Resumen: Los estreptococos del grupo Streptococcus anginosus (EGA), también llamados “Streptococcus milleri” fueron reconocidos como parte de los estreptococos del grupo viridans (EGV) desde principios del siglo XX. Sin embargo, su rol como patógenos humanos comenzó a destacarse recién en la década de 1970. Esta actualización consta de tres partes: en esta primera parte se tratarán los aspectos taxonómicos y microbiológicos así como los métodos de identificación de los EGA. El crecimiento de estas bacterias es relativamente lento, las colonias son pequeñas, incluso a las 48-72 horas de incubación y la mayoría de las cepas despide un olor a caramelo característico cuando crecen en agar sangre. Su crecimiento es estimulado en una atmósfera con 5% de CO2. Últimamente, con el reconocimiento de la asociación de los EGA con episodios indeseables en pacientes con fibrosis quística se han desarrollado medios selectivos para poner de manifiesto su presencia en las vías aéreas. Los métodos fenotípicos e incluso algunos genotípicos carecen de precisión para identificar las tres especies del grupo (Streptococcus anginosus, Streptococcus constellatus y Streptococcus intermedius) e incluso pueden fallar en su clasificación a nivel de grupo. Dentro de los métodos moleculares, matrix-assisted laser desorption ionization–time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) no puede ser tomado como referencia para llegar a subespecie, pero sí es muy eficiente en la identificación a nivel de especie. Para algunos autores la secuenciación del gen sodA podría ser una buena opción, pero el gold standard es el multilocus sequence analysis (MLSA).
Palabras clave:Streptococcus anginosusStreptococcus anginosus,Streptococcus constellatusStreptococcus constellatus,Streptococcus intermediusStreptococcus intermedius,TaxonomíaTaxonomía,CultivoCultivo,IdentificaciónIdentificación.
Abstract: Streptococci from the Streptococcus anginosus group (SAG), also called “Streptococcus milleri”, have been recognized as belonging to the viridans group (VGS) since the beginning of the 20th century. Their role as human pathogens, however, only began to emerge in the 1970s. This review consists of three parts: the first part will deal with the taxonomic and microbiological aspects and the identification methods of SAGs. The growth of these bacteria is relatively slow; the colonies are small even after 48-72 hours of incubation and most of the strains give off a characteristic caramel odor when they grow on blood agar. Their growth is stimulated in an atmosphere with 5% CO2. Lately, with the recognition of the association of SAGs with undesirable episodes in patients with cystic fibrosis, selective media have been developed to reveal their presence in the airways. Phenotypic and even some genotypic methods lack precision in identifying the three species in the group (Streptococcus anginosus, Streptococcus constellatus, and Streptococcus intermedius) and may even fail to classify at the group level. Among the molecular methods, MALDI-TOF MS cannot be taken as a reference to arrive at subspecies, but it is very efficient to identify at the species level. For some authors, sequencing the sodA gene may be a good option, but the gold standard is multilocus sequence analysis (MLSA).
Keywords: Streptococcus anginosus, Streptococcus constellatus, Streptococcus intermedius, Taxonomy, Culture, Identification.
Resumo: Os estreptococos do grupo Streptococcus anginosus (EGA), também chamados de “Streptococcus milleri”, foram reconhecidos como pertencentes ao grupo viridans (EGV) desde o início do século XX. Seu papel como patógenos humanos, no entanto, só começou a surgir na década de 1970. Esta atualização consiste em três partes: nesta primeira parte, trataremos dos aspectos taxonômicos e microbiológicos e dos métodos de identificação dos EGAs. O crescimento dessas bactérias é relativamente lento, as colônias são pequenas mesmo após 48-72 horas de incubação e a maioria das cepas emitem um cheiro de caramelo característico quando crescem em ágar sangue. Seu crescimento é estimulado em uma atmosfera com 5% de CO2. Ultimamente, com o reconhecimento da associação dos EGAs com episódios indesejáveis em pacientes com fibrose cística, foram desenvolvidos meios seletivos para revelar sua presença nas vias aéreas. Os métodos fenotípicos e mesmo alguns genotípicos carecem de precisão na identificação das três espécies do grupo (Streptococcus anginosus, Streptococcus constellatus e Streptococcus intermedius) e podem até falhar em sua classificação em nível de grupo. Entre os métodos moleculares, matrix-assisted laser desorption ionization–time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) não pode ser tomado como referência para chegar a subespécie, mas é muito eficiente na identificação em nível de spécie. Para alguns autores, o sequenciamento do gene sodA poderia ser uma boa opção, mas o padrão-ouro é a análise de sequência multilocus (MLSA).
Palavras-chave: Streptococcus anginosus, Streptococcus constellatus, Streptococcus intermedius, Taxonomia, Cultura, Identificação.
MICROBIOLOGÍA
Estreptococos del grupo Streptococcus anginosus Parte I. Taxonomía, características microbiológicas e identificación
Streptococcus anginosus groupb Part I. Taxonomy, microbiological characteristics and identification
Estreptococos do grupo Streptococcus anginosus Parte I. Taxonomia, características microbiológicas e identificação
Federación Bioquímica de la Provincia de Buenos Aires
Recepción: 15 Junio 2020
Aprobación: 30 Julio 2020
Los estreptococos del grupo Streptococcus anginosus (EGA), también llamados “Streptococcus milleri" fueron reconocidos como pertenecientes al grupo viridans (EGV) desde principios del siglo XX; no obstante, el conocimiento de su rol en patología infecciosa humana se comenzó a difundir al promediar la década de 1970 (1) (2) y se potenció a partir de los trabajos de Ruoff y otros en las décadas siguientes (3) (4) (5).
Recién con los estudios moleculares realizados gracias a las nuevas tecnologías pudieron dilucidarse algunos aspectos de la patogenia de estos microorganismos hasta ahora desconocidos.
El objetivo de esta primera parte de la revisión fue describir los aspectos taxonómicos y microbiológicos así como los métodos de identificación de los EGA. Para ello se realizó una búsqueda selectiva de los trabajos más trascendentes en este tema a través de PubMed, SciELO y otros motores de búsqueda con las palabras Streptococcus anginosus, Streptococcus milleri, Streptococcus constellatus y Streptococcus intermedius. También se recurrió a revisiones previamente publicadas (3) (4).
En 1906 Andrewes y Horder denominaron a una bacteria beta-hemolítica como Streptococcus anginosus (6). Más tarde, en 1935, Lancefield et al. describieron a los estreptococos del grupo F dentro de los estreptococos beta-hemolíticos que formaban parte de la microbiota orofaríngea e intestinal (7).
