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Introducción

La medida de los anticuerpos anti-ADN bicatenario (anti-dsDNA por sus siglas en inglés) resulta de utilidad para el diagnóstico y seguimiento de pacientes con lupus eritematoso sistémico (LES) y es uno de los criterios inmunológicos de clasificación validados por el Colegio Americano de Reumatología (ACR) y el Systemic Lupus International Collaborating Clinics (SLICC) (1). Estos anticuerpos han sido detectados históricamente mediante ensayos manuales o cualitativos que fueron gradualmente reemplazados por métodos automatizados cuantitativos, de alto rendimiento y en fase sólida. Desde la descripción de las células LE por Malcolm Hargraves en 1948 (2) hasta la actualidad, los anticuerpos antidsDNA fueron intensamente estudiados y analizados por numerosas tecnologías. El radioinmunoensayo de Farr (RIA), descripto en 1969 y considerado el estándar de oro por su alta especificidad, encontró sus limitaciones relacionadas con la disponibilidad del antígeno dsDNA radiomarcado y fue reemplazado por métodos no radioactivos (3). El método de inmunofluorescencia indirecta en sustrato de Crithidia luciliae (CLIFT), desarrollado por Lars Aarden en 1975 (4), también es recomendado por su alta especificidad clínica, razón por la cual es de elección cuando se necesita confirmar un resultado positivo obtenido por otro método (5). Una menor especificidad clínica y valor predictivo positivo de CLIFT para LES fueron reportados en dos estudios de Compagno et al. (6) (7). En un trabajo de Kavanaugh et al. se analizó con mayor extensión la sensibilidad, especificidad clínica, utilidad e interpretación adecuada de los resultados obtenidos por los métodos de Farr, CLIFT y ELISA (8). La introducción de microscopios de fluorescencia automatizados con la capacidad de obtener imágenes digitales, demostró un alto nivel de concordancia con la lectura microscópica manual y permitió un enfoque del ensayo CLIFT más estandarizado, disminución de la variabilidad y mayor eficiencia, dos ventajas conocidas de la automatización (9). Si bien el método de CLIFT es conocido por su alta especificidad, tiene baja sensibilidad diagnóstica cuando se compara con los ensayos de ELISA y más recientemente, con los sistemas automatizados desarrollados durante esta última década, como el inmunoensayo enzimático fluorescente (FEIA), el inmunoensayo de partículas direccionable por láser (ALBIA) y los inmunoensayos quimioluminiscentes (CLIA) (10) (11) (12). Es importante considerar que no existe hasta el momento estandarización en la determinación de los títulos de los anticuerpos anti-dsDNA. A pesar de que ciertos ensayos hayan sido calibrados con un suero estándar internacional (OMS Wo/80), los métodos con diferente configuración y provistos por distintos fabricantes, pueden mostrar resultados discordantes a partir del análisis de las mismas muestras. Esto se explica por la existencia de diferentes poblaciones de anticuerpos anti-dsDNA en el suero de los pacientes con distinta afinidad y/o avidez, sumada a las variaciones en la configuración de los ensayos en cuanto al antígeno empleado, conjugado y condiciones de reacción que influyen en el rendimiento de cada inmunoensayo (13). Es importante considerar que la presencia de los anticuerpos anti-dsDNA es utilizada como uno de los criterios diagnósticos de LES en entornos clínicos en donde este diagnóstico es probable (14). En la verificación de una nueva metodología se evidencian varios desafíos relevantes para la interpretación y el valor de la prueba, que incluyen: control y garantía de calidad, estandarización, sensibilidad y especificidad analítica, linealidad, reproducibilidad intra e interlaboratorio, sensibilidad y especificidad clínica (15).

El objetivo del presente estudio fue verificar el desempeño del ensayo de quimioluminiscencia para anticuerpos anti-dsDNA de acuerdo con las especificaciones del fabricante y compararlo con el método CLIFT utilizado actualmente, además de analizar la necesidad de emplear más de un método en la investigación de estos autoanticuerpos.

