracelulares.

Todos los organismos fueron inyectados vía intra peritoneal (i.p.), con la suspensión bacteriana de S. agalactiae, a una relación de 50 µL/g de pez. La solución bacteriana se ajustó a densidad celular de 1,2 x 10⁶ CFU/pez, lo cual corresponde a la dosis letal 40 (LD40), calculada en experimentos previos. El experimento se realizó por triplicado y se evaluó durante diez días post infección. Los peces muertos se retiraron de los acuarios diariamente y los organismos moribundos se recolectaron para tomar muestras microbiológicas, sembrando en agar TSA + 5% de sangre de carnero, para re-aislar la bacteria S. agalactiae, y asegurar la muerte de los organismos fue por la inoculación bacteriana y no por condiciones de manejo.

Análisis estadístico

Los resultados se analizaron con análisis de varianza (ANOVA) (p <0,05), para determinar la diferencia significativa entre los tratamientos y se utilizó una prueba de Tukey (p <0,05), para las variables: peso inicial (P₀), peso final (P_f), ganancia de peso (GP), tasa de crecimiento especifico (TCE) y factor de conversión alimenticia (FCA). Se utilizó una prueba de Dunnett (p <0,05) para la variable de mortalidad. Los análisis fueron realizados en el programa estadístico Minitab 17.1.

Resultados

Los resultados de la presente investigación proporcionan evidencia de la importancia de la etnofarmacología como potencial sustituto de la farmacología tradicional en acuicultura. El extracto de fluido supercrítico de Lippia graveolens Kunth (Orégano guatemalteco), presentó actividad antimicrobiana frente a la bacteria Streptococcus agalactiae. Los resultados se muestran en la Tabla 1. De acuerdo a las pruebas in vitro realizadas, se observa inhibición bacteriana con el uso del extracto de L. graveolens a partir de una concentración de 67 mg/L, hasta alcanzar una concentración bactericida a los 75 mg/L. Se evidencia un mayor efecto inhibitorio de la bacteria cuando se utiliza antibióticos comerciales, según el área de inhibición evaluada.

Durante el periodo de evaluación, las dietas fueron aceptadas por los peces y no se observó mortalidad o signos de enfermedad. Los datos obtenidos de crecimiento, ganancia de peso, conversión alimenticia se describe en la Tabla 2.

La ganancia de peso no presentó diferencia significativa (p >0,05), pero se muestra que el crecimiento en todos los tratamientos fue lineal, al igual que la biomasa. Se observa un incremento mayor durante los primeros 15 días de cultivo, posteriormente se reduce ligeramente, pero se sigue manteniéndose constante para todos los tratamientos (Figura 1). Todos los tratamientos muestran una reducción en el factor de conversión alimenticia con diferencia significativa (p <0,001) a través de las pruebas de ANOVA y Tukey, siendo la dieta ORG_2% la que menor FCA presenta (1:1,13), seguido por la dieta ORG_0,5% y ORG_1%, con FCA de 1:1,29 y 1:1,53, respectivamente.

La resistencia a estreptococosis evidencio una diferencia significativa (p <0,001) en todos los tratamientos con inclusión del extracto de orégano. De los tratamientos evaluados, se obtuvo menor mortalidad en el tratamiento ORG_0,5% con una mortalidad acumulada de 7 ± 6%, seguido por los tratamientos ORG_1% y ORG_2%, con 13 ± 6%, respectivamente. La mayor mortalidad, se alcanzó en el tratamiento control con 40 ± 0% (Figura 2). La mayor mortalidad reportada en todos los tratamientos fue al tercer y cuarto día post infección. La bacteria S. agalactiae fue aislada de todos los organismos muertos, y no se identificaron otros agentes causantes de enfermedad bacteriana.

Discusión

A nivel mundial la acuicultura ha crecido dramáticamente en los últimos 50 años, crecimiento que ha causado impactos negativos a la salud de los peces, debido al incremento de patógenos bacterianos. En los cultivos de tilapia, la estreptococosis es una de las enfermedades de mayor importancia debido que los organismos pueden ser infectados en cualquier etapa del ciclo de producción (Jantrakajorn et al., 2014).

En los ensayos de resistencia a estreptococosis dependen de varios factores para producir enfermedad. La infección puede reportarse con cuadros agudos o bien crónicos. La clave de la infección bacteriana es: capacidad de virulencia de las cepas, concentración del producto bacteriano para la infección, especie o variedad de organismos y respuesta individual al medio ambiente entre otros (Sniezko, 1975). La cepa aislada de S. agalactiae posee características fenotípicas diferentes a lo reportado por Buller (2004); Evans et al., (2002); Evans et al., (2006); Kusuda et al., (1991), ya que no muestra formación beta o alfa hemolisis en agar sangre, siendo un factor importante para determinar factores de virulencia de la cepa bacteriana (Fuller et al., 2002). Por lo tanto, se infiere que la expresión de la cepa de S. agalactiae aislada, puede tener expresión de distintos signos clínicos.