Los EGA recibieron distintas denominaciones a lo largo de los años: “minute haemolytic streptococci” cuando se aislaban de fauces (8); “cepas de Smith y Sherman”, aisladas de materia fecal (9) y estreptococos no hemolíticos MG (10). En 1956 Güthof denominó Streptococcus milleri a una bacteria no hemolítica aislada de abscesos de la cavidad oral y que no presentaba ninguno de los antígenos de grupo descriptos por Lancefield. El nombre se eligió para honrar al microbiólogo W. D. Miller que se había dedicado al estudio de la microbiota oral (3) (11). En 1942 se llamó Streptococcus evolutus a una bacteria que luego fue considerada como S. intermedius. Ya en la década de 1920 se utilizaban nombres como S. intermedius y S. constellatus para designar EGV aislados en anaerobiosis que se diferenciaban entre sí por la fermentación de la lactosa (4). Todo esto dio origen a la especie Streptococcus MG-intermedius descripta por Atterbery et al. en 1972 como parte de la microbiota fecal humana (12).
Ottens y Winkler observaron que la mayoría de los aislados, tanto beta como gamma-hemolíticos, pertenecían al grupo F de Lancefield aunque podían tener otros de los antígenos propios de los estreptococos beta-hemolíticos (13).
Sobre la base de un análisis de la pared celular, de taxonomía numérica y de transformación del ADN, Colman y Williams agruparon bajo el nombre de S. milleri a las bacterias alfa, beta y no hemolíticas que podían aglutinar con antisueros para los grupos A, C, F y G o que no presentaban ninguno de estos antígenos (3). Sin embargo, esa revisión no fue aceptada en los EE. UU., donde Facklam encontró una gran similitud entre Streptococcus MG, S. intermedius, S. constellatus y S. anginosus y dividió el grupo ‘S. milleri’ en fermentadores de lactosa no beta-hemolíticos (S. MG-intermedius) y no fermentadores de lactosa no beta-hemolíticos (S. anginosus-constellatus) (14).
Estudios posteriores de Facklam publicados en 1984 y basados en características fisiológicas, contribuyeron a una mejor descripción de los microorganismos englobados dentro del grupo ‘S. milleri’ (S. intermedius, S. constellatus y S. anginosus), pero crearon mayor confusión por la disociación entre la nomenclatura británica y la norteamericana (15).
Resultaba evidente que el grupo ‘S. milleri’ no era homogéneo; también las especies mostraban heterogeneidad en las pruebas fenotípicas, hemólisis, seroagrupación, contenido de ácidos grasos de cadena larga, composición antigénica, proteínas celulares y contenido de guanina + citosina del ADN.
Coykendall et al., basados en estudios de ADN, propusieron incluir a estas especies en un solo grupo que se denominó S. anginosus, por ser el nombre más antiguo (16). Whiley et al. encontraron que S. anginosus, S. constellatus y S. intermedius pertenecían a grupos separados de homología de ADN. Examinaron cepas por hibridación ADN-ADN y características fenotípicas, y encontraron tres grupos génicos que se correspondían con las especies S. anginosus, S. constellatus y S. intermedius (17). Esta clasificación fue posteriormente validada por combinación de pruebas convencionales con espectrometría de masa (18). Fue así que quedó conformado el grupo S. anginosus (o grupo ‘S. milleri’, todavía utilizado como nombre de fantasía) con las tres especies S. anginosus, S. constellatus y S. intermedius (19).
En 2015 se publicaron las secuencias del genoma completo de una cepa de S. anginosus que tenía 1 924 513 pares de bases y contenía dos profagos y múltiples elementos genéticos móviles (20).
Entre 1994 y 2013 se describieron transposones (Tn3705 y MTnSag1 en S. anginosus y Tn916S en S. intermedius), una región genómica relacionada con fagos (21) (22) y en 2014 una isla cromosómica en S. anginosus y S. intermedius (23). Tabata et al. identificaron el plásmido pSAA0430-08 en una cepa de S. anginosus subsp anginosus. Este plásmido no era portador de marcadores de resistencia ni de virulencia (24).
Olson et al. informaron que estos elementos móviles podían representar hasta un 10% del genoma de los EGA (25). Hacen falta más estudios para conocer la naturaleza y la función de estos elementos.
Los métodos de identificación fenotípicos fueron completados y en parte reemplazados por métodos moleculares. Hoy, con estas nuevas tecnologías se ha podido profundizar en el conocimiento de muchos aspectos de estos estreptococos.
Los EGA pertenecen al conjunto heterogéneo conocido como “estreptococos del grupo viridans” (EGV). Éste es un grupo de microorganismos que se encuentran habitualmente colonizando la mucosa orofaríngea y los tractos gastrointestinal y genitourinario del hombre y de algunos animales. Normalmente viven en armonía con otros comensales en dichos sitios, desde donde pueden pasar a colonizar la piel en forma transitoria o a desarrollar infecciones en calidad de microorganismos oportunistas (26). El conocimiento de la secuencia completa de varios microorganismos del grupo y otros detalles de la composición molecular de los mismos ha determinado la subclasificación de las viejas especies de EGV, ahora transformadas en grupos de especies: Streptococcus mutans, Streptococcus mitis, Streptococcus sanguinis (antes Streptococcus sanguis y por varios autores incluido en el grupo S. mitis), Streptococcus salivarius, Streptococcus bovis y S. anginosus. El nombre ‘S. milleri’ no fue aprobado oficialmente y por esa razón no se debe escribir con letras cursivas (3). La especie S. anginosus, sumada a otras dos (S. intermedius y S. constellatus) comprenden el grupo S. anginosus (17) (27).
La especie S. constellatus fue desdoblada en dos subespecies: S. constellatus subsp. constellatus y S. constellatus subsp. pharyngis, esta última asociada a faringitis aguda, copero cuyo impacto en este contexto todavía es incierto (28). En 1998 se publicó un trabajo en el que se analizaron dos grupos de aislados que presentaban pruebas bioquímicas atípicas respecto de un esquema basado en los resultados de las pruebas de α-glucosidasa, hialuronidasa y sialidasa. Se diseñó un método de PCR basado en secuencias del gen 23S rRNA con una posterior hibridación de los productos con sondas de ADN específicas de especie. Se analizaron 28 aislados: 21 dieron señal al hibridar con su correspondiente sonda. De los 7 que no lo hicieron, cuatro eran rafinosa positivos, daban negativa la prueba de Voges-Proskauer y presentaban patrones bioquímicos discordantes con los de las tres especies de EGA. En el análisis filogenético se vio que estaban emparentados con Streptococcus parasanguis y que no pertenecían entonces al grupo S. anginosus. Los otros tres aislados eran del grupo C, presentaban hemólisis beta y daban positiva la prueba de hialuronidasa; filogenéticamente eran cercanas a S. anginosus (98,5-98,8% de similitud de secuencias) (29).
En 2013 se propusieron otras tres nuevas subespecies: S. anginosus subsp. anginosus y dos subespecies beta-hemolíticas que fueron aisladas de las fauces y aglutinaban con el antisuero C de Lancefield (S. anginosus subsp. whileyi y S. constellatus subsp. viborgensis) (30). No obstante, los aislados correspondientes son escasos como para poder establecer cuál es la importancia de su diferenciación.
