Resumen: La identificación inequívoca del antígeno D en medicina transfusional es de vital importancia para evitar reacciones postransfusionales y la enfermedad hemolítica del recién nacido. Es común el uso de reactivos serológicos monoclonales o tarjetas de gel y su interpretación está definida por cruces, de acuerdo con la reacción serológica. El propósito de este estudio fue determinar la frecuencia del factor Rh y las variantes del antígeno D en una población afroecuatoriana. Se trató de un estudio descriptivo, transversal con muestreo aleatorio simple de 541 pobladores. Para la tipificación del factor Rh se utilizó la metodología en tubo con antisueros monoclonales y para la detección de las variantes de D se utilizaron tarjetas de gel IDCoombs Anti-IgG. Las lecturas se verificaron mediante el análisis del índice kappa. Se aplicó estadística descriptiva y el análisis de Chi cuadrado para establecer la relación de las variables y su significación. Se identificó una frecuencia del 92% de individuos Rh(D) positivo y un 8% Rh(D) negativo. El 4,80% de los individuos presentaban la variante D débil y el 79% reacciones serológicas entre 2 y 3(+) indicativas de otras variantes del antígeno D. El fenotipo más común fue el R0/R0. Estos datos demuestran la necesidad de confirmar la existencia de variantes del antígeno D en esta población para un mejor manejo de la sangre. Una limitante constituye la disponibilidad de técnicas moleculares para la genotipificación de D; sin embargo, se podría implementar la fenotipificación RHCE como estrategia pretransfusional.
Palabras clave:Variantes de DVariantes de D,D débilD débil,AfroecuatorianosAfroecuatorianos,FenotiposFenotipos.
Abstract: The unequivocal identification of D antigen in transfusion medicine is of vital importance to avoid post-transfusion reactions and hemolytic disease of the newborn. The use of monoclonal serological reagents or gel cards is common and their interpretation is defined according to the serological reaction by crosses. The purpose of this study was to determine the frequency of Rh factor and D antigen variants in the Afro-Ecuadorian population. This was a descriptive, cross-sectional study with simple random sampling of 541 residents. Tube typing with monoclonal antisera was used to typify Rh factor and ID-Coombs Anti-IgG gel cards were used to detect D variants, and the readings were verified by analysis of the kappa index. Descriptive statistics and Chi-square analysis were applied for the relationship of the variables and their significance. A frequency of 92% of Rh(D) positive individuals and 8% Rh(D) negative individuals were identified. Almost 5% (4.80%) of the individuals presented the weak D variant and 79% serological reactions between 2-3(+) indicative of other D antigen variants, the most common phenotype being R0/R0. These data demonstrate the need to confirm the existence of D antigen variants in this population for better management and availability of blood. A limitation is the availability of molecular techniques for D genotyping, however, RHCE phenotyping could be implemented as a pretransfusion strategy.
Keywords: Variants of D, Weak D, Afro-Ecuadorians, Phenotypes.
Resumo: A identificação inequívoca do antígeno D na medicina transfusional é de vital importância para evitar reações pós-transfusionais e a doença hemolítica do recém-nascido. É comum o uso de reagentes sorológicos monoclonais ou cartões de gel e sua interpretação é definida por cruzamentos de acordo com a reação sorológica. O objetivo deste estudo foi determinar a frequência do fator Rh e as variantes do antígeno D numa população afro-equatoriana. Foi um estudo descritivo, transversal, com amostragem aleatória simples de 541 residentes. Para a tipagem do fator Rh foi utilizada a metodologia em tubo com anti-soros monoclonais e para a detecção das variantes de D, os cartões de gel ID-Coombs Anti-IgG. As leituras foram verificadas por análise do índice kappa. Foi aplicada estatística descritiva e para estabelecer a relação das variáveis e sua significação se utilizou a análise do qui-quadrado. Identificando uma frequência de 92% dos indivíduos Rh (D) positivos e 8% Rh (D) negativos. 4,80% dos indivíduos apresentavam a variante D fraca e 79% reações sorológicas entre 2 e 3(+) indicativas de outras variantes do antígeno D, sendo o fenótipo mais comum o R0/R0. Esses dados demonstram a necessidade de confirmar a existência de variantes do antígeno D nessa população para melhor gerenciamento e disponibilidade de sangue. Uma limitação é a disponibilidade de técnicas moleculares para a genotipagem de D, no entanto, a fenotipagem de RHCE poderia ser implementada como uma estratégia de pré-transfusão.