Los productores de tilapia usualmente aplican diversos agentes antimicrobianos, para controlar las diversas patologías bacterianas. Diversos estudios han documentado que el uso indiscriminado de antibióticos conduce a un aumento de las resistencias de varios patógenos bacterianos (Tendencia et al., 2001; Hatha et al., 2005; Kaskhedikar y Chhabra, 2010). Una alternativa para reemplazar los productos farmacéuticos es el uso de la medicina natural como los extractos, infusiones y aceites esenciales de diversas plantas medicinales, para controlar diferentes patógenos en la acuicultura. A pesar que los mecanismos de acción de los extractos de plantas medicinales, no son bien definidos en la actualidad, se sugiere que la forma de actuar del extracto de L. graveolens es a través de la propiedad lipofílica, donde se destruye la membrana celular bacteriana, dejando expuesto todo el material nuclear al medio en que se encuentren.

Esta actividad antimicrobiana se atribuye a los metabolitos timol y carvacrol, ya que son isómeros estructurales y poseen un grupo hidroxilo y fenólicol (Sikkema et al., 1995), los cuales ayudan a despolarizar la membrana.

La presente investigación demostró que el extracto de orégano en porcentajes de 0,5%, 1% y 2%, reducen la mortalidad post infección de S. agalactiae en tilapia hasta un 84%, indicando que la incorporación de extracto de orégano tiene efecto antimicrobiano que ayuda a los organismos a aumentar la sobrevivencia. Resultados similares reporta Zheng et al. (2009), con dietas de 0,0485% extracto de carvacrol y 0,0015% de extracto de timol, logran reducir mortalidades por infección bacteriana hasta un 21%.

Sin embargo, se requieren experimentos adicionales para investigar el efecto del extracto de fluido súper critico de L. graveolens en la respuesta inmunológica del organismo, con el fin de comprender la respuesta de acción, así como la reducción del porcentaje de inclusión del extracto de orégano (<0,5%).

Agradecimientos

Esta investigación fue posible gracias al apoyo financiero de la Dirección General de Investigaciones de la Universidad de San Carlos de Guatemala, Proyecto DIGI 4.8.26.2.46, a través del programa de Recursos Naturales y Ambiente.

Bibliografía

1. Alderman, D., Smith, P. (2001). Development of draft protocols of standard reference methods for antimicrobial agent susceptibility testing of bacteria associated with fish diseases. Aquaculture, 196: 211-243.

2. Amal, M. N., Zamri-Saad, M. (2011). Streptococcosis in tilapia (Oreochromis niloticus): A Review. Pertanika Journal of Tropical Agricultural Science, 34(2): 195-206.

3. Buller, N. B. (2004). Bacteria from fish and other aquatic animals: A practical identification manual. London: CABI Publishing.

4. Chakraborty, S. B., Hancz, C. (2011). Application of phytochemicals as inmmunostimulant, antipatogenic and antistress agents in finfish culture. Reviews in Aquaculture, 3: 103-119.

5. Dorman, H. J., Deans, S. G. (2000). Antimicrobial agents from plants: antibacterial activity of plant volatile oils. Journal of Applied Microbiology, 88: 308-316.

6. Evans, J. J, Pasnik, D., Klesius, P. H., Shoemaker, C. A. (2006). Identification and epidemiology of Streptococcus iniae and Streptococcus agalactiae in tilapias, Oreochromis spp. Proceedings of the 7th International Symposium on Tilapias in Aquaculture, ISTA 7, 25-42.

7. Evans, J. J., Klesius, P. H., Gilbert, P. M., Shoemaker, C. A., Al Sarawi, M. A., Landsberg, J., Al-Zenki, S. (2002). Characterization of b-hemolytic group B Streptococcus agalactiae in cultured sea bream, Sparus auratus L., and wild mullet, Liza klunzingeri, in Kuwait. Journal of Fish Diseases, 25: 505-513.

8. Evans, J. J., Klesius, P. H., Shoemaker, C. A. (2006). An Overview: Streptococcus in Warm-Water Fish. Aquaculture Health International, 7: 10-14.

9. Figueiredo, H. C. P., Nobrega-Netto, L., Leal, C. A. G., Pereira, U. P., Mian, G. F. (2012). Streptococcus iniae outbreaks in brazilian nile tilapia (Oreochromis nilotucs L.) farms. Brazilian Journal of Microbiology, 43(2): 576-580.