Los EGA crecen en agar sangre y agar chocolate como colonias puntuales (no más de 0,5 mm de diámetro). El crecimiento de algunas cepas puede ser estimulado por una atmósfera enriquecida en CO2 (31) (32). Las colonias pueden ser secas y adherentes en el 75% de las cepas pertenecientes a la especie S. intermedius y en el 26% de las de la especie S. constellatus (33).
Para Kitada et al. las colonias pueden ser lisas en más de la mitad de los casos o rugosas. Algunas cepas (13,2%) forman grumos en agar infusión cerebro-corazón (BHI) (34).
En el Japón se describió un 16,5% de EGA beta-hemolíticos, un 38,5% de alfa y un 45% de no hemolíticos (34). De las cepas de origen humano estudiadas por Ball y Parker en 1979, el 19% eran alfa-hemolíticas, el 25% beta y el 56% restante no presentaban hemólisis (35).
Arinto-García et al. publicaron más recientemente resultados similares: 24,6% eran alfa-hemolíticas, el 22,6 eran beta y el 52,8%, no hemolíticas. Todos los aislados pertenecientes a las subespecies S. constellatus subsp. pharyngis, S. anginosus subsp. whileyi y S. constellatus subsp. viborgensis presentaron hemólisis beta, mientras que todos los de la especie S. intermedius eran alfa- o gamma-hemolíticos. S. anginosus subsp. anginosus y S.constellatus subsp. constellatus presentaron los tres tipos de hemólisis (36).
Los aislados beta-hemolíticos pertenecían en su mayoría a la especie S. constellatus (70,8% vs. 29,2% para los de la especie S. anginosus) y se caracterizaban porque el halo de hemólisis superaba en cinco o más veces su diámetro. En otro estudio se describieron cifras similares: S. constellatus 69%, S. anginosus 15% y S. intermedius 11% de hemólisis beta a las 48 h en agar sangre con base de agar Columbia (33).
Una característica de gran utilidad para la sospecha inicial es que, en alrededor de un 80% de los casos, las colonias de EGA despiden un olor a caramelo característico (37). Este olor se atribuye a la producción de diacetilo en concentraciones mayores de 22 mg/L, aunque hay cepas que producen diacetilo pero no despiden olor a caramelo (38). Esta característica solo puede servir de sospecha porque también hay otros EGV que pueden presentarla y no todos los EGA lo hacen.
Un fenómeno no estudiado posteriormente fue una especie de movilidad deslizante observada en cuatro aislados de S. anginosus provenientes de muestras del tracto genitourinario (39).
El medio ácido puede estimular el crecimiento de los EGA (31). S. constellatus y S. anginosus toleran mejor los medios ácidos que S. intermedius. No obstante, bajo condiciones de anaerobiosis, S. anginosus y S. intermedius son más tolerantes a pH<4,5 que S. constellatus (40).
Para aislar estas bacterias de muestras polimicrobianas se han confeccionado distintos medios de cultivo selectivos. En el medio semiselectivo NAS (ácido nalidíxico + sulfametazina) los EGA crecían de igual modo que en medios no selectivos, pero este medio también permitía el crecimiento de otras bacterias del grupo viridans. El medio NAS consiste en una base de Sensitivity Test Agar (40 g/L) (STA Lab012; Lab M Ltd., Lancs, United Kingdom), 30 μg/mL de ácido nalidíxico, 1000 μg/mL de sulfametazina y 6% de sangre equina desfibrinada Este medio, incubado en condiciones de anaerobiosis, parecería tener un mejor rendimiento (41).
Otro medio selectivo para el aislamiento de EGA, el agar McKay, consiste de caldo nutritivo, glucosa, extracto de levadura, triptona, bicarbonato de sodio, buffer de fosfatos, cloruro de sodio, sulfato de magnesio, cloruro de calcio, Tween 80, cristal violeta, vitamina K, púrpura de bromocresol, hemina y agar. Una vez esterilizado se agrega L-arginina y una solución esterilizada por filtración de sulfadiazina, sulfato de colistina y ácido oxolínico (42). Se incluye púrpura de bromocresol como un indicador de pH colorimétrico para identificar los aislamientos que producen un ambiente ácido en este medio, una característica distintiva adicional de las colonias de los EGA. Este medio tiene como desventaja que en él pueden crecer también al menos 18 especies diferentes de otros grupos de EGV, dos tercios de las cuales también tienen la capacidad de dar colonias amarillas. Además, no inhibe el crecimiento de Staphylococcus aureus ni de otros miembros de la microbiota orofaríngea.
El medio NAS resultó ser muy superior en la recuperación de EGA de 123 muestras de materia fecal y de esputo. No obstante, la selectividad fue muy baja ya que permitió el crecimiento de muchas otras especies tanto anaeróbicas facultativas como estrictas. Dentro de las primeras se pueden destacar Burkholderia cenocepacia, Candida spp., S. aureus, otros estafilococos, Rothia mucilaginosa, Lactobacillus spp., Gemella morbillorum, Granulicatella spp., Abiotrophia defectiva, Neisseria spp., Facklamia hominis y otros EGV (43).
El medio Mitis-Salivarius es un medio selectivo y diferencial utilizado desde hace décadas en el aislamiento de estreptococos del grupo viridans. Suplementado con 0,001% de telurito de potasio y optimizado con el agregado de sulfametazina (1 g/L) y aztreonam (0,2 g/L) (MSSAA) permitió el desarrollo de EGA procedentes de saliva e impidió el crecimiento de otras bacterias, excepto enterococos (44). Otro medio selectivo es el CROSGANG-ATB, que es un medio cromogénico para Streptococcus agalactiae (CHROMagarTM StrepB) adicionado de 5% de plasma inactivado a 56 °C por 15 min, sulfadiazina (500 mg/L), sulfato de colistina (10 mg/L) y ácido nalidíxico (5 mg/L) (45).
Vandeplassche et al. desarrollaron un medio (Agar Luria Bertani con 0,31 μg/mL de triclosan e incubado en anaerobiosis) considerado selectivo por inhibir a Pseudomonas aeruginosa, S. aureus, Achromobacter xylosoxidans, R. mucilaginosa y Gemella haemolysans (46). Los autores fallaron en no ensayarlo frente a otras bacterias colonizantes habituales de la cavidad oral, tal como fuera realizado por Berardinelli (45).
El ácido lipoteicoico, que contiene poliglicerolfosfato, no está presente en todas las bacterias gram positivas y, de hecho, hay EGV que no lo poseen, como S. mitis y Streptococcus oralis. Todos los EGA analizados lo contenían, según informó un estudio realizado con extractos fenólicos de estreptococos liofilizados mediante un inmunoensayo en el que se usó un anticuerpo monoclonal específico para el poliglicerolfosfato (47).
