Resumen: El ácido siálico tiene importantes funciones biológicas, muchas de las cuales determinan su participación en la respuesta inmune. El objetivo del trabajo fue comparar el efecto de Trichinella spiralis y Trichinella patagoniensis n.sp. sobre la desialización eritrocitaria. Se trabajó con 10 concentrados de larvas musculares de T. spiralis y 10 de T. patagoniensis de la misma concentración larval. Se realizó el tratamiento incubando el sedimento de eritrocitos frescos con igual volumen de concentrado larval (37 ºC), tomando muestra a los 30, 60 y 90 minutos. Los controles fueron incubados de la misma forma con solución salina. Se aplicó el método de Titulación de la Agregación por Polibrene y se determinó el CexpST. Los resultados mostraron que el valor medio del CexpST en los eritrocitos tratados con T. spiralis fue significativamente menor que en los glóbulos tratados con T. patagoniensis, para todos los tiempos estudiados. El aumento del tiempo de tratamiento también disminuyó significativamente el valor medio del CexpST para las dos especies. Éste fue significativamente menor a los 90 minutos de incubación que a los 60 minutos y éstos a su vez menores que a los 30 minutos. Se concluye que T. spiralis provocó mayor desialización eritrocitaria que T. patagoniensis en las condiciones experimentales estudiadas.
Palabras clave:Trichinella spiralisTrichinella spiralis, Trichinella patagoniensis n.sp Trichinella patagoniensis n.sp, Desialización Desialización.
Abstract: Sialic acid has important biological functions, many of which determine its participation in the immune response. The objective of this paper was to compare the effect of Trichinella spiralis and Trichinella patagoniensis n.sp. on erythrocyte desialization. Work was performed on 10 larval concentrates of muscle larvae of T. spiralis and 10 of T. patagoniensis of the same larval concentration. The treatment was carried out incubating the sediment of fresh erythrocytes with an equal volume of larval concentrate (37 °C), taking samples at 30, 60 and 90 minutes. The controls were incubated in the same way treated with saline solution. Titration of aggregation by Polybrene Method was applied and the CexpST was determined. The results showed that the mean value of CexpST in erythrocytes with T. spiralis was significantly lower than in the globules treated with T. patagoniensis, for all the studied times. The increase in treatment time also significantly decreased the mean value of CexpST for the two species, being significantly lower at 90 minutes of incubation than at 60 minutes and these in turn lower than at 30 minutes. It is concluded that T. spiralis caused greater erythrocyte desialization than T. patagoniensis in the experimental conditions studied.
Keywords: Trichinella spiralis, Trichinella patagoniensis n. sp, Desialization.
Resumo: O ácido siálico tem importantes funções biológicas, muitas das quais determinam sua participação na resposta imune. O objetivo foi comparar o efeito de Trichinella spiralis e Trichinella patagoniensis n.sp. sobre a dessialização eritrocitária. Trabalhou-se com 10 concentrados de larvas musculares de T. spiralis e 10 de T. patagoniensis da mesma concentração larval. Realizou-se o tratamento incubando o sedimento de eritrócitos frescos com igual volume de concentrado larval (37 ºC), tomando amostra aos 30, 60 e 90 minutos. Os controles foram incubados da mesma forma com solução salina. Foi aplicado o método de Titulação da Agregação por Polibrene e se determinouo CexpST. Os resultados mostraram que o valor médio do CexpST nos eritrócitos Tratados com T. spiralis foi significativamente menor que nos glóbulos tratados com T. patagoniensis, para todos os tempos estudados. O aumento do tempo de tratamento também diminuiu significativamente o valor médio do CexpST para as duas espécies, sendo significativamente menor aos 90 minutos de incubação que aos 60 minutos e eles por sua vez menores que aos 30 minutos. Conclui-se que T. spiralis provocou maior dessialização eritrocitária que T. patagoniensis nas condições experimentais estudadas.
Palavras-chave: Trichinella spiralis, Trichinella patagoniensis n. sp, Dessialização.
