Resumen: Las epidemias de cólera afectan a un gran número de países africanos, asiáticos y del Caribe. Los cambios climatológicos y las constantes migraciones hacen que esta enfermedad se extienda, por lo que resulta necesario disponer de vacunas protectoras. En el presente trabajo se caracterizó una nueva vacuna de vesículas de membrana externa (VMEs) obtenidas de Vibrio cholerae O1 biotipo El Tor serotipo Ogawa cepa C7258, en el Instituto Finlay de vacunas (Cuba), a través de métodos proteómicos. Se identificaron 53 proteínas presentes en las VME (4 proteínas por banda electroforética) separadas por electroforesis unidimensional (1D) y digeridas con tripsina. Los fragmentos obtenidos fueron separados por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) acoplada a espectrometría de masa, secuenciados e identificados mediante bases de datos de proteínas Swiss-Prot y TrEMBL. El patrón proteico obtenido presentó algunas de las proteínas (12 proteínas citoplasmáticas y 5 proteínas de membrana externa) sugeridas dentro del proteoma de buena calidad para candidatos vacunales. Se estudiaron las mejores condiciones para la separación de las proteínas a través de electroforesis bidimensional. Las VME evaluadas cuentan con una composición fundamentada en proteínas necesarias para garantizar una respuesta inmune que proteja contra Vibrio cholerae O1 biotipo El Tor serotipo Ogawa.
Palabras clave:Vibrio choleraeVibrio cholerae,Métodos proteómicosMétodos proteómicos,Vacunas Vacunas ,Proteínas de membrana externaProteínas de membrana externa.
Abstract: Cholera epidemics affect a large number of African, Asian and Caribbean countries. The climate changes and the constant migrations cause this disease to spread, making it is necessary to obtain protective vaccines. In the present work, a new vaccine of outer membrane vesicles (OMV) from V. cholerae O1 El Tor biotype Ogawa serotype strain C7258 at Finlay Institute of vaccines (Cuba) was characterized by proteomic methods. A total of 53 proteins present in the OMV (approximate ratio of 4 proteins by electrophoresis band) were identified, separated by one dimension electrophoresis and digested by tripsin method. The fragments were separated by high performance liquid chromatography (HPLC) coupled to mass spectrometry, sequenced and identified, using Swiss-Prot and TrEMBL protein databases. The pattern showed some proteins (12 cytoplasmic proteins and 5 outer membrane proteins) suggested within the highest quality proteome for vaccine candidate. The best conditions for proteins separation by two dimension electrophoresis were studied. The OMV composition was based on proteins described to the immunity response and protection against V. cholerae O1 El Tor biotype Ogawa serotype.
Keywords: Vibrio cholerae, Proteomics , Vaccines , Outer membrane proteins.
Resumo: As epidemias de cólera afetam um grande número de países africanos, asiáticos e caribenhos. As mudanças climáticas e as constantes migrações fazem com que esta doença se espalhe, portanto é necessário ter vacinas protectoras. No presente trabalho, uma nova vacina de vesículas de membrana externa (VMEs) obtidas de Vibrio cholerae 01 biotipo El Tor sorotipo Ogawa cepa C7258, no Instituto de Vacinas Finlay (Cuba), através de métodos proteômicos. Foram identificadas 53 proteínas presentes nas VME (4 proteínas por banda eletroforética) separadas por eletroforese unidimensional (1D) e digeridas com tripsina. Os fragmentos obtidos foram separados por cromatografia de alta resolução (HPLC) acoplada a espectrometria de massa, sequenciados e identificados usando bancos de dados de proteínas Swiss-Prot e TrEMBL. O padrão proteico obtido apresentou algumas das proteínas (12 proteínas citoplasmáticas e 5 proteínas de membrana externa) sugeridas dentro do proteoma de boa qualidade para candidatos vacinais. As melhores condições para a separação de proteínas através de eletroforese bidimensional foram estudadas. As VME avaliados possuem uma composição baseada em proteínas necessárias para garantir uma resposta imune que proteja contra Vibrio cholerae O1 biotipo El Tor sorotipo Ogawa.
