1 Introducción

P. racemosa var. racemosa (Mill.) J. W. Moore es una planta tropical de hoja perenne y porte erguido, cuya altura puede oscilar entre los 15 y 25 m, pertenece al género Pimenta de la familia Myrtaceae (Landrum 1986, Ogundajo y col., 2011, Weiss 2002), es conocida con diferentes nombres como: Bayrumbaum y Kronpiment (alemán); Bayrumtree, West Indian bay tree, bay, bay tree y bay rum (inglés); Bois d'Inde y Piment couronné (francés); Bay rum, Berrón, Limoncillo, Malagueta, Pimienta de Tabasco, pepita de especia, guayabita y pimienta (español) (Aristeguieta 1973, Jirovetz y col., 2007, Ogundajo y col., 2011, Taxon-Pimenta racemosa 2014, Plantnames 2014, Contreras-Moreno y col., 2014a, 2014b, Tropicos, 2016). Es originaria de las Antillas y del noroeste de Suramérica, se ha introducido con éxito en el este y oeste de África e Indonesia, en el sudeste de Estados Unidos y Sri Lanka (Dupont y col., 1954, Weiss 2002, Contreras-Moreno y col., 2014a). En Venezuela se encuentra distribuida en el Distrito Capital y en los estados Táchira, Mérida, Zulia, Falcón, Lara, Sucre y Nueva Esparta (Hokche y col., 2008, Contreras-Moreno y col., 2014a, 2014b).

Ésta especie arbórea posee un amplio abanico de usos. En la medicina tradicional se utilizanpor sus propiedades analgésicas, antibacterianas, antiinflamatorias, antinociceptivas, antipiréticas, antisépticas, antivirales, carminativas, diaforéticas y vasolidatadoras (Longuefosse y Nossin 1996, Fernández y col., 2001, García y col., 2004, Marzouk y col., 2007, Godínez-Caraballo y Volpato 2008, Alitonou y col., 2012, D’Angelis y Negrelle 2014, Flores y Quinlan 2014). Desde el punto de vista farmacológico esta planta presenta una notable actividad antioxidante, antifúngica, antibacteriana, insecticida y esquistomicida (Cáceres y col., 1995, Aurore y col., 1998, Jirovetz y col., 2007, Lans y col., 2006, Leyva y col., 2007a, Yousif y col., 2007, Junheon y col., 2008, Tajkarimi y col., 2010, Alitonou y col., 2012, Contreras-Moreno y col., 2014b). Se usa en carpintería y ebanistería (Leyva y col., 2007b).

El uso más frecuente de esta planta es como materia prima para la obtención de esencias volátiles, para lo que se usan las hojas, las cuales al destilarse producen el aceite esencial conocido como bay leaf oil o bay rum. Generalmente, durante el proceso de destilación se obtienen dos fracciones de destilados, uno ligero y otro más pesado que el agua, las cuales se combinan para generar el aceite comercial con un alto contenido de fenoles; éste aceite no debe ser confundido con el aceite que se obtiene de las hojas de laurel, el cual también se llama bay leaf (Dupont y col., 1954, Weiss 2002, Contreras-Moreno y col., 2014a, Tisserand y Young 2014).

En la literatura se ha reportado que la especie P. racemosa var. racemosa presenta tres quimiotipos con olores caracteristicos, debido a sus componentes mayoritarios; olor a limón rico en neral/geranial (72%); olor a anís debido a la presencia de metilchavicol/metileugenol (81%) y olor a clavo por su alto contenido de eugenol/chavicol (73%) (Abaul y col., 1995), siendo solo el quimiotipo con aroma a “clavo” el que se produce comercialmente (Tisserans y Young, 2014).