Palavras-chave: Variantes de D, D fraco, Afro-equatorianos, Fenótipos.
INMUNOHEMATOLOGÍA
Sistema Rh-Hr y variantes del antígeno D en tres poblaciones afroecuatorianas del Valle del Chota
Rh-Hr system and D antigen variants in three Afro-Ecuadorian populations in the Chota Valley
Sistema Rh-Hr e variantes do antígeno D em três populações afro-equatorianas no vale do Chota
Federación Bioquímica de la Provincia de Buenos Aires
Recepción: 05 Noviembre 2019
Aprobación: 25 Junio 2020
El sistema Rh ha sido considerado como el de mayor importancia clínica debido a la estimulación inmune que ocasiona y a la producción de anticuerpos anti-D causantes de reacciones postransfusionales y de la enfermedad hemolítica del recién nacido (1). Las variantes comúnmente reconocidas del antígeno D son de dos clases: D débil y D parcial (2). Existen varias definiciones para determinar el verdadero significado de estas variantes: una de ellas es que los antígenos D débiles tienen un menor número de epítopes, mientras que los D parciales carecen de uno o varios (1). Estas características son difíciles de definir serológicamente ya que una reacción negativa frente a un anticuerpo monoclonal o con un método específico, no es indicativa de ausencia del epítope dado que puede tratarse de una expresión débil (1). Por otro lado, los individuos portadores de antígeno D parcial pueden producir anticuerpos anti-D, mientras que los D débil no lo hacen, pero esto depende de la respuesta inmune luego de la exposición a antígenos D positivo (1). La correcta identificación del antígeno D previene inmunizaciones posteriores y las investigaciones en este tema promueven el establecimiento de algoritmos de tipificación. En Ecuador existen escasos estudios de variantes de D en la población y, en especial, en la afroecuatoriana, por lo que la implementación de una prueba de tipificación de los antígenos D y CDE contribuiría a aumentar la seguridad transfusional de la región. Un estudio realizado en Brasil promueve la utilización de pruebas en gel para la prueba de inmunoglobulina y anti-CDE que facilita la detección de antígenos D débil y evita resultados falsamente negativos (3). En países europeos y en los Estados Unidos se evalúa la intensidad de una reacción serológica por cruces como indicativo de la existencia de variantes de D. A pesar de que la calificación de una reacción ≤2(+) es subjetiva y existe una falta de consenso, se ha establecido que ante un resultado entre 2 y 3(+) las muestras deben ser remitidas a un laboratorio de referencia para su correcta tipificación (4). Por otro lado, las personas de origen africano expresan mayoritariamente antígenos RhD parciales por lo que se corre el riesgo de aloinmunización con producción de anticuerpos anti-D (5). Varios estudios han demostrado que en estos individuos existe un enlace genético entre RHD y RHCE que produce un alelo alterado que da origen a una rara proteína Rhce, considerada como un D parcial propio de esa etnia y estimuladora de aloinmunización anti-D (6). Una alternativa es la identificación de los antígenos RHCE como una ayuda para la definición de estrategias de transfusión en personas de ascendencia africana (7).
No existen estudios de variantes de D en población afroecuatoriana, por lo que los datos obtenidos en esta investigación serán de utilidad a las autoridades sanitarias, además de promover el uso de metodologías disponibles en el país para su implementación en los servicios de medicina transfusional y bancos de sangre en beneficio de la población afroecuatoriana.
Se realizó un estudio descriptivo, transversal con muestreo aleatorio simple en el Valle del Chota. Se partió de una población finita de 4361 pobladores afroecuatorianos habitantes de la zona y que concurrían a los centros de salud tipo A1 (Salinas), al Centro de Salud Carpuela y al puesto de Salud Chalguayacu. El tamaño muestral se determinó al aplicar la fórmula de población finita; se contó para el estudio con un total de 541 individuos conformados por 429 mujeres (79,3%) y 112 hombres (20,7%) con edades comprendidas entre 10 y 65 años. En Chalguayacu, de las 226 mujeres que acudieron, el 31,40% tenían entre 18 y 25 años, cifras similares a las de Carpuela y Salinas. También se observó en Chalguayacu la presencia de hombres de 10 a 17 años, mientras que en Carpuela la edad del género masculino osciló entre 58 y 65 años (Tabla I).