La clasificación inicial de los estreptococos, basada en el tipo de hemólisis, si bien tuvo un sentido práctico, no refleja las relaciones genéticas de estas bacterias, dado que cepas de una misma especie pueden presentar distintos tipos de hemólisis. También puede haber ambigüedades en la diferenciación según el grupo de Lancefield (ver más adelante). Por otra parte, muchos estudios previos estuvieron basados en descripciones poco precisas (englobaban todo en la denominación EGV) o erróneas (utilizaban métodos fenotípicos clásicos, miniaturizados, automatizados y hasta moleculares imprecisos). Esto ha complicado la interpretación de las tendencias de las especies de los EGA a producir determinados tipos de infecciones o a resistir la acción de ciertos antibióticos.
Los métodos de identificación fenotípicos de los estreptococos del grupo viridans habitualmente producen resultados inciertos o erróneos cuando se los compara con métodos de referencia. No obstante, en la mayoría de los casos puede sospecharse su identidad a nivel de grupo por el olor a caramelo típico de sus colonias, la producción de acetoína en la reacción de Voges-Proskauer y algunas otras reacciones positivas o negativas (Tabla I) (Tabla II). Los EGA que dan hemólisis beta se pueden diferenciar inicialmente de otros estreptococos beta-hemolíticos por las pruebas que se muestran en la Tabla I y de otros alfa o gammahemolíticos, en forma preliminar, por las pruebas indicadas en la Tabla II.
Ruoff y Ferraro, a mediados de la década del 80, lograron diferenciar presuntivamente a los estreptococos del grupo S. anginosus del resto de los EGV en 5 horas con pruebas miniaturizadas de producción de acetoína, hidrólisis de arginina y fermentación del sorbitol (50).
Diferenciación de estreptococos beta-hemolíticos del grupo viridans (grupo S. anginosus) respecto de S. pyogenes, S. dysgalactiae subsp. equisimilis y S. agalactiae (48)
aBAC: sensibilidad a 0,04 UI de bacitracina. bPYR: pirrolidonil arilamidasa. cβ-GUR: beta-glucuronidasa. dVP: Voges-Proskauer. eESC: desarrollo de colonias negras en agar esculina. fV: variable. gNT: no agrupable por método serológico. hLas colonias despiden un olor característico a caramelo.
Identificación a nivel de grupos de especies de estreptococos del grupo viridans por pruebas bioquímicas convencionales (49)
+ Más del 90% de los aislados dam la prueba positiva. - Más del 90% de los aislados dan la prueba negativa. (+) o (-) Una minoría de los ailados dan la prueba positiva o negativa. aVP: Voges-Proskauer. bARG: arginina dihidrolasa. cESC: esculina. dMAN: manitol. eSBL: sorbitol. fS. constellatus subsp. constellatus da la prueba de esculina en forma variable. gLas especies S. cristatus, S. gordonii, S. parasanguinis y S. sanguinis dan positiva la prueba de arginina. hS. sanguinis biotipos 1 y 2 y S. gordonii dan positiva la prueba de esculina, S. parasanguinis y S. oralis la dan en forma variable y S. sanguinis biotipo 3, S. crista, S. mitis, S. peroris y S. infantis dan la prueba negativa. iS. sanguinis biotipos 1 y 2 dan variable la prueba de sorbitol. jS. mutans da la prueba de esculina en forma variable. kS. sobrinus da la prueba de sorbitol en forma variable. lS. salivarius da la prueba de urea en forma variable. mS. vestibularis da negativa la prueba de Voges-Proskauer. nS. vestibularis da la prueba de esculina en forma variable. o S. gallolyticus subsp. gallolyticus da positiva la prueba de manitol. El resto de las especies la da negativa.
La sialidasa es producida por todas las cepas de S. oralis, S. intermedius y por la mayoría de las cepas de S. mitis. Por el contrario, los otros EGV, incluso S. anginosus y S. constellatus, son uniformemente negativos (51).
Whiley et al. utilizaron esta prueba en un esquema de identificación de 3 horas basado también en la prueba de hialuronidasa y en el uso de 4-metilumbeliferil derivados fluorogénicos de α-glucosidasa, β-galactosidasa, β-D-fucosidasa, β-N-acetilgalactosaminidasa y β-N-acetilglucosaminidasa (Tabla III) (52).
En 1999 estos mismos autores definieron dos grupos dentro de los EGA beta-hemolíticos del grupo C, sobre la base de la homología de su ADN. El grupo 1 comprendía a seis cepas con un 86-100% de homología entre sí. Cinco de ellas provenían de exudados faríngeos y por eso al grupo se lo denominó S. constellatus subsp. pharyngis. Estas cepas tenían un 61-77% de relación con cepas de referencia de S. constellatus (S. constellatus subsp. constellatus). El grupo 2 (81-100% de relación intragrupo) tenía un 60-72% de homología en su ADN con cepas de referencia de S. anginosus, especie de la que se podía diferenciar por dar positiva la prueba de hialuronidasa y β-D-galactosidasa. Estos autores encontraron que la subespecie S. constellatus subsp. pharyngis daba positivas la pruebas de β-Dfucosidasa y β-N-acetilgalactosaminidasa, pero no la de sialidasa, con lo que podía diferenciarse de S. intermedius. Confirmaron también que las pruebas de hialuronidasa, β-D-fucosidasa, β-N-acetilglucosaminidasa β-N-acetilgalactosaminidasa y sialidasa eran consistentemente negativas para S. anginosus (28).
Grinwis et al. propusieron el uso de tres pruebas fenotípicas para definir especies: hialuronidasa, condroitín sulfatasa y grupo de Lancefield (53).
En 2013 se describieron las características fenotípicas de las subespecies de S. anginosus (54). Allí se confeccionó una tabla para su identificación presuntiva (Tabla IV).
No obstante, actualmente se considera que los métodos moleculares son los de elección para la identificación de estas especies y subespecies (55).
Los métodos miniaturizados y automatizados en general producen resultados poco confiables en la identificación de los EGA, incluso a nivel de grupo. Chang et al. informaron más de 20% de resultados erróneos tanto para Rapid ID32 (22,2 %), como para Api 20 Strep (59,3%) y Vitek 2 (43%) (56).
Porcentaje de positividad de pruebas fenotípicas para diferenciar las tres especies del grupo. (Modificado de 52)
Pruebas fenotípicas que caracterizan a las especies y subespecies de estreptococos del grupo S. anginosus
aS. intermedius; bS. constellatus subsp. constellatus; cS. constellatus subsp. pharyngis, todos beta-hemolíticos del grupo C; dS. constellatus subsp.viborgensis, todos beta-hemolíticos del grupo C; eStreptococcus anginosus subsp. anginosus ; f Streptococcus anginosus subsp. whileyi, todos beta-hemolíticos del grupo C; g v: variable. Se sombrearon las pruebas que mejor definen las subespecies.