El aceite esencial de esta especie esmuy valioso para la industria cosmética, farmacéutica y de alimentos, principalmente en formulaciones de lociones para después del afeitado, jabones, cremas, perfumes, tratamientos para el cabello, tratamiento antifúngico para las aguas de acuarios y saborizantes de alimentos y productos de confitería (Weiss 2002, Jirovetz y col., 2007, Boning 2010, Ogundajo y col., 2011, Alitonou y col., 2012, Apifishcare 2015).

Los aceites esenciales por ser de origen natural en los últimos años han sido frecuentemente utilizados en diferentes áreas industriales (farmacéutica, alimentaria, sanitaria, cosmética y perfumería), siendo sus aplicaciones más recientes como antioxidantes y preservantes de alimentos y medicinas, ya sea aplicándolos como protectores de cultivos y plantas, incorporándolos en el material de embalaje de los productos, al ser menos tóxicos que los antioxidantes sintéticos de mayor uso (Mesa-Vanegas y col., 2010, Bilia y col., 2014) o incorporados en formulaciones dermocosmeticas dirigidas al tratamiento y prevencion de enfermedades de la piel mediadas por estrés oxidativo (Rodríguez y col., 2013).

La actividad antioxidante en general se centra principalmente en la búsqueda de compuestos capaces de capturar radicales del medio ambiente que lo rodea. Los radicales libres se producen como resultado de la oxidación celular, alteran el ADN de las células, impidiendo la renovación celular o afectando su funcionamiento. Se ha visto una relación directa entre el aumento de radicales libres y ciertas enfermedades como SIDA, cáncer, alteraciones en el sistema nervioso central y el envejecimiento precoz, por lo cual la actividad antioxidante es un ensayo que está siendo muy aplicado (Bafna y Mishra 2005, Marxen y col., 2007).

Aun cuando se ha demostrado que el aceite esencial de P. racemosa de Jamaica y Benin es capaz de secuestrar radicales DPPH e hidroxilos y de inhibir la peroxidacion lipídica de forma casi tan eficiente como el eugenol (Jirovetz y col., 2007, Alitonou y col., 2012, Tisserans y Young 2014), no hay suficientes artículos publicados al respecto, además a la fecha tampoco existen reportes de actividad antioxidante para aceites esenciales de diferente densidad obtenidos en una misma hidrodestilación de P. racemosa, ni de estudios sobre actividad antioxidante para P. racemosa var. racemosa en Venezuela. Es importante tener más información sobre la capacidad antioxidante que presentan los aceites de P. racemosa que crecen en otras regiones a las reportadas en la literatura.

El objetivo de esta investigación fué evaluar la actividad antioxidante de dos aceites esenciales de diferentes densidades, obtenidos en 2012 por hidrodestilación de las hojas frescas de la especie P. racemosa var. racemosa tachirense usando el método de la capacidad secuestrante de radicales libres DPPH.

2 Parte experimental

2.1 Materiales y equipos

Todos los reactivos químicos utilizados, incluyendo los disolventes fueron de grado analítico. El reactivo DPPH (2,2- difenil-1-picrilhidrazilo) es de Sigma-Aldrich, el ácido ascórbico y metanol se obtuvieron de Merck. Los aceites esenciales de diferente densidad: liviano (AL) y pesado, (AP) ensayados en este estudio fueron obtenidos a través de la hidrodestilación de las hojas frescas recolectadas en abril 2012,en la ciudad de Rubio ubicada en el suroeste del Estado Táchira, Venezuela. La composición química, los rendimientos y otros detalles con respecto a la metodología de extracción y análisis de estos aceites fueron reportados previamente (Contreras-Moreno y col., 2014a).

Se utilizó un Espectrofotometro UV-Visible Spectronic GENESYSTM 10 Bio para evaluar el comportamiento de los aceites esenciales como agentes antioxidantes.