Tanto para el consentimiento informado como para el estudio se obtuvo la aprobación del Comité de Bioética Código 2018-18-MB y de la Dirección de Inteligencia de la Salud MSPCURI00292-3.
Previa firma del consentimiento informado se procedió a tomar una muestra de sangre en tubos al vacío con anticoagulante EDTA-K3 (líquido) por punción venosa para un volumen de 4 mL.
Se utilizó el reactivo ARH/020, anti-D (IgM e IgG) monoclonal, lote: 129017, marca ANTEC, Registro sanitario AD-1214-07-06 técnica en tubo, para observar la presencia o ausencia de aglutinación.
Se utilizaron tarjetas de gel ID-Coombs Anti-IgG de BIO-RAD, lote 2433300407 y el reactivo ID-DiaClon Anti-D de BIO-RAD, lote 3553666201 para la confirmación de variantes de D. Se observaron los grados de aglutinación y se compararon con la cartilla de lectura proporcionada por la casa comercial. En cada grupo de pruebas se utilizaron controles de tercera opinión.
Se utilizaron tarjetas de gel Rh-Subgroups de BIO-RAD, lote 37005515201, se verificó la detección de los antígenos con células BIO-RAD, lote 06171.24.x de fenotipo conocido (C,c,E,e) y se utilizaron controles de calidad internos.
Se realizó la verificación cualitativa de las reacciones de aglutinación con la medición del índice kappa mediante 54 lecturas por cada operador, que correspondía al 10% del tamaño muestral. Con ellas se obtuvo un índice kappa de 0,829 (p<0,001).
Para el análisis de datos se utilizó el programa estadístico IBM SPSS Statistics versión 20, en el que se trabajó la estadística descriptiva (frecuencias absolutas y relativas) y para la relación de las variables y su significación estadística se aplicó el análisis Chi cuadrado.
Se determinó que el 92% de la población presentaba una reacción positiva con la metodología en tubo, que inicialmente fue clasificada como D (positiva). El análisis de la distribución del antígeno D en relación con la procedencia y género determinó que en Chalguayacu era predominante el factor RhD positivo, tanto en hombres como en mujeres; en Carpuela no existieron hombres tipificados como D negativo; mientras que en Salinas el 75% (n=12) de las mujeres fueron tipificadas como D negativo (Tabla II).
Tabla I. Distribución de la población según género, edad y zona natal
Distribución de la población según género edad y zona natal
Distribución del antígeno D en relación con el género y la localidad
Tabla II. Distribución del antígeno D en relación con el género y la localidad
El 4,80% (n=2) de las muestras que fueron identificadas inicialmente como D (negativas) fueron confirmadas luego como una variante débil de “D”. Las dos muestras confirmadas con el antígeno D débil pertenecían a personas del género femenino, con fenotipo ce (R0/r).
El 79% de los individuos presentaban reacciones serológicas <2 y 3(+), indicativas de la presencia de variantes de D y el 21% reactividad de 4(+) catalogadas como D positivas, de acuerdo con el inserto de reactivo IDDiaClon Anti-D de BIO-RAD. La localidad que presentó un mayor porcentaje de variantes de D fue Chalguayacu (46,20%), seguida de Salinas con el 38,30% y, por último Carpuela, con el 15,50% (Tabla III).