Los resultados obtenidos por Rapid ID32 Strep fueron inaceptables cuando se los comparó con multilocus sequencing analysis (MLSA) (36): 10,4% de errores de género, 3,8% de mala identificación a nivel de grupo de especies dentro del género Streptococcus y 17,9% de errores a nivel de especie. Estos resultados no fueron sorprendentes dado que estas bacterias presentan gran variabilidad intraespecie en las pruebas bioquímicas, debida a su frecuente intercambio genético. Incluso la desactualización de la base de datos, tanto de los métodos miniaturizados como de los automatizados, puede aumentar los resultados erróneos si se compara el bionúmero generado con las pruebas básicas de urea, arginina, esculina, sorbitol, manitol y Voges-Proskauer o pruebas individuales del panel, para definir el grupo EGA (55).
Métodos como Fluo-Card Milleri o Wee-tabs (Key Scientific Products) pueden dar resultados incorrectos que analizados cuidadosamente pueden aproximarse a la identificación correcta (55). Por ejemplo, con Fluo-Card Milleri solo el 45% de las cepas de S. anginosus pudieron ser identificadas como tales porque el resto daba una reacción positiva con la β-fucosidasa. No obstante, como todas las cepas de S. anginosus son β-glucosidasa negativas no se confundirían con S. intermedius. Por otra parte, la mala identificación de S. constellatus se debió a que el 24% daba positiva la prueba de β-glucosidasa. De manera que si se corrige la tabla propuesta por el fabricante según las pautas recomendadas por Suommanen et al. (Tabla V) podría utilizarse este método para una identificación presuntiva de las especies de EGA.
El método Fluo-Card Milleri fue estudiado también por Flynn y Ruoff en 1995. Lo compararon con su método convencional de reacciones con metilumbeliferil derivados de varias sustancias. Su correlación fue del 98% para S. anginosus, 97% para S. constellatus y 88% para S. intermedius. Sin embargo, no fue comparado con ningún método de referencia (57). En otro estudio, el Fluo-Card y el Api20 Strep no dieron buenos resultados al ser comparados con métodos moleculares: un 23% de los aislados de S. constellatus hubieran sido identificados como S. intermedius o S. anginosus por los métodos fenotípicos. Además, el 8% de las cepas no reaccionaron en la plataforma Fluo-Card (33).
Para llegar a identificar especies dentro del grupo, Summanen et al. evaluaron varios métodos fenotípicos y los contrastaron contra dos métodos moleculares para llegar a identificar especies dentro del grupo (55).
Las tres especies no pudieron separarse con el equipo API 20 Strep. No obstante, S. intermedius podría diferenciarse de las otras dos especies por las reacciones betagalactosidasa (ONPG) y beta-N-acetil-glucosaminidasa. La reacción de beta-glucosidasa del equipo Rapid ID 32 Strep fue útil para separar las cepas de S. anginosus de S. constellatus. De esta manera, si se seleccionan correctamente las pruebas individuales clave de los equipos, se podría tener una mejor identificación de las especies (55).
En 1998 se anunció que un método comercial miniaturizado [BBL Crystal Gram-Positive (GP) Identification System; Becton Dickinson Microbiology Systems, Germany] arrojaba un 90% de resultados correctos al ser comparado con Api 20 Strep y pruebas convencionales para EGV, cuando ya existían métodos moleculares de mejor desempeño para ser utilizados como referencia. Solo 5 aislados de EGA fueron incluidos en ese estudio (58).
Pruebas utilizadas en el método comercial Fluo-Card Milleri para separar las especies de EGA y su modificación según criterios tomados de Summanen PH et al. (55)
Brigante et al. evaluaron el sistema Phoenix (Becton Dickinson Diagnostic Systems, Sparks, MD, EE.UU) para la identificación de estreptococos y enterococos. Ellos afirmaron que los mejores resultados fueron obtenidos con los EGA. Desafortunadamente utilizaron solo 8 aislados de este grupo (7 S. anginosus, 1 S. intermedius y ninguno perteneciente a la especie S. constellatus). Además, supusieron que las identificaciones coincidentes por Phoenix y por dos sistemas Api [Api 20 Strep y Rapid ID32 Strep, (bioMérieux, Marcy l’Étoile, France)] eran correctas y solo analizaron por métodos moleculares a las discordantes (59).
Un trabajo contrastado con un análisis filogenético demostró la poca confiabilidad de los métodos fenotípicos para la identificación de los EGV. Los equipos miniaturizados Rapid ID32 Strep (bioMérieux, Marcy l’Etoile, France) y STREPTOGRAM (Wako Pure Chemicals, Osaka, Japan) tuvieron mejor desempeño para la identificación de los EGA que para especies de otros grupos. Aún así, sobre 28 aislados de EGA que se probaron, hubo una cepa mal identificada por ambos y dos no identificadas por el segundo (60).
Los equipos Vitek 2 y Rapid ID32 Strep (bioMérieux, Marcy l’Etoile, France) mostraron una concordancia con el método de pirosecuenciación completa del gen rnpB del 75% y 77%, respectivamente. Los 7 EGA incluidos fueron correctamente identificados a nivel de grupo (61).
Un trabajo español evaluó un método genotípico (hibridación de secuencias parciales del gen 16S rRNA posterior a una amplificación por PCR) con lo que denominaron un método de referencia basado en pruebas diferenciales con sustratos fluorogénicos (concordancia del 80%) (Tabla VI). Los métodos comerciales también evaluados mostraron una moderada concordancia con el método molecular (76%) aunque resultaron inferiores en la identificación de S. intermedius (57,5%) (62).
Los datos obtenidos de los estudios de ADN y geles SDS-PAGE por Whiley et al. demostraron que los EGA podrían dividirse en tres grupos distintos estrechamente relacionados. La inclusión de cepas de S. constellatus, S. intermedius y S. anginosus en grupos separados se correlacionó con los resultados de Kilpper-Balz et al. (63).
Un cuarto grupo, más distantemente relacionado, estuvo integrado por variantes de S. intermedius.
De las pruebas utilizadas en dicho estudio, las más útiles parecieron ser la producción de ácido de amigdalina y lactosa, la producción de peróxido de hidrógeno y la hialuronidasa. Sin embargo, la ubicación en los distintos grupos de cepas con características bioquímicas homólogas o heterólogas resultó equívoca (64).
La mayor parte de las cepas de este grupo de especies aglutina con el antisuero F de Lancefield y todos los estreptococos del grupo F pertenecen al grupo S. anginosus (33) (65).