Inmunología
Efecto de Trichinella spiralis y de Trichinella patagoniensis n.sp. sobre la desialización
Effect of Trichinella spiralis and Trichinella patagoniensis n.sp. on desialization
Efeito de Trichinella spiralis e Trichinella patagoniensis n.sp. sobre dessialização
Federación Bioquímica de la Provincia de Buenos Aires
Recepción: 23 Agosto 2018
Aprobación: 05 Octubre 2018
En la actualidad se reconoce la existencia de más de 50 estructuras de ácidos siálicos y no sólo se están identificando nuevos, sino que, además, se está profundizando en el estudio de sus funciones (1). Los ácidos siálicos se sitúan en el extremo de las moléculas de las que forman parte y fueron hallados en vertebrados, algunos tipos de bacterias, virus e invertebrados, pero no han sido identificados en vegetales (1). Presentan importantes funciones biológicas, por lo que puede deducirse que algunas de ellas en los glucoconjugados están determinadas, al menos parcialmente, por la participación de los ácidos siálicos en su composición. Los ácidos siálicos presentes en glucoproteínas y glucolípidos están involucrados en funciones biológicas tales como procesos de reconocimiento celular, vida media de células y proteínas plasmáticas, modulación del sistema inmune y apoptosis. También son ligandos de moléculas de adhesión, mediando adhesión celular o transducción de señales (2). Su estudio ha permitido relacionarlos con enfermedades, y ya existen ejemplos concretos en infecciones bacterianas y virales. Lo mismo sucede con enfermedades parasitarias como malaria (3)(4) y tripanosomiasis (5-10). Actualmente se considera que tendrían un papel importante en la interacción parásito-hospedador, pues a pesar de que los mecanismos celulares de muchos procesos infecciosos no se conocen con exactitud, se ha comunicado que involucrarían a los glucoconjugados de superficie del parásito y del hospedador (11).
La trichinellosis es una zoonosis transmitida por consumo de carne que contiene larvas musculares del parásito Trichinella spp. En la Argentina la enfermedad es endémica y principalmente transmitida por cerdos. Durante años, la única especie involucrada en brotes humanos y focos porcinos en nuestro país fue Trichinella spiralis. Sin embargo, Krivokapich et al. (12) comunicaron la presencia de un nuevo genotipo en un puma de montaña, en la provincia de Río Negro. Este genotipo hoy es una nueva especie encapsulada: Trichinella patagoniensis (12). Estudios experimentales con esta nueva especie demostraron que los felinos y los ratones son los animales más susceptibles de adquirir la infección, mientras que los cerdos y las ratas presentan una carga parasitaria muy baja (12)(13) y en las aves domésticas, la infección no se desarrolla más allá del intestino (14).
Debido a su reciente hallazgo, los conocimientos respecto de la biología de esta nueva especie aún son escasos.
En experiencias previas, utilizando eritrocitos para el estudio de la desialización, se ha comunicado que las larvas musculares (LM) de T. spiralis alteran la agregación globular (15-19).
El objetivo del trabajo fue comparar el efecto de T. spiralis y T. patagoniensis n.sp. sobre la desializaciòn eritrocitaria.
Se trabajó con 10 concentrados de larvas musculares de T. spiralis y 10 concentrados de larvas musculares de T. patagoniensis de la misma concentración larval (1.000 ± 200 larvas/ mL)
Tratamiento de los eritrocitos
Se trabajó con tres tubos incubados a 37 ºC en baño termostatizado.
Tubo 1: 100 µL GR + 100 µL concentrado de LM de T. spiralis (GR tratados 1)
Tubo 2: 100 µL GR + 100 µL concentrado de LM de T. patagoniensis (GR tratados 2)
Tubo 3: 100 µL GR + 100 µL solución fisiológica (GR control)
Volumen final de cada tubo: 200 µL
A los 30, 60 y 90 minutos de incubación se sustrajo de cada uno de los tubos una alícuota de 65 µL, previa homogeneización, que fue recolectada en solución salina.
Se lavó por centrifugación 5 minutos, y se preparó con el sedimento globular una suspensión eritrocitaria al 20%.
Método de titulación de la agregación por Polibrene (21) El método se aplicó simultáneamente en los GR control y en los mismos eritrocitos incubados con LM de las dos especies de Trichinella. Se hicieron diluciones seriadas progresivas de Polibrene en solución salina (Puro, 1/2; 1/4; 1/8……1/128) y a continuación se colocaron en una placa de vidrio, una gota de la suspensión eritrocitaria al 20% y una gota de cada una de las diluciones de Polibrene. Se mezcló con varilla de vidrio y se homogeneizó por movimientos circulares de la placa durante 1 minuto, hasta que se produjo la agregación entre los eritrocitos con carga negativa y el policatión Polibrene.
Se evaluó la carga aniónica del control y de los GR incubados con las LM, determinando el título como la última dilución del policatión que presentó agregación. Se consideró significativa una diferencia de título ≥2 diluciones (22).
A los fines de comparar la agregación de los glóbulos incubados con LM, en relación a la del respectivo control, se la semicuantificó con cruces (4+, 3+; 2+: 1+; +/-; -) y se asignó un score a cada una según Goudemand y Marsalet (23), de acuerdo con la siguiente escala:
4+ 10
3+ 8
2+ 5
1+ 2
+/- 1 (agregación apenas visible)
Se determinó el coeficiente experimental de score total usando el método de Polibrene (CexpST) como el cociente entre el score total de la agregación (ST) de los eritrocitos incubados con las LM y el score de la agregación de los eritrocitos control (22).