2.2 Actividad antioxidante.

La evaluación de la capacidad antioxidante de los aceites esenciales (AL y AP) se realizó siguiendo el ensayo del test de actividad secuestrante de radicaleslibres del 2,2-difenil-1-picrilhidrazil (DPPH), según la metodología descrita por Goupy 1999, Molyneux 2004, Díaz y col., 2011, Plaza y col., 2014, en el que se usa metanol como disolvente.

Esta técnica consistió en adicionar a una alícuota de 0,2 mLde solución metanólica de aceite esencial (1mg/mL), 2,8 mL de solución metanólica de DPPH (6*10-2 mM), mezcla- que se agito suavemente y se incubó en la oscuridad por 30 minutos a temperatura ambiente. La absorbancia de la solu ción resultante se midió usando un espectrofotómetro UV- Visible a 517 nm. El control positivo fue la mezcla de 2,8 mL de solución de DPPH (6*10-2 mM) con 0,2 ml del patrón de referencia (una solución metanólica de ácido ascórbico 0,176 mg/ml). El blanco del ensayo fue la alícuota de 2,8 mL de solución de DPPH (6*10-2 mM).

El porcentaje de inhibición (% I) de radicales libres de DPPH • se calculó mediante la siguiente ecuación:

%I = [(A -A )/A ) x 100

Donde: A₀ y A_m son los valores de las absorbancias del blanco (solución metanólica de DPPH) y de la muestra (solución metanólica de DPPH + la solución metanólica del aceite esencial), respectivamente. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.

Las muestras que presentaron %I > 50%, se les determinó la mínima concentración a la cual cada uno inhibe el 50% de radicales libres de DPPH y para ello se prepararon soluciones de cada uno de los agentes antioxidantes (patrón de referencia y aceites esenciales) a concentraciones variables con la finalidad de construir curvas de % I en función de la concentración del analito y calcular por regresión lineal para cada muestra la concentración inhibitoria 50 (CI₅₀). Por razones de claridad, los resultados fueron expresados en términos de 1/CI₅₀ o poder antiradicalario (ARP), es decir, a mayor valor de ARP, mayor será la eficiencia del aceite esencial como antioxidante (Goupy y col., 1999, Plaza y col., 2014).

3 Análisis estadístico

Los análisis estadísticos se realizaron con los paquetes de software Excel (Microsoft, Redmond, WA, EE.UU.) y SPSS 15.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, EE.UU.). Con la finalidad de determinar diferencias estadisticamente significativas en cada uno de los analitos evaluados con la actividad antioxidante por el método de DPPH, se realizó un análisis unidireccional de varianza (ANOVA). Todos los resultados se expresaron como valores globales de media y desviación (SD) de tres mediciones paralelas.

4 Discusión y Resultados

Los resultados de la evaluación de la actividad antioxidante realizada con el método de la capacidad secuestrante de radicales libres sobre el reactivo 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) de los aceites esenciales (AL-12 y AP-12) obtenidos de la especie P. racemosa var. racemosa, revelaron porcentajes de inhibición de estos radicales, superiores al 50%; con concentración de 1 mg/mL (Figura 1).

En general, el porcentaje de inhibición de radicales libres de DPPH (% I) de los aceites disminuyó en el siguiente orden: AP-12 > AL-12. El ácido ascórbico como control positivo reflejó el %I más alto a una concentración de 0,176 mg/mL, con un valor de 96,68% en contraste con los Aceites esenciales (Figura 1).

El análisis de comparación entre los diferentes aceites esenciales (AL-12 y AP-12) da a relucir, que existe una diferencia estadísticamente significativa (p < 0,05) entre ellos, y que el mismo comportamiento ocurre cuando se compara el ácido ascórbico con cada uno de estos aceites, razón que explicaría en ambos análisis la diferencia entre los valores del %I de los aceites esenciales con el del control positivo.

Cabe destacar que el hecho de tener un %I > 90% en los aceites esenciales, se infiera un alto poder antioxidante para cada analito, una explicación para este efecto podría indicarlo la composición química de estos aceites esenciales, debido a que los aceites AL-12 y AP-12 mostraron como principal compuesto mayoritario la presencia de eugenol con valores de 60,4% y 82,9% respectivamente, sustancia a la que se le atribuye un alto poder antioxidante.