Algunas cepas pueden aglutinar en forma cruzada con antisueros A, C, G o directamente no aglutinan con ninguno (66). Lawrence et al. mostraron que un alto porcentaje de los estreptococos no seroagrupables y más de la mitad de los estreptococos beta-hemolíticos del grupo C aislados en California a mediados de la década de 1980 pertenecían al grupo S. anginosus (56,2%). Por otra parte, los EGA aglutinaban menos frecuentemente con los antisueros de los grupos A o G (13% y 11,9% respectivamente). Si se consideran los 91 EGA aislados, 3 pertenecían al grupo A, 27 al grupo C, 41 al F, 5 al G y 15 no pudieron ser seroagrupados (65). Otros estudios incluso informaron cifras mayores de 70% de participación de EGA dentro de los estreptococos del grupo C (67) (68). Esto llevó a Vance a alertar a los microbiólogos para no utilizar la agrupación según Lancefield como único medio para identificar estreptococos beta-hemolíticos (69).
Clarridge et al. seroagruparon EGA y encontraron que el 25% de los aislados de S. intermedius pertenecían al grupo F y el 75% restante no eran agrupables; el 36% de S. constellatus pertenecían al grupo F, el 14% al grupo C y el 50% restante no eran agrupables. Una de las cepas aglutinó tanto con el antisuero C como con el A. El 44% de los aislados de S. anginosus eran del grupo F, 26% del grupo C, 6% del grupo G y 24% no eran agrupables (33). La presencia de EGA del grupo A puede llevar a confusiones en la falsa identificación de estas cepas como S. pyogenes, si se aíslan de las fauces (70).
Resultados de las pruebas diferenciales para 180 EGA con sustratos fluorogénicos según el esquema de Whiley et al. (52)
a α-acetil neuraminidasa (sialidasa), b N-acetil-β-D-glucosaminidasa, c N-acetil-β-D-galactosaminidasa, d β-D-fucosidasa, e α-D-glucosidasa, f β-D-glucosidasa, g β-D-galactosidasa.
En Portugal se vio que entre 212 aislados 11 pertenecían al grupo A, 32 al grupo C, 73 al grupo F, 16 al grupo G y 80 no eran seroagrupables. Además, los autores notaron que todos los de grupo A eran S. anginosus subsp. anginosus, los de grupo C eran S. anginosus o S. constellatus, los de grupo F, S. anginosus subsp. anginosus y S. constellatus subsp. constellatus, los de grupo G, S. anginosus subsp. anginosus y los no agrupables eran S. anginosus subsp. anginosus, S. constellatus subsp. constellatus y S. intermedius. La mayoría de los integrantes de la especie S. intermedius carecen de antígenos de grupo (no seroagrupables). En este estudio todos (n=7) fueron no agrupables (36).
En un estudio de 29 episodios de infección por EGA en Inglaterra, se vio que el 64% eran S. anginosus, el 27% S. constellatus y el 9% S. intermedius. Casi la mitad no eran agrupables (45%) y la mayor parte de la otra mitad aglutinaron con el antisuero F (41%) (71). En Chile se observó que la mayoría de los EGA pertenecían al grupo F (59,4%) y al grupo C (26,7%) con unos pocos no agrupables (10,9%) o del grupo G (3%). El 71,3% eran beta-hemolíticos y, con las limitaciones que implica el uso de pruebas fenotípicas, el 58% pertenecerían a la especie S. constellatus, el 37% a S. anginosus y el 5% a S. intermedius (72).
La distribución de los serogrupos presenta bastante diversidad geográfica. En la India, en un estudio de estreptococos de los grupos G y C a partir de infecciones severas, se observó que de los 59 aislados de EGA ninguno aglutinó con el antisuero C (todos eran del grupo G) (73).
Los EGA han mostrado una amplia variación serológica sobre la base de hidratos de carbono de la superficie celular diferentes de los antígenos de Lancefield. En principio, Ottens et al. propusieron una clasificación en cinco serotipos (I a V) que incluían tanto a cepas agrupables como no agrupables por el método de Lancefield (13). Osano et al. describieron a su vez cinco serotipos dentro de la especie S. intermedius, que fueron también denominados I a V (74). Otros investigadores demostraron la presencia de 11 antígenos en los EGA (a – k) (75) (76) (77). Varios estudios caracterizaron inmunoquímicamente a estos serotipos (78) (79) (80) (81) (82) (83) (84) (85) (86).
En un estudio realizado en el Japón se efectuó la seroagrupación según Lancefield y también una serotipificación en base a otros hidratos de carbono de la pared. Se vio que de 91 EGA, 47 pertenecían a alguno de los grupos de Lancefield (A=1, C=8, F=33, G=5) y 42 pudieron ser serotipificados (a=3, b=20, c=6, d=1, e= 4, f= 4, g=2, k=2). Alguna correlación se observó entre las bacterias de los grupos A, C y F y los serotipos a, c y f respectivamente (75) (77).
Inoue et al. mostraron que solo dos de los 21 serotipos (f y Ottens-III) fueron idénticos. Los otros serotipos fueron independientes. De 248 cepas analizadas, 197 fueron serotipificables y 23 cepas llevaban dos antígenos de tipo. En general, los antígenos Ottens I, II, III (serotipo f), IV y Osano IV, frecuentemente junto con el grupo F de Lancefield, se encontraron en S. anginosus y S. constellatus. Además, los serotipos a, c, d, e y k se distribuyeron en S. anginosus junto con los antígenos de los grupos A, C o G, el antígeno b en S. constellatus y los antígenos g, h, i, j y Osano I, II y III en S. intermedius. Veinticinco de las cepas no tipificables podían agruparse con el método de Lancefield (principalmente eran del grupo F) (87).
En un trabajo de caracterización de EGA, en el que se definieron las especies por hibridación ADN-ADN, se informó que las bacterias de la especie S. anginosus pertenecían a los siguientes serogrupos/serotipos: A/a, no agrupable (NA)/b, C/c, NA/d, NA/e, F/f o G/k; las de la especie S. constellatus pertenecían a F/no tipificable (NT) y las de S. intermedius a NA/g, NA/h, NA/i, NA/j, o NA/NT (88). Por el contrario, en la India las cepas del grupo F eran más frecuentemente de la especie S. anginosus (67%), que de S. intermedius (25%) o S. constellatus (7%) (89).
Los primeros métodos basados en la composición molecular de las estructuras bacterianas fueron el estudio de patrones de polipéptidos derivados de células enteras en SDS-PAGE (64) y la determinación cuali y cuantitativa de los ácidos grasos por cromatografía en fase gaseosa (90).
Los EGA formaron un grupo muy homogéneo según la composición de ácidos grasos y se diferenciaron fácilmente de otros grupos. Sin embargo, dentro del grupo, Labbé et al. no pudieron diferenciar S. constellatus, S. anginosus y S. intermedius solo por la composición de ácidos grasos (91).