Palavras-chave: Vibrio cholerae, Métodos proteômicos, Vacinas, Proteínas da membrana externa.
Microbiología
Una vacuna de vesículas de membrana externa de Vibrio cholerae es aún una promesa: Caracterización proteómica
Outer membrane vesicle vaccine from Vibrio cholerae is still a promise: Proteomic characterization
Uma vacina de vesículas da membrana externa de Vibrio cholerae ainda é uma promessa: Caracterização proteômica
Federación Bioquímica de la Provincia de Buenos Aires
Recepción: 11 Julio 2018
Aprobación: 18 Enero 2019
La bacteria Vibrio cholerae serogrupo O1 es una de las causas fundamentales de las epidemias y pandemias de cólera y puede clasificarse como el biotipo Clásico o El Tor (1)(2). El cólera es una enfermedad aguda con una alta incidencia en África subsahariana desde hace más de 35 años. Esto junto con la aparición de nuevas cepas que provocan serias condiciones clínicas, el incremento de la resistencia a antibióticos y los cambios climáticos son algunas de las causas por las que esta enfermedad podría persistir indefinidamente (3). El hecho de que muchos de los genes presentes en el genoma de V. cholerae sean similares a los encontrados en Escherichia coli (4) resulta ser atractivo para el diseño de una nueva vacuna contra enfermedades entéricas. Algunos informes refieren que los mayores brotes de cólera han estado localizados en Asia y África pero, adicionalmente, existen altas incidencias en regiones del mar Caribe como Haití. Sin embargo, el mapa de distribución de la enfermedad podría extenderse si otros países no tomaran medidas como Cuba, que eliminó completamente el brote procedente de Haití. Los impresionantes cambios climáticos contribuyen a la diseminación de la enfermedad (5)(6).
Tres vacunas de uso oral (obtenidas a partir de células enteras muertas) diseñadas para la protección contra el cólera han sido calificadas como seguras por la Organización Mundial de la Salud (OMS), y se encuentran en uso: Dukoral, Shanchol y Euvichol. La evaluación de la vacuna Euvichol (EuBiologics, República de Corea) mostró resultados similares a los descriptos para Shanchol™, con un 65% de protección contra el cólera durante 5 años después de iniciada la vacunación en zonas endémicas (7).
La tecnología de vesículas de membrana externa (VME) es de gran interés para la obtención de una vacuna protectora contra esta enfermedad. Estas estructuras son una de las formas que tienen las bacterias para colonizar el intestino; de tal manera que a través de estos sistemas pueden transportarse las enzimas proteolíticas y de degradación de hidratos de carbono (además de moléculas de ADN, toxinas e inmunomoduladores) hacia la superficie de algunas bacterias que no son capaces de producirlas y son “prestadas” por otras. La acción de las toxinas está asociada con algunos tipos de estas vesículas (8) y en el caso de E. coli y V. cholerae, estas toxinas se transportan de manera natural formando parte de VME (9). Las VME de V. cholerae obtenidas a partir de diferentes tecnologías han inducido inmunidad protectora en animales de experimentación (10-12) y por estas razones se continúa profundizando en esta metodología.
El objetivo de este trabajo fue la caracterización proteómica de una nueva vacuna de vesículas de membrana externa contra V. cholerae (Vibrio cholerae, O1 biotipo El Tor, serotipo Ogawa, cepa C7258), obtenida por Pérez et al (10) en el Instituto Finlay de vacunas (Cuba) a través de una plataforma proteómica (electroforesis unidimensional, digestión con tripsina acoplada a HPLC y espectrometría de masa para la identificación de las proteínas componentes, utilizando bases de datos internacionales) así como el estudio de las mejores condiciones para la utilización de la electroforesis bidimensional.