Las curvas de % I en función de la concentración del analito, reflejaron altas correlaciones (R2> 0,93) (Figura 2).

Las curvas de % I vs concentración de aceites esenciales reflejadas en la figura 2, se construyeron hasta una concentración máxima de 0,20 mg/mL.

Como el poder captador de radicales libres de los aceites esenciales es inversamente proporcional a la CI₅₀, es decir, a menor valor de CI₅₀ mayor será la capacidad antioxidante del analito, para evitar confusiones, todos los resultados se expresaron como ARP (poder antirradicalario, por sus siglas en inglés antirradical power) ó el inverso de la CI₅₀, obteniéndose resultados directamente proporcionales. Cuanto mayor sea el valor de ARP, más eficiente será el antioxidante (Goupi y col., 2009, Plaza y col., 2014) (Tabla 1).

Los resultados observados en la tabla 1, demuestran en términos de ARP que el analito con mayor poder antioxidante fue AP-12 con un valor de 15,538 mL/mg, seguido por AL- 12 con un valor de 11,136 mL/mg.

Cabe resaltar que todos los aceites esenciales presentaron una disminución significativa en la concentración de radicales de DPPH, debido a su capacidad de donar protones y neutralizar así los radicales libres de DPPH, por lo que podrían tomarse en cuenta a estos analitos como fuente de antioxidantes naturales. Por otro lado, de acuerdo con este estudio se puede deducir que la capacidad antioxidante de la especie P. racemosa var. racemosa en función del aceite depende del contenido de eugenol, ya que se demuestra que el aceite con mayor contenido de eugenol presentó un mayor poder antioxidante.

En algunas investigaciones, la actividad antioxidante de los aceites esenciales ha sido atribuida a diferentes factores: (a) sus componentes volátiles mayoritarios (generalmente 2 o 3) que típicamente constituirían el 20-95% del contenido total de aceite (Asgary y col., 2013); (b) la presencia de compuestos fenólicos (Miguel 2010, Oriani y col., 2014, Kumar y col., 2010, Amorati y col., 2013, Teissedre y col., 2000, Zheng y Wang 2001,Jaramillo y col., 2012), y terpenoidales (Kumar y col., 2010, Amorati y col., 2013), aunque estén en pequeñas proporciones (Jaramillo y col., 2012) y (c) el efecto sinérgico de todas las sustancias volátiles que lo conforman (Misharina y col., 2009).

Dentro de estos parámetros de actividad antioxidante, se podría decir que la capacidad de secuestrar radicales libres de los aceites esenciales evaluados en este estudio, se debe principalmente a sus componentes mayoritarios, siendo de naturaleza fenólica y monoterpénica en el aceite liviano, AL-12 (eugenol 60,4%, chavicol 6,0%, mirceno 11,7%, limoneno 5,4%, linalol 4,4%), y de tipo fenólica para AP-12 (eugenol 82,9%, chavicol 9,3%) (Contreras-Moreno y col., 2014a). Las estructuras de tipo terpenoidal o fenólicas, son en su mayoría compuestos antioxidantes muy importantes debido a la presencia de insaturaciones y/o grupos hidroxilos, que les confiere capacidad secuestrante y/o reductora al interactuar con los electrones desapareados de los radicales libres, neutralizándolos de su alta reactividad tóxica. (Carhuapoma y colo., 2007, Perico 2011).

En estudios anteriores, se demostró que los monoterpenos limoneno (Davicino y col., 2010, Marzoug y col., 2011), y lilanol (Ceker y col., 2012), así como los derivados de fenilpropanoides eugenol (Gülçin 2011), metileugenol (Ozcan y col., 2010), y metilchavicol (Fard y col., 2012, Deschamps y col., 2008) poseen actividad antioxidante.