Diversas alternativas han sido empleadas para identificar los EGA a nivel de grupo y/o especie por métodos moleculares: primeramente la hibridación de ADN (64) (92) (93). La secuencia de la región espaciadora intergénica 16S-23S (94) (95) también fue empleada en distintas formas para identificar a los EGA.
El polimorfismo en la longitud del espaciador 16S-23S determinado por PCR proporcionó un complemento rápido y útil para la identificación de cepas de S. anginosus y S. constellatus, que no se podían diferenciar fácilmente por pruebas fenotípicas (96).
Este método puede ser de utilidad a pesar de variaciones intraespecie reconocidas por Whiley et al. para S. anginosus (tamaños de 350, 380, 450 y 600 bp en diferentes cepas) que podrían corresponder al menos a las dos subespecies posteriormente descriptas (S. anginosus subsp anginosus y S. anginosus subsp. wileyi) (97).
También se ha descripto el análisis de los polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción (RFLP, del inglés: Restriction Fragment Length Polymorphism) de los genes del ARN ribosomal 16S para identificar EGV de clasificación incierta (98).
Otros métodos de identificación a nivel de especies son el uso de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) dirigida al gen de la D-ala-D-ala ligasa (ddl) (99), la secuenciación del gen del factor Tu de elongación (tuf) (100) y la secuenciación del gen de la proteína del shock térmico (groESL) (101).
Un método de PCR dirigido al gen groESL resultó útil para diferenciar EGA del grupo C de los pertenecientes a la subespecie S. dysgalactiae subsp. equisimilis. Incluso, la amplificación por PCR acoplada a una técnica de RFLP permitió la diferenciación entre S. anginosus y S. constellatus (102).
El uso de PCR dirigida al gen ily de S. intermedius permite lograr una buena identificación de esa especie, que por otros métodos suele confundirse con S. constellatus subsp. pharyngis (103).
Otros métodos de identificación son: secuenciación del gen de la superóxido dismutasa (sodA) (104), secuenciación del gen de la proteína de recombinación y reparación (recN) (105), análisis por PCR de la longitud de las secuencias del espacio intergénico de ADN de transferencia (106) y secuenciación del gen rpoB (107).
Se desarrolló también un método de identificación para los EGA a nivel de grupo por PCR utilizando un par de cebadores basado en las secuencias específicas del grupo del gen de la proteína ligadora de penicilina 2B (pbp2b). La identificación adicional a nivel de especies o subespecies fue posible mediante una PCR múltiple con cebadores para el gen de 16S rRNA de S. anginosus, los genes de hialuronato liasa de S. intermedius y S. constellatus subsp. constellatus y el gen de la intermedilisina (ily) de S. intermedius (108).
Aunque el gen 16S rRNA ha sido utilizado por varios investigadores para la identificación de estreptococos, el intercambio genético entre especies ha limitado su aplicación (33). Se encontraron estructuras en mosaico que sugieren la probabilidad de transferencia horizontal de segmentos que componen el gen 16S rRNA entre las distintas especies del grupo S. anginosus (109).
Lal et al. exploraron características internas del gen 16S rRNA para investigar la posibilidad de su uso en la identificación preliminar de especies de estreptococos, de modo de suplementar otros métodos preexistentes. El uso de enzimas de restricción resultó de ayuda para generar marcadores que podían distinguir especies cercanas genéticamente, como son las que integran el grupo S. anginosus (110).
Olson et al. desarrollaron un método de PCR en tiempo real para identificar las especies que conforman el grupo S. anginosus, tanto a partir de cultivo puro como de muestras de esputo de pacientes fibroquísticos (111).
Otras alternativas que también mostraron algunas fallas en la identificación de EGV fueron las que se basaron en el uso de otros genes como sodA, groESL, tuf, rpoB o genes de la D-ala:D-ala ligasa en métodos de PCR simple (55) (99) (104) (112).
El método de identificación de referencia parecería ser el MLSA (113). En un estudio de 148 cepas de EGA se vio que utilizando la secuenciación de varios de estos genes (ddl, gdh, rpoB y sodA) y haciendo un análisis filogenético [multilocus sequence analysis (MLSA)], ocurrían desviaciones en los tres primeros genes, derivadas probablemente por recombinaciones con otras especies. En base a eso, Hoshino et al. propusieron la secuenciación del gen sodA como alternativa más práctica de identificación (60).
Se evaluó la tecnología de pirosecuenciación para la identificación de especies dentro del género Streptococcus. Se secuenciaron en dos reacciones las regiones variables en el gen rnpB, que codifica la subunidad de ARN de la endonucleasa P. En 43 especies no pudieron identificarse correctamente las cepas de los pares de especies S. anginosus/S. constellatus y S. infantis/S. peroris. Un total de 113 aislados de hemocultivo fueron identificados por análisis de pirosecuenciación de secuencias parciales de rnpB. Todos menos ocho pudieron ser inequívocamente asignados a una especie específica cuando se compararon los primeros 30 nucleótidos de las dos regiones de rnpB con una base de datos que comprendía 107 cepas de estreptococos (61).
Un método de PCR múltiple dirigida, entre otros, a los genes ily y moaC para detectar distintas especies de estreptococos, podría servir para identificar los EGA a nivel de grupo, ya que no discrimina entre S. anginosus y S. constellatus. Lamentablemente, los autores no probaron suficientes aislados y solo lo contrastaron contra Api 20 Strep (bioMérieux, Marcy l’Étoile, Francia) y contra pruebas convencionales (114)
Una técnica basada en la amplificación del gen pbp2b seguida de una PCR múltiple (109) fue validada para la identificación de EGA en comparación con MLSA, un método considerado de referencia. Solo falló en la diferenciación de S. constellatus subsp. pharyngis y S. constellatus subsp. viborgensis (36).
Un método de PCR en tiempo real aplicado directamente en muestras de abscesos o biopsias para el caso de pie diabético dio resultados promisorios respecto de métodos convencionales de cultivo. Detectó EGA en 13 casos en los que el cultivo resultó negativo (115).
Se describió un ensayo de PCR en tiempo real para la identificación rápida y precisa de los miembros del grupo S. anginosus. Según el análisis de la curva de melting, los EGA podrían subdividirse en dos subgrupos, cada uno asociado con diferentes ribotipos clínicamente relevantes de S. anginosus (116).
El método de hibridación con un arreglo (array) de oligonucleótidos consiste en una amplificación por PCR de las regiones ITS utilizando un par de cebadores (primers) universales, seguida de una hibridación de los productos de la PCR marcados con digoxigenina con un panel de oligonucleótidos específicos de especie inmovilizados en una membrana de nylon. Con este método se ensayaron 120 aislados de 15 especies de EGV (entre ellas, las tres del grupo S. anginosus) y 91 cepas de otras bacterias y se demostró una especificidad y sensibilidad del 100%. Se requerirá el estudio de un mayor número de cepas para validar este método (117).