La metodología para la obtención de las VME, a partir de Vibrio cholerae O1 biotipo El Tor, serotipo Ogawa, cepa C7258 fue establecida a escala piloto por Pérez et al (10) en el Instituto Finlay de vacunas (Cuba). El proyecto para la obtención de una vacuna de VME contra el cólera fue aprobado por el Comité Ético y Científico del Instituto Finlay (2002), a partir de las normas GMP. La cepa fue cultivada en medio peptona-triptona, con agitación rotacional (200 rpm), a 37 °C, con pH controlado. El resto del procedimiento está descripto por Pérez et al (10), al que se incluyó sólo el tratamiento del sedimento con SDS al 15% (0,25 mL/g de célula) en un baño de hielo con agitación lenta, durante 1 h, en lugar del resto de los detergentes. A continuación, se realizó una centrifugación a 17.700 x g, a 4 ºC, durante 30 min. Se incluyó el tratamiento de los sobrenadantes con DNasa – RNasa (0,1 mg/ 20 mL), a 37 ºC, 1 h, los cuales se centrifugaron a 17.700 x g, a 4 ºC. Posteriormente, los sobrenadantes se centrifugaron a 65.000 x g durante 8 h, a 4 ºC. Las proteínas de membrana externa sedimentadas se resuspendieron en Tris 30 mM EDTA 2 mM pH 8,5 y se filtraron a través de los filtros Minisart-Plus 0,2 µm (Sartorius). El filtrado se precipitó con etanol (hasta un 80%) y el precipitado fue conservado a –20 ºC hasta su caracterización.
Electroforesis en geles de poliacrilamida unidimensional (1D) con un sistema macro electroforético en el Instituto Nacional para Estándares Biológicos y Control (NIBSC, Reino Unido)
El procedimiento utilizado fue el mismo descripto por Padrón et al (13) para la separación de las proteínas de las VME obtenidas de Shigella sonnei (cepa A04,) aplicadas en paralelo en el mismo gel, con la incubación de las muestras con el tampón de lisis (con diferentes detergentes), a 100 °C. Se aplicaron 3 lotes de VME y las bandas fueron reveladas con el sistema Coomassie, se escanearon en un densitómetro SI Scanner (Molecular Dynamics 375, Amersham-Pharmacia) y fueron cortadas para su posterior digestión e identificación de las proteínas componentes.
Digestión del gel, análisis por espectrometría de masa y búsqueda en bases de datos realizados en el NIBSC
Las bandas electroforéticas de las VME de V. cholerae, obtenidas por electroforesis 1D y teñidas con el sistema Coomassie fueron cortadas y digeridas con tripsina. Los fragmentos se separaron e identificaron por espectrometría de masa acoplada a cromatografía líquida de alta resolución (HPLC-EM), a través de la secuenciación peptídica y el análisis de la información acerca del proteoma completo de V. cholerae (bases de datos de proteínas Swiss-Prot y TrEMBL). Las secuencias de aminoácidos generadas y cotejadas en las bases de datos permitieron identificar el tipo de proteína de V. cholerae, sin necesidad de utilizar anticuerpos monoclonales específicos.
La focalización isoeléctrica (FI) se llevó a cabo utilizando tiras de poliacrilamida e inmovilinas y un sistema IPGphor II System (Amersham, EE.UU.), en similares condiciones a las descriptas por Padrón et al. (13) para aplicación (tiras de 13 cm, 18 cm o 24 cm) y rehidratación con tampón de lisis (que contenía azul de bromofenol): 325, 450 o 600 µL, respectivamente. Las condiciones para la separación fueron: tiras de pH 3-11 NL: a) 13 cm de largo, aplicación en gel, 45 KVh; b) 13 cm, aplicación anódica en copa, 45 KVh; c) 24 cm, aplicación en gel, 60 KVh; d) 24 cm, aplicación en gel, 100 KVh. Las muestras (40 y 100 µg de proteínas) previamente tratadas con el tampón de lisis, según las condiciones propuestas por Padrón et al (13) se aplicaron de varias formas: directamente en tampón de lisis (variante en gel), con aplicación anódica con copa o aplicación catódica con copa. Las proteínas se revelaron con el sistema de tinción con plata.