Por otra parte, los aceites esenciales que son capaces de secuestrar radicales libres pueden desempeñar un papel importante en la prevención de algunas enfermedades tales como la disfunción cerebral, cáncer, enfermedades del corazón y la decadencia del sistema inmunitario, ya que la evidencia científica existente sobre los aceites esenciales han demostrado que estas enfermedades pueden ser el resultado del daño celular causado por los radicales libres (Miguel 2010).

Es importante resaltar que en investigaciones previas ya se ha reportado actividad antioxidante para aceites esenciales extraídos de hojas de la especie P. racemosa en diferentes países a través del método de DPPH, obteniéndose muy buenos resultados. Jirovetz (2007) encontraron una CI₅₀ de 10 µg/mL al evaluar el aceite esencial de las hojas de una P. racemosa jamaiquina con eugenol (45,60 %), mirceno (24,97 %) y chavicol (9,31 %) como compuestos mayoritarios. En cambio, Alitonou (2012) reportaron una CI₅₀ de 1,30 µg/mL al ensayar el aceite esencial de las hojas de una P. racemosa proveniente de Benín con eugenol (51,1 %), mirceno (25,1%), chavicol (7,5 %), limoneno (3,0 %) y 1,8-cineol (2,7 %) como componentes mayoritarios. Aunque estos resultados reflejan valores muy por debajo de los obtenidos para los aceites AL-12 y AP-12 (CI₅₀= 64 y 90 µg/mL, respectivamente) con la P. racemosa var. racemosa tachirense. Se debe tomar en cuenta varias factores que podrían explicar estas divergencias en los resultados como son: contenido de compuestos mayoritarios y orígenes de la planta, diferentes tanto de los aceites reportados en la bibliografía con los obtenidos en esta investigación, contribuciones sinérgicas de otros constituyentes a los reflejados como principales en los aceites esenciales, así como condiciones disímiles entre las metodologías de DPPH reportadas en los estudios de Jirovetz (2007) y Alitonou (2012) con las descritas para la evaluación de los aceites AL-12 y AP-12.

4 Conclusiones

Los aceites esenciales evaluados presentaron capacidad secuestrante de radicales libres con valores de CI₅₀ de 0,090 mg/mL (AL-12) y 0,064 mg/mL (AP-12), siendo los primeros reportes de actividad antioxidante de aceites esenciales para P. racemosa var. racemosa en Venezuela. Por otra parte al igual que en los estudios realizados por Jirovetz (2007) los aceites esenciales de la especie P. racemosa var. racemosa tachirense se pueden considerar como potentes antioxidantes y fuentes naturales de conservación para reducir o prevenir pérdidas debido a procesos oxidativos. Por lo que los resultados obtenidos en esta investigación con el aceite esencial de las hojas de P. racemosa var. racemosa, serían otro aporte al género Pimenta.

Agradecimientos

Los autores reconocen y agradecen a la Dra. Gabriela Rodríguez del Departamento de Química, Universidad Nacional Experimental Francisco de Miranda (Falcón, Venezuela), a la Dra. Claudia Plaza del Instituto de Investigación de la Facultad de Farmacia y Bioanálisis de la Universidad de Los Andes (Mérida, Venezuela) y a la MSc. Libia Alarcón del Grupo de Investigacion GIPRONA del Núcleo Universitario Rafael Urdaneta, Universidad de Los Andes (Trujillo, Venezuela) por su colaboración durante el desarrollo de las actividades ensayadas. Los autores también desean expresar su gratitud al Consejo de Desarrollo Científico, Humanístico, Tecnológico y de las Artes (CDCHTA) de la Universidad de Los Andes (ULA), Mérida, Venezuela, por por su apoyo económico bajo los proyectos I-1466-15-08-Ed, I-1485-17-08- AA.

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