Se identificaron cinco combinaciones fenotípicas; la más frecuente fue ce (R0/R0) 33,83%, seguida de Ce (R1/R0). Para RhD (negativo) el de mayor frecuencia fue el fenotipo ce (r/r) con el 85,70% y los de menor frecuencia fueron: el fenotipo Ce (rʹ/r) con el 9,50%, seguido del fenotipo cEe (rʹʹ/r) con el 4,80%. Las dos muestras tipificadas como D débiles presentaron el fenotipo R0/r (Tabla IV). Los fenotipos identificados se encontraban distribuidos en los tres servicios de salud. El ce (R0/R0) fue el más frecuente en Chalguayacu y Carpuela y el Cce (R1/R0) en Salinas (Fig. 1). En relación con el género, en hombres el fenotipo Cce (R1/R0) tuvo una mayor frecuencia (36,53%), seguido de ce (R0/R0) 34,62%. En las mujeres el ce (R0/R0) fue el más prevalente, pero también se observó la presencia de los fenotipos Cce (R1/R0) y cEe (R2/R0).
Frecuencia de las variantes del antígeno D
Tabla III. Frecuencia de las variantes del antígeno D
Distribución de los fenotipos del sistema Rh
Tabla IV. Distribución de los fenotipos del sistema Rh
Figura 1. Distribución de los fenotipos del sistema Rh por localidad de estudio.
La prevalencia de los grupos sanguíneos es característica de cada población y etnia y su conocimiento es importante, especialmente el de los grupos eritrocitarios considerados de relevancia clínica, como el factor Rh y sus variantes, por la capacidad que tienen estos antígenos de inducir la formación de anticuerpos que ocasionan reacciones hemolíticas postransfusionales (8). Otro aspecto es la variabilidad en la frecuencia debida a la etnia. En un estudio realizado por Garratty et al., se determinó que el factor Rh(D) negativo tiene una frecuencia de 7,3% en hispanos (mexicanos, puertorriqueños, cubanos); 7,1% en negros no-hispanos, 1,7% en asiáticos (chinos, filipinos, japoneses, coreanos y vietnamitas) y de 9,7% en indios americanos (9). En el presente estudio se identificó una prevalencia del 8% de individuos afroecuatorianos D negativos. Esta información es relevante en los servicios de medicina transfusional de la región para la planificación de su stock.
Un criterio para determinar serológicamente la existencia de fenotipos D débiles o variantes es el grado de aglutinación <3(+), un criterio que a pesar de no estar estandarizado resulta aún de utilidad (4) (10). Incluso en los insertos de pruebas en gel y reactivos anti-D es considerado para la lectura de resultados. Bajo este criterio se determinó en esta investigación la existencia de 79% de individuos con reactividad entre 2 y 3(+), característica de los portadores de variantes de D; sin embargo, es común que los antígenos D parciales no sean detectados en la rutina diaria y es una de las causas de aloinmunización por exposición a transfusiones con eritrocitos D positivos (4). Se conoce que la metodología en gel es sensible para tipificación del RhD y la reactividad de 3(+) o menos es indicativa de variantes de D, por lo que constituye una buena opción para la identificación del antígeno D y sus variedades (11); sin embargo, se requiere una confirmación a través de metodologías moleculares. La distinción entre D débil y parcial depende del tipo de reactivo utilizado y disponible en cada país, ya que la concentración y tipo de anticuerpos, potenciadores de aglutinación y metodología, definen el resultado obtenido. Se ha determinado que la presencia de discrepancia es debida a la existencia de más de 200 variantes de fenotipos de D (11). Adicionalmente, en una población afrodescendiente existe una gran variación de alelos RHCE-RHD que contribuyen a un mayor índice de aloinmunización por incompatibilidad sanguínea, de modo que encontrar sangre compatible representa un reto para los servicios de medicina transfusional (12). El estudio de Gaspardi et al. reconoce la dificultad que ocasiona el desconocimiento de la composición genotípica de Rh-Hr ya que impide prevenir las aloinmunizaciones y promueve transfusiones incompatibles. Sin embargo, se reconoce la inexistencia de programas de genotipificación para donantes y pacientes (12). Ésta es una limitante que también experimentan los países en vías en desarrollo debido probablemente a los costos de implementación.