Las condiciones para la identificación del contenido proteico de las VME obtenidas de Vibrio cholerae O1 biotipo El Tor, serotipo Ogawa (cepa C7258), se establecieron a partir de su extracción con SDS, en paralelo a la caracterización de las VME de Shigella sonnei realizada por Padrón et al (13). El tratamiento con el mismo tampón de lisis [urea 7 M; tiourea 2 M; 3-[(3-colamidopropil) dimetilamonio]-1-propansulfonato (CHAPS) al 2%; Tritón X-100 al 0,5%; glicerol al 15%; ditiotreitol (DTT) al 1%; Pharmalyte al 3-10 al 1% con inhibidor de proteasas] e incubación a 100 °C permitió detectar 13 bandas electroforéticas (Figura 1): 18,2; 21,6; 24,7; 26,5; 28,8; 35,2; 37,8; 42,3; 46,0; 50,3; 56,4; 58,6; 73,3 kDa, en los tres lotes de VME. Los tamaños moleculares de las bandas se determinaron utilizando patrones de referencia con una regresión: Log10 MW vs Rf: y = -0,1421x + 5,0839, r2= 0,9888.
La identificación de las proteínas se realizó a partir de los fragmentos resultantes de la degradación proteica de las bandas con tripsina, separación de los mismos y su secuenciación. A partir de la información generada de la secuenciación de al menos dos fragmentos por proteína y su comparación con las bases de datos de proteínas Swiss-Prot y TrEMBL para el proteoma de V. cholerae, se identificaron 53 proteínas (con una relación aproximada de 4 proteínas localizadas por banda electroforética), según muestra la Tabla I.
Tabla I. Identificación de las proteínas de las VME de V. cholerae a partir de su separación por electroforesis unidimensional,tratamiento enzimático de las bandas, separación y secuenciación de los fragmentos proteicos por HPLC-espectrometríade masa y la comparación de la información con bases de datos sobre el proteoma completo de Vibrio cholerae (bases de datosSwiss-Prot y TrEMBL)
Algunas de las proteínas presentes en las VME caracterizadas en el presente estudio (Tu-A, Tu-B, OmpU, AhpC, OmpV, Catalasa/peroxidasa, proteína de la familia HesB, OmpK y flagelina B) fueron predichas por Heidelberg et al (4), en el estudio del genoma de V. cholerae. Posteriormente, fueron obtenidas en el proteoma determinado por Altindis y Mekalanos (9), como parte de los estudios de inducción de la virulencia en presencia de bicarbonato para el establecimiento de condiciones óptimas en la obtención de VME.
Figura 1. Separación de las proteínas presentes en las VME de V. cholerae, O1 biotipo El Tor, serotipo Ogawa, a través de electroforesisunidimensional SDS–PAGE (Gel 12%; 1,5 mm x 12 cm x 15,5 cm; 40 mA; 13 oC). Tinción con el sistema Coomassie.
La electroforesis 2D es uno de los métodos de mayor resolución para la separación de las proteínas, dentro de la plataforma proteómica. Sin embargo, requiere una adecuada optimización para lograr la ausencia de fondos durante la separación proteica. En el presente trabajo se evaluaron diferentes condiciones en cuanto a cantidad de proteína en las muestras tratadas con tampón de lisis, tamaño de las tiras electroforéticas, modo de aplicación en las tiras y tiempo de focalización.
La conservación de las muestras en el buffer de rehidratación evitó la influencia de posibles interacciones entre las proteínas de membrana externa con los lípidos de membrana, fenómeno descripto por Uli et al como un efecto streaking (cola, fondo o sombreado) en el método bidimensional para este tipo de proteínas. En la Figura 2 se muestran las mejores condiciones de separación proteica obtenidas en el presente trabajo, a través de la electroforesis 2D.