10. Fuller, J. D., Camus, A. C., Duncan, C. L., Nizet, V., Bast, D. J., Thune, C., De Azavedo, J. C. (2002). Identification of a streptolysin S-associated gene cluster and its role in the pathogenesis of Streptococcus iniae disease. Infection and Immunity, 70: 5730-5739.

11. Gaikowski, M. A. (2009). Uso de alimento medicado con Aquaflor. (florfenicol) para controlar la mortalidad causada por Streptococcus iniae en tilapia (Oreochromis spp.): Eliminación de residuos y efectividad en el campo. Congreso Manejo de Streptococcus en Peces de Aguas Cálidas, Congreso, México, 1-45.

12. Gomez-Gil, B., Roque, A., Turnbull, J. F. (2000). The use and selection of probiotic bacteria for use in the culture of larval aquactic organism. Aquaculture, 191: 259-270.

13. Hammer, K. A., Carson, C. F., Riley, T. V. (1999). Antimicrobial activity of essential oils and other plant extracts. Journal of Applied Microbiology, 86: 985-990.

14. Harikrishnan, R., Balasundarm, C., Heo, M. S. (2011). Impact of plant products on innate and adaptive immune system of cultured finfish and shellfish. Aquaculture, 317: 1-15.

15. Hatha, M., Vivekanandhan, A. A., Julie Joice, G., Christol. (2005). Antibiotic resistance pattern of motile aeromonads from farm raised fresh water fish. International Journal of Food Microbiology, 98(2): 131-134.

16. Hoshino, T., Sano, T., Morimoto, Y. (1958). A Streptococcus pathogenic to fish. Journal of the Tokyo University of Fisheries, 44: 57-58.

17. Inglis, V., Roberts, R. J., Bromage, N. R. (1993). Streptococcal Infections. En: Bacterial Diseases of fish, 290 p. New York: Halsted.

18. Jantrakajorn, S., Maisak, H., Wongtavatchai, J. (2014). Comprehensive Investigation of Streptococcosis Outbreaks in Cultured Nile Tilapia, Oreochromis niloticus, and Red Tilapia Oreochormis sp., of Thailand. Journal of the World Aquaculture Society, 45(4): 392-402.

19. Jayves-Reyes, P. G., De León, J. L., Navas, R. P., Pérez-Sabino, J. F., Merida-Reyes, M., Farfán, C. (2006). Aceites esenciales de nueve plantas nativas de Guatemala, Familias Verbenaceae y Lauraceae. Dirección General de Investigación, Proyecto DIGI01-2005.

20. Jiménez, A., Rey, A., Penagos, L., Ariza, M., Figueroa, J., Iregui, C. (2007). Streptococcus agalactiae: Hasta ahora el único Streptococcus patógeno de tilapias cultivadas en Colombia. Revista de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia, 54: 285-294.

21. Kaskhedikar, M., Chhabra, D. (2010). Multiple drug resistance in Aeromonas hydrophila isolates of fish. Veterinary World, 3(2): 76-77.

22. Klesius, P. H., Shoemaker, C. A., Evans, J. J. (2000). Efficacy of single and combined Streptococcus iniae isolate vaccine administered by intraperitoneal and intramuscular routes in tilapia (Oreochromis niloticus). Aquaculture, 188(3-4): 237-246.

23. Kusuda, R., Kawai, K., Salati, F., Banner, C. R., Fryer, J. L. (1991). Enterococcus seriolicida sp. nov., a fish pathogen. International Journal of Systemic Bacteriology, 41: 406-409.

24. Lambert, R. J. W., Skandamis, P. N., Coote, P. J., Nychas, G. J. E. (2001). A study of the minimum inhibitory concentration and mode of action of oregano essential oil, thymol and carvacrol. Journal of Applied Microbiology, 91(3): 453-462.

25. Levison, M., Levison, J. H. (2004). Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Antibacterial. Agents Infectious Disease Clinics of North America, 23: 791-815.

26. Marroquín-Mora, C., García-Pérez, J. (2016). Aplicación de inmunoestimulantes de origen natural en el cultivo de tilapia para la prevención de Estreptococosis en Guatemala. Informe 2015-4.8.26.2.46. Guatemala: Universidad San Carlos de Guatemala, Dirección General de Investigación, Programa de Recursos Naturales y Ambiente. Informe Final (2015-4.8.26.2.46).

27. McGimpsey, J., Douglas, M., van Klink, J., Beauregard, D. (1994). Seasonal variation in essential oil yield and composition from naturalized Thymus vulgaris L. In New Zealand. Flavour and Fragrance Journal, 9: 347-352.