En el presente estudio se utilizaron reactivos y metodología disponibles en el Ecuador para la detección del antígeno D. Se empleó el reactivo anti-D dual (IgM e IgG), tarjetas de gel para detección de fenotipos Rh y variantes de D. Las recomendaciones dadas recientemente por la Asociación Americana de Bancos de Sangre (AABB) y el Colegio Americano de Patólogos (CAP) establecen la realización de la genotipificación de RHD cuando existen resultados discordantes o se detecta un fenotipo D débil en mujeres en edad fértil o en recién nacidos que requieran transfusiones (11). Es común que los centros de salud de primer nivel se encuentren frecuentados por mujeres jóvenes y niños, por lo que conocer su grupo sanguíneo es de trascendental importancia para evitar una aloinmunización en futuros embarazos.
A pesar de que las pruebas moleculares constituyen la mejor estrategia para confirmación de variantes de D, éstas no están disponibles aún en el país; es por esta razón que los resultados de este estudio se basaron en la evaluación de la reacción serológica. Bub et al. informaron que la combinación de pruebas serológicas y moleculares en mujeres embarazadas con antecedentes multiétnicos es importante para identificar resultados discrepantes por variantes del antígeno D y sobre todo, la genotipificación RHD facilita la toma de decisiones en la práctica obstétrica (13). En países como el Reino Unido se utilizan reactivos anti-D IgM monoclonales que no detectan las variantes débiles de D y DVI y no recomiendan la prueba de antiglobulina humana para detección de antígeno D débil. Ésta es una práctica similar a la de países como Francia, Alemania y Estados Unidos (1), que la emplean como una estrategia de tipificación. Sin embargo, en otros países es obligatoria la confirmación de resultados D negativos mediante la prueba de Coombs, debido al comportamiento serológico de la variante parcial que produce una unión débil ante anticuerpos IgM. Por esto es necesaria la detección con antiglobulina humana (Coombs) para evitar resultados falsamente negativos (14). En este estudio se detectaron dos pacientes portadoras del antígeno D débil.
Otro aspecto para considerar es la relación que tienen los tipos D parcial y débil con el origen étnico de cada población. De acuerdo con otros estudios, se observó que algunos alelos están estrechamente relacionados a grupos étnicos que determinan la frecuencia con que se presentan las variantes de D (15). También se determinaron los fenotipos del sistema Rh. El gen RHCE tiene cuatro alelos principales que codifican los antígenos Ce, CE, ce y cE y son comunes sus combinaciones (16). En el presente estudio se identificó que el fenotipo de mayor frecuencia fue el “ce” (R0/R0) en los pobladores tipificados como RhD positivos, en contraste con el estudio realizado en donantes de sangre ecuatorianos en el que el fenotipo más frecuente había sido Rz/R0 mientras que el R0/R0 únicamente se había identificado en el 3% de los donantes (17). Los fenotipos más prevalentes fueron: en los pobladores tipificados como RhD débil el R0/r y en los D negativos el r/r. Adewoyin et al. mencionaron que los fenotipos prevalentes en individuos blancos son R1, r, R2, R0, r´, r´´, Rz y ry, en contraste en la población negra, en la que son R0, r, R1, R2, r´, r´´, Rz y ry. Estos autores concluyeron que la determinación del genotipo dependía de la frecuencia de un antígeno y su combinación dependía de la etnia poblacional (8). Esto es similar a los hallazgos encontrados en los estudios realizados en Ecuador, donde las frecuencias de los fenotipos del sistema Rh entre la población mestiza y la afrodescendiente difieren. Estos resultados ponen de manifiesto que se requiere incluir una fenotipificación del factor Rh como una alternativa para evitar aloinmunizaciones posteriores en la población afroecuatoriana y realizar estudios de genotipificación para identificar las variantes del antígeno D más prevalentes en esta población. Los resultados de este estudio sin duda serán de gran utilidad para las poblaciones participantes y permitirán el desarrollo de nuevas investigaciones (16).
Las autoras agradecen a los pobladores y personal de los servicios de salud participantes del valle del Chota por su colaboración y apoyo a la realización de este estudio y a la carrera de Laboratorio Clínico de la Pontificia Universidad Católica del Ecuador.
Dirección de Investigación de la Pontificia Universidad Católica del Ecuador.
Los autores declaran no tener conflictos de intereses respecto del presente trabajo.
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Distribución de la población según género edad y zona natal
Distribución del antígeno D en relación con el género y la localidad
Frecuencia de las variantes del antígeno D
Distribución de los fenotipos del sistema Rh