Figura 2. Electroforesis 2D de las VME de V. cholerae tratadas con tampón de lisis y detección a través del sistema de tincióncon plata (Gel 12% de 1,5 mm x 12 cm x 15,5 cm), 40 mA, 13 ºC.A. IPG pH 3 – 11 NL, 13 cm, rehidratación con tampón de lisis que contiene bromofenol azul (325 μL), 40 μg de proteína, tiempo de focalización isoeléctrica45 kVh, aplicación anódica en copa. B. IPG pH 3 – 11 NL, 24 cm, rehidratación con tampón de lisis que contiene azul de bromofenol (600 μL), 100 μg deproteína, tiempo de focalización isoeléctrica 60 kVh, aplicación en gel.
La utilización de tiras IPG 3-11 NL, 24 cm, aplicación en gel, con tiempo de focalización de 60 kVh, resultó ser la mejor combinación que garantiza una buena resolución de las proteínas. En esta variante se incrementó el tamaño de las tiras y se compararon los resultados cuando se aplicó en una tira de menor dimensión y aplicación catódica. La variante seleccionada (Figura 2B) permitió separar un mayor número de manchas (241 manchas); mientras que en la variante de la Figura 2A se separaron 173 manchas. Ambas, incluso, constituyen variantes para una mejor separación de un mayor número de proteínas al ser comparadas con la separación unidimensional abordada en este trabajo (Tabla I; 53 proteínas). Probablemente esto se debió a la abundancia de proteínas ácidas, lo cual provocó que muchas de las manchas contuvieran múltiples proteínas que pudiesen afectar la resolución.
Estos resultados podrían avalar la futura aplicación de las condiciones propuestas para la separación proteica por electroforesis 2D, digestión con tripsina, separación e identificación de los fragmentos por espectrometría de masa para completar la identidad de un mayor número de proteínas y péptidos componentes de estas VME.
Las VME son sistemas de secreción naturales que utilizan las bacterias intestinales para colonizar la mucosa. Estas estructuras pueden contener moléculas solubles en su interior como: factores de virulencia, enzimas proteolíticas inestables, moléculas no proteicas (lipopolisacáridos), todos ellos protegidos por el entorno vesicular creado y como colofón, las proteínas de membrana externa que suelen ser porinas, otros transportadores de membrana externa bacteriana y receptores, los cuales pueden interactuar con los receptores de la superficie de las células de la mucosa intestinal (9). De esta manera, las proteínas tienen papeles críticos en la colonización del huésped, en la evasión de la respuesta inmune, el consumo de nutrientes y en el daño tisular (15).
En el presente trabajo se aprovecha la metodología utilizada para la caracterización proteómica de VME de Shigella sonnei propuesta por Padrón et al (13). De hecho, las muestras fueron evaluadas en paralelo con las evaluadas y descriptas previamente por estos autores para las VME de Shigella sonnei, en similares condiciones en cuanto a: tratamiento de las muestras, separación electroforética, digestión de las bandas, separación de fragmentos proteicos, secuenciación y comparación de los fragmentos con el proteoma de V. cholerae.