Donde score total= Σ Si
Si: score individual
Este coeficiente es igual a 1 cuando no hay modificación de ácido siálico por acción del parásito y es igual a 0 cuando el tratamiento ocasiona la pérdida total del ácido siálico del eritrocito, o sea que la captación del mismo es máxima.
Se compararon los valores del CexpST para las dos especies de Trichinella y los diferentes tiempos de incubación, aplicando la técnica de análisis de la variancia y el test de comparaciones múltiples según Tukey, considerando los factores “especie” de Trichinella a dos niveles, tiempo de incubación a tres niveles y GR como factor aleatorio (24).
El valor medio del CexpST en los GR tratados 1 fue significativamente menor que en los GR tratados 2 (p<0,001) para todos los tiempos estudiados, indicando que T. spiralis provocó una mayor desializaciòn eritrocitaria que T. patagoniensis.
La disminución del título en 2 o más diluciones en relación al control se observó en 9/10 suspensiones de GR tratados con T. spiralis, (2 a los 30 minutos, 2 a los 60 y 5 a los 90 minutos), mientras que solamente se visualizó en 2/10 suspensiones de GR Tratados con T. patagoniensis (1 a los 30 y 1 a los 90 minutos de incubación).
El aumento del tiempo de tratamiento también disminuyó el valor medio del CexpST (p<0,000), el cual fue significativamente menor a los 90 minutos de incubación que a los 60 minutos y estos a su vez menores que a los 30 minutos, para las dos especies estudiadas.
Los resultados se muestran en la Tabla I y Figuras 1 y 2.
Tabla I. Valores de la media y desviación estándar del CexpST para eritrocitos tratados con T. spiralis y T. patagoniensis en los diferentes tiempos de incubación
Figura 1. Valores del CexpST para las combinaciones especie y tiempo de incubación.
Figura 2. Valores de la media de la variable CexpST para cada combinación de niveles de los factores especie y tiempo de incubación.
Los ácidos siálicos participan en la respuesta inmune, ya que inhiben la vía alternativa del complemento y tienen importantes funciones de estabilización de moléculas y membranas, así como también influencia en las interacciones de modulación con el medio ambiente. Muchas de sus funciones provienen de la fuerte carga electronegativa que poseen, como por ejemplo la unión y transporte de iones, la estabilización de la conformación de las proteínas, incluso enzimas y el mejoramiento de la viscosidad de las mucinas. Sin embargo, también pueden proteger a células y moléculas del ataque de proteasas o glucosidasas, extendiendo su tiempo de vida y sus funciones. Los ácidos siálicos además pueden regular la afinidad de receptores y modular los procesos involucrados en la señalización transmembrana, fertilización, crecimiento y diferenciación. Se ha comunicado que su efecto antioxidante es eliminador de radicales libres, lo que sería significativo en los endotelios de los vasos sanguíneos. Otro papel prominente que poseen es su dualismo, actuando como enmascaradores o como sitios de reconocimiento (25).
Debido a las variadas funciones del ácido siálico, posiblemente T. spiralis lo utilice como una manera de evadir la respuesta inmune, como se ha sido descripto en especies de Tripanosoma (5-11) o bien en alguna etapa de su metabolismo, tal como se ha comunicado en Entamoeba histolytica (26).
La experiencia realizada mostró que las larvas infectantes de T. spiralis y de T. patagoniensis n. sp provocan la desializaciòn eritrocitaria, por lo que se podría especular que lo obtendrían a partir de otros glucoconjugados que posean residuos sializados.
Las dos especies provocaron mayor desializaciòn con el aumento del tiempo de contacto con los glóbulos, tal como indicó el valor medio del CexpST de ambas, el cual fue disminuyendo a medida que el tiempo de tratamiento aumentaba.
Para cada uno de los 3 tiempos de incubación estudiados el valor medio del coeficiente fue significativamente menor para T. spiralis que para T. patagoniensis, lo que demostró que la desializaciòn era mayor en los eritrocitos cuando estuvieron en contacto con T. spiralis, en relación a cuando los mismos glóbulos se incubaron con T. patagoniensis.
Los resultados mostraron que T. spiralis capturó más ácido siálico de los eritrocitos humanos que T. patagoniensis en las condiciones experimentales estudiadas, lo que sugeriría que la relación hospedador-parásito que se establece es distinta para ambas especies y posiblemente T. spiralis tenga mayor adaptación al hombre que T. patagoniensis.
Se agradece a la Dra. María Delia Vasconi y a la Bioq. Paula Indelman el suministro de larvas musculares de ambas especies de Trichinella.
Tabla I. Valores de la media y desviación estándar del CexpST para eritrocitos tratados con T. spiralis y T. patagoniensis en los diferentes tiempos de incubación
Figura 1. Valores del CexpST para las combinaciones especie y tiempo de incubación.
Figura 2. Valores de la media de la variable CexpST para cada combinación de niveles de los factores especie y tiempo de incubación.