Verigene Gram-positive blood culture nucleic acid test (BCGP) (Nanosphere, Northbrook, IL, Estados Unidos) es un método de microarray assay que detecta bacterias gram positivas relevantes directamente desde las botellas de hemocultivos en aproximadamente dos horas y media. La experiencia con EGA, que están dentro de los microorganismos detectables con este método, sin embargo, es escasa (118) (119).
Matrix-assisted laser desorption ionization–time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) parece identificar bien los EGA a nivel de género (100%) y especie (93,1%) previa extracción, no así cuando se emplea en forma directa. No obstante 8 de los 9 aislados de S. intermedius fueron incorrectamente identificados (120). Las tres especies que conforman el grupo presentan una similitud del 60% en los picos del espectro (121).
MALDI-TOF MS tuvo una excelente performance en comparación con MLSA: 3,3% de imposibilidad de dar resultados, 0,5% de errores de género (un caso de identificación incorrecta de S. anginosus como Clostridium halophilum), sin errores a nivel de grupo y 3,8% de errores a nivel de especie (principalmente, S. anginosus subsp. anginosus fueron mal identificados como S. constellatus subsp. pharyngis). Sin embargo, los errores en la identificación de subespecies fueron del 40,1%. En este caso fue notorio que todos los aislados pertenecientes a la subespecie S. constellatus subsp. constellatus hayan sido erróneamente identificados como S. constellatus subsp. pharyngis. Para Arinto-Garcia et al. los datos obtenidos con un score entre 1700 y 1999, normalmente considerados como de baja discriminación, en este caso, para EGA, resultaron confiables (36).
Friedrichs et al. lograron identificar correctamente 23 EGA a nivel de especie (19 S. anginosus, 2 S.constellatus y 2 S. intermedius) por MALDI-TOF MS. Se comparó con la identificación realizada en forma coincidente por tres métodos diferentes (Api 20 Strep, una reacción de PCR específica de especie y secuenciación del gen 16S rRNA) (122).
Los estudios de epidemiología molecular permiten establecer criterios de no identidad entre bacterias aisladas en el contexto de un brote, en episodios sucesivos o coexistentes de un mismo individuo o en la caracterización de grupos clonales para conocer su distribución geográfica. En el caso de los EGA se desarrollaron distintas técnicas para diferentes fines.
Jacobs et al. analizaron una colección de 267 cepas de S. anginosus mediante hibridación con sondas de oligonucleótidos en un ensayo de transferencia de línea inversa. Se reconocieron cinco ribogrupos según las sondas de oligonucleótidos del gen 16S rRNA (123).
La diversidad genética de los EGA puede estudiarse por análisis de macrorrestricción empleando el método denominado electroforesis en campos pulsados (PFGE, del inglés: pulse field gel electrophoresis). En uno de los estudios se emplearon exitosamente las enzimas SmaI y ApaI. En él se estudiaron 91 aislados epidemiológicamente no relacionados (37 comensales y 49 infectantes). Al igual que en otros estudios se observó una amplia diversidad genética y la agrupación en un dendrograma fue coherente con las especies reconocidas según la taxonomía actual (124).
Se desarrolló también un método de tipificación de EGA basado en la detección de repeticiones en tándem entre 9 loci, conocido como multilocus variable number tandem repeats fingerprint (MLVF). Este método se aplica para determinar la relación entre cepas con fines epidemiológicos (125).
Los mismos autores describieron un método de PFGE que utiliza Bsp120I en lugar de SmaI o EagI, ya que los ADN de los EGA tienen muy pocos sitios de corte para esas enzimas (126).
Obviamente, los métodos de MLSA pueden permitir la identificación de grupos clonales a través de la confección de árboles filogenéticos. Los genes “housekeeping” map, pfl, ppaC, pyk, rpoB, sodA y tuf se han utilizado para definir especies y subespecies, pero permitieron también definir clusters dentro de una misma especie (127).
Noventa y siete EGA [S. anginosus (n=34), S. constellatus (n=55) y S. intermedius (n=8)] fueron estudiados por análisis de polimorfismo de longitud de fragmentos ampliados (AFLP) para evaluar la duración de la infección o colonización. Se incluyeron un total de 97 aislamientos de EGA recuperados de 30 pacientes. El análisis del polimorfismo de longitud de fragmentos amplificados produjo patrones discriminatorios y reproducibles. Se encontraron aislamientos consecutivos de EGA con tipos de AFLP idénticos en 27 de 30 (90%) pacientes. En seis pacientes con bacteriemia, los aislados EGA de sangre y de otros sitios, apareados, mostraron tipos de AFLP idénticos (128).
Los EGA (a veces llamados estreptococos del grupo ‘S. milleri’) son un grupo heterogéneo de estreptococos que comprende tres especies (S. anginosus, S. constellatus y S. intermedius) y cinco subespecies (S. anginosus subsp anginosus, S. anginosus subsp. whileyi, S. constellatus subsp. constellatus, S. constellatus subsp. pharyngis y S. constellatus subsp. viborgensis). Crecen lentamente, forman colonias pequeñas en agar sangre y presentan los tres tipos de hemólisis. Su crecimiento es estimulado en presencia de 5% de CO.. Pueden aglutinar con los antisueros para los grupos A, C, F y G de Lancefield o no aglutinar. Se han desarrollado medios selectivos para ser utilizados en el estudio de muestras polimicrobianas. La identificación por métodos fenotípicos, tanto convencionales como miniaturizados o automatizados, frecuentemente presenta fallas que pueden minimizarse si se eligen pruebas individuales de mayor confiabilidad que si se utilizan los bionúmeros. MALDI-TOF MS es un buen método para la identificación de especies, pero para tener mayor certeza a nivel de subespecie, son necesarios otros métodos moleculares. En epidemiología molecular se pueden utilizar métodos de PFGE, AFLP o MLSA.
Este trabajo no requirió de un financiamiento específico.
Los autores declaran no tener conflictos de intereses respecto del presente trabajo.
Bioq. ELENA MARÍA BERARDINELLI
Correo electrónico: eleberardinelli@hotmail.com
Diferenciación de estreptococos beta-hemolíticos del grupo viridans (grupo S. anginosus) respecto de S. pyogenes, S. dysgalactiae subsp. equisimilis y S. agalactiae (48)
Identificación a nivel de grupos de especies de estreptococos del grupo viridans por pruebas bioquímicas convencionales (49)
Porcentaje de positividad de pruebas fenotípicas para diferenciar las tres especies del grupo. (Modificado de 52)
Pruebas fenotípicas que caracterizan a las especies y subespecies de estreptococos del grupo S. anginosus
Pruebas utilizadas en el método comercial Fluo-Card Milleri para separar las especies de EGA y su modificación según criterios tomados de Summanen PH et al. (55)
Resultados de las pruebas diferenciales para 180 EGA con sustratos fluorogénicos según el esquema de Whiley et al. (52)