Si se compara el patrón de las 53 proteínas extraídas en el presente trabajo con el listado de posibles proteínas que deben aparecer en el proteoma de VME de buena calidad según Altindis y Mekalanos (9), 12 de las proteínas citoplasmáticas coincidieron con las descriptas (Tabla I: Factor de elongación Tu-A, proteína L6 de la subunidad ribosomal 50S, proteína de quimiotaxis aceptora de metilo, proteína chaperonina 60 kda- 1, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa, uridina fosforilasa, proteína S3 de la subunidad ribosomal 30S, enolasa y glucosa-6-fosfato isomerasa), las cuales pueden considerarse importantes para las vías de regulación genética y metabólicas de la bacteria. Por otra parte, la presencia de 5 proteínas de membrana externa (Tabla I: proteína de membrana externa OmpK, proteína de membrana externa OmpV, putativa OmpA familia de porina de membrana externa, proteína de membrana externa U, OmpU y maltoporina); también descriptas por estos autores; están relacionadas con funciones importantes en la patogénesis bacteriana. El perfil proteico de las muestras analizadas mostró una primera banda multiproteica electroforética (Tabla I) compuesta por los factores Tu-A y Tu-B que están relacionados con la promoción de la unión del aminoacil ARNt (dependiente de GTP) al sitio A de los ribosomas, durante la biosíntesis de proteínas. Estos factores han sido identificados con la regulación de la virulencia y la homeostasis de la microbiota bacteriana en la piel (16). En la bacteria V. cholerae, el factor Tu es altamente sensible a la degradación oxidativa en ausencia de la proteína chaperona Hsp33, la cual protege a la bacteria específicamente contra las condiciones de estrés que pueden causar desnaturalización proteica (17).
La familia de proteínas AhpC/TSA estuvo representada en la segunda banda (Tabla I), la referida a proteínas homólogas codificadas en el genoma de E. coli e involucradas con la resistencia antioxidante y con similitudes con la acción de la enzima glutatión peroxidasa (18). La enzima superóxido dismutasa–Fe (Q9KQF3) comparte migración electroforética con la familia de proteínas AhpC/TSA. Esta enzima comparte también un sistema de regulación (a través de una molécula de ARN regulada negativamente por la presencia de hierro en el medio de crecimiento, llamado RyHB, que regula negativamente la expresión de la enzima superóxido dismutasa) con la expresión de proteínas de membrana externa conocidas como OmpT y OmpU. A su vez, este sistema está relacionado con la homeostasis del hierro en la bacteria y la formación de la biopelícula (19).
En 1998 una nueva proteína denominada 60 kDa presente en Vibrio anguillarum fue identificada con la 60 kDa de choque térmico presente en Yersinia enterocolitica y con la proteína identificada como GroEL presente en Serratia rubidaea (20). En el presente trabajo se identificó la proteína chaperonina 1- 60 kDa (Q9KNR7) en la banda 3 (Tabla I), referida como proteína 1- GroEL, la cual evita el plegamiento erróneo y promueve el replegamiento y el ensamblaje apropiado de los polipéptidos generados en condiciones de estrés (4).
Las muestras evaluadas proporcionaron una significativa representación de proteínas de membrana externa reguladas por hierro, como: OmpK, TolC, OmpU, OmpA, maltoporina; en especial, OmpU que está representada en la banda mayoritaria 7 (A5F934). Esta proteína de membrana externa está descripta para la cepa V. cholerae serotipo O1 (cepa ATCC 39541/Classical Ogawa 395/O395; pero también fue detectada en este trabajo en las bandas minoritarias C8 y C9 (P97085), descripta para la cepa ATCC 39315/El Tor Inaba N16961. OmpU está relacionada con el mecanismo de resistencia a antibióticos in vivo y su expresión preferencial parece jugar un papel importante en la patogenicidad en el intestino al proporcionar una vía para la importación de nutrientes (21).
Por último, los resultados obtenidos demostraron la presencia de dos proteínas de la familia de las flagelinas (FlaC y FlaD). Aunque no fue posible detectar la presencia de la proteína FlaA (la mayor de las flagelinas de V. cholerae requerida para la síntesis flagelar y la movilidad) se detectaron en este trabajo otras subunidades multipoliméricas como FlaC y FlaD relacionadas con la inducción de IL-8 en las células epiteliales intestinales a través de la activación de NF-ΚB y MAPKs (22). De ahí que Tarahomjoo (23) sugirió la utilización de estas flagelinas para el diseño de vacunas contra la infección y para la inmunoterapia contra el cáncer.
Por tanto, la presencia de todas estas proteínas en la vacuna evaluada a través de la metodología proteómica propuesta y utilizada en este trabajo y el papel conocido o estimado que representan estas proteínas en los mecanismos de virulencia, patogenicidad y regulación transcripcional de la bacteria son elementos indispensables en el diseño de un producto con garantías en su respuesta protectora en humanos.