28. Musa, N., Wei, L., Musa, N., Hamdan R. H., Leong, L. K. (2009). Streptococcosis in red tilapia (Oreochromis niloticus) commercial farm in Malaysia. Aquaculture Research, 40: 630-632.

29. Olusola, S. E., Emikpe, B. O., Olaifa, F. E. (2013). The Potentials of medicinal plant extracts as bio-antimicrobials in aquaculture. International Journal of Medicinal and Aromatic Plants, 3(3): 404-412.

30. Ortega, Y., Barreriro, F., Castro, G., Huancaré, K., Manchego, A., Belo, M., Figueiredo, M., Manrique, W., Sandoval., N. (2017). Beta-haemolytic streptococci in farmed Nile tilapia, Oreochromis niloticus, from Sullana-Piura, Peru. Revista Medicina Veterinaria y Zootecnia Cordoba, 22(1): 5653-5665.

31. Pascual, M. E., Slowing, K., Carretero, E., Sanchez Mata, D., Villar, A. (2001). Lippia: traditional uses, chemistry and pharmacology: a review. Journal of Ethnopharmacology, 76(3): 201-214.

32. Pérez-Sabino, J. F., Farfán-Barrera, Ch., Oliva-Hernández, B. E., Mérida-Reyes, M., Muñoz-Wug, M. (2011). Determinación de los flavonoides en seis plantas del genero Lippia (Verbenaceae) nativa de Guatemala como posibles fuentes de nutracéuticos. Dirección General de Investigación.

33. Plumb, J. A. (1999). Tilapia bacterial diseases. En: Health: maintenance and principal microbial diseases of cultured fishes. Ames: Iowa State University.

34. Plumb, J. A., Schachte, J. H., Gaines, J. L., Peltier, W., Carroll B. (1974). Streptococous sp. from marine fishes along the Alabama and northwest Florida coast of the Gulf of Mexico. Transactions of the American Fisheries Society, 103(2): 358-361.

35. Rodas, A., García, R., Salomón, G., Nufio, S. (2015). Evaluación y caracterización extractos botánicos supercríticos de orégano (Lippia graveolens) para el control de la Roya (Hemileia vastatrix) en el cultivo de café (Coffea arabica L.) en las zonas productoras del municipio de la Unión, departamento de Zacapa. Informe 2015- 4.8.24.2.41. Guatemala: Universidad San Carlos de Guatemala, Dirección General de Investigación, Programa de Recursos Naturales y Ambiente.

36. Shan, B., Cai, Y.-Z., Brooks, J. D., Corke, H. (2007). The in vitro antibacterial activity of dietary spice and medicinal herb extracts. International Journal of Food Microbiology, 117(1): 112-119.

37. Shankar-Murthy, K., Kiran, B. R. (2013). Review on usage of medicinal plants in fish diseases. International Journal of Pharma and Bio Sciences, 4(3): 975-986.

38. Sheehan, B. (2009). Estreptococosis en tilapia: ¿Un problema más complejo de lo esperado? Congreso Manejo de Streptococcus en Peces de Aguas Cálidas, Congreso, México.

39. Sikkema, J., Bont, J. A. M., B. Poolman. (1995). Mechanisms of membranes toxicity of hydrocarbons. Microbiological Reviews, 59: 201-222.

40. Sniezko, S. F. (1975). History and present Status of fish diseases. Journal of Wildlife Diseases, 11: 446-459.

41. Suanyuk, N., Kanghear, H., Khongpradit, R., Supamattaya, K. (2005). Streptococcus agalactiae infection in tilapia (Oreochromis niloticus). Songklanakarin Journal of Science and Technology, 27: 307-319.

42. Sutili, F. J., Gatlin III, D. M., Heinzmann, B. M., Baldisserotto, B. (2017). Plant essential oils as fish diet additives: benefits on fish health and stability in feed. Reviews in Aquaculture, 0, 1-11.

43. Tendencia, E. A., De la Pena, L. D., (2001). Antibiotics resistance of bacteria from shrimp ponds. Aquaculture, 195: 193-204.

44. Wantanabe, W. O., Losordo, T. M., Fitzsimmons, K., Hanley, F. (2002). Tilapia production systems in the Americas: Technological advances, trends, and challenges. Reviews in Fisheries Sciences, 364: 465-498.

45. Zheng, Z. L., Tan, J. Y. W., Liu, H. Y., Zhou, X. H., Xiang, X., Wang, K. Y. (2009). Evaluation of oregano essential oil (Origanum heracleoticum L.) on growth, antioxidant effect and resistance against Aeromonas hydrophila in channel catfish (Ictalurus punctatus). Aquaculture, 292: 214-218.

Notas de autor

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