Acevedo et al (24) utilizaron preparaciones de VME extraídas con la aplicación de la metodología propuesta por Pérez et al (10), las cuales han sido caracterizadas en este trabajo. La administración de estas VME formando parte de cocleatos (AFCo2/VME) por vía intranasal en ratones (dos o tres dosis) permitió la inducción significativa de IgA en saliva y en heces mientras que en suero se obtuvo una inducción similar de IgG y respuesta de actividad vibriocida. Acevedo et al (25), también aplicaron estas VME solas (con un tamaño de 156,9+22,2 nm determinado por microscopía electrónica y con la presencia de las proteínas OmpU y MSHA, entre otras) en ratones BALB/c, por vía intranasal y acompañadas por el polisacárido Vi de Salmonella typhi. Los resultados demostraron un incremento de la respuesta de IgA al polisacárido Vi cuando está acompañado de las VME de V. cholerae, tanto en saliva como en heces así como una respuesta significativa de IgG en suero de ratones. Por tanto, se podría afirmar el uso favorable de las VME como adyuvantes naturales, incluso, para potenciar el efecto de antígenos polisacarídicos.
Es importante el hecho de que se continúe prestando atención al desarrollo y aplicación de vacunas a partir de células enteras muertas (inactivadas con formalina y tratadas con calor), de vacunas con células atenuadas; pero resulta prometedora la posibilidad de obtener una vacuna de componentes celulares que brinde una amplia protección, seguridad y que el balance costo-beneficio sea favorable, teniendo en cuenta que las poblaciones con mayor afectación son precisamente, las de países pobres.
Por tanto, la conclusión relevante de este trabajo es que la vacuna obtenida por Pérez et al (10), evaluada por Acevedo et al (24) (25) en modelos de ratones, cuenta con una composición fundamentada en proteínas que son necesarias para garantizar una respuesta inmune que proteja contra V. cholerae O1 biotipo El Tor, serotipo Ogawa, cepa C7258 y actúe como adyuvante natural para la protección contra otras bacterias entéricas.
Los autores agradecen a la Royal Society (Reino Unido) por la financiación concedida en 2007 para el desarrollo de la evaluación de las muestras de VME de Vibrio cholerae en el National Institute for Biological Standard and Control (Reino Unido), lo cual permitió que se llevara a cabo parte de este proyecto.
Tabla I. Identificación de las proteínas de las VME de V. cholerae a partir de su separación por electroforesis unidimensional,tratamiento enzimático de las bandas, separación y secuenciación de los fragmentos proteicos por HPLC-espectrometríade masa y la comparación de la información con bases de datos sobre el proteoma completo de Vibrio cholerae (bases de datosSwiss-Prot y TrEMBL)
Figura 1. Separación de las proteínas presentes en las VME de V. cholerae, O1 biotipo El Tor, serotipo Ogawa, a través de electroforesisunidimensional SDS–PAGE (Gel 12%; 1,5 mm x 12 cm x 15,5 cm; 40 mA; 13 oC). Tinción con el sistema Coomassie.
Figura 2. Electroforesis 2D de las VME de V. cholerae tratadas con tampón de lisis y detección a través del sistema de tincióncon plata (Gel 12% de 1,5 mm x 12 cm x 15,5 cm), 40 mA, 13 ºC.A. IPG pH 3 – 11 NL, 13 cm, rehidratación con tampón de lisis que contiene bromofenol azul (325 μL), 40 μg de proteína, tiempo de focalización isoeléctrica45 kVh, aplicación anódica en copa. B. IPG pH 3 – 11 NL, 24 cm, rehidratación con tampón de lisis que contiene azul de bromofenol (600 μL), 100 μg deproteína, tiempo de focalización isoeléctrica 60 kVh, aplicación en gel.