Materiales y Métodos

Población de pacientes

Se seleccionó un total de 195 pacientes que asistieron consecutivamente al Laboratorio D’Agostino-Bruno de la ciudad de La Plata, Argentina, durante el período 2016-2018. Se utilizaron como criterios de inclusión, el diagnóstico presuntivo de enfermedades del tejido conectivo y la solicitud de anticuerpos anti-dsDNA. No se utilizaron criterios de exclusión. La población estudiada comprendió 164 mujeres y 31 hombres con una mediana de edad de 40 años (rango etario de 3-83 años). La identidad de los pacientes no fue revelada, los datos y resultados fueron anonimizados (Tabla I).

Muestras

Las muestras de sangre se obtuvieron por venopunción entre las 7:00 y 10:00 a.m., luego de un ayuno de 8 horas. El tiempo de coagulación fue de 30 minutos a temperatura ambiente utilizando tubos con gel acelerador. Los sueros obtenidos de este modo se centrifugaron durante 15 min a 3800 r.p.m. y se conservaron entre 2-8 °C durante un máximo de 10 días siguiendo las recomendaciones del fabricante del ensayo.

Inmunoensayos para anticuerpos anti-dsDNA

Se utilizó el inmunoensayo QUANTA Flash dsDNA (Inova Diagnostics, San Diego), método basado en CLIA para la determinación cuantitativa de anticuerpos IgG contra el dsDNA en suero humano, con un instrumento BIOFLASH (Biokit, Barcelona). Las partículas paramagnéticas están recubiertas con un antígeno sintético de dsDNA y la reacción luminiscente es generada con un conjugado de isoluminol. Para la cuantificación de los anticuerpos se emplean estándares internos trazables al primer preparado internacional para dsDNA (código de la OMS: Wo/80). Los resultados se expresan en UI/mL a partir de las unidades relativas de luz (RLUs) obtenidas para cada muestra. El límite superior del intervalo de referencia del percentilo 95 calculado por el fabricante fue de 26,9 UI/mL y el límite del intervalo de referencia del percentilo 99 fue de 35,8 UI/mL, por lo tanto, el valor de 27 UI/mL se estableció como punto de corte (cut-off), 27-35 UI/mL como rango equívoco o indeterminado y las muestras con valores mayores de 35 UI/mL se consideraron positivas (12). El intervalo de medición analítica del ensayo, informado por el fabricante, es de 9,8 a 666,9 UI/mL.

Tabla I. Características de la población de pacientes seleccionada (n=195)

ETCND: enfermedades del tejido conectivo no diferenciadas.

LES: lupus eritematoso sistémico.

Para el método en uso de CLIFT se utilizaron improntas Kallestad (Bio-Rad Laboratories Inc., California), con el hemoflagelado Crithidia luciliae como sustrato, que se procesaron en un sistema automatizado QUANTA Lyser^TM (Inova Diagnostics, San Diego). La observación microscópica se realizó por dos observadores con un microscopio de fluorescencia Eclipse E 400 (Nikon, Tokio). Crithidia luciliae es un microorganismo unicelular que contiene en su estructura interna una mitocondria con dsDNA circular altamente condensado (cinetoplasto). La intensidad de la fluorescencia se evalúa de manera semicuantitativa realizando diluciones seriadas a partir de una fluorescencia positiva con un título de tamizaje 1/10 (dilución de corte). La comparación de ambas metodologías se muestra en la Tabla II.

Controles de calidad

Para QUANTA Flash dsDNA se utilizó el control comercial provisto por el fabricante siguiendo las recomendaciones de uso. Para CLIFT se utilizaron sueros controles positivos de pacientes con LES y de título conocido de la seroteca del laboratorio. La evaluación externa de calidad se realizó con el Programa de Evaluación Externa de la Calidad (PEEC) de la Fundación Bioquímica Argentina (FBA), en el que se obtuvieron resultados aceptables durante el período evaluado.

Análisis estadístico

Se realizó la verificación del desempeño de la precisión para el método QUANTA Flash dsDNA de acuerdo a las guías del CLSI (documento EP15-A2) (16). Se efectuó una corrida diaria con tres réplicas para cada una de las muestras ensayadas durante cinco días consecutivos y se utilizaron tres sueros de pacientes con LES de concentraciones promedio: 45,5; 146 y 479,6 UI/mL, identificados como niveles 1, 2 y 3 (N1, N2 y N3). Se calcularon la repetibilidad (precisión intracorrida) y la precisión del laboratorio (precisión intercorrida) expresadas como desviación estándar, S_r y S_l respectivamente. Se compararon con la desviación estándar para repetibilidad (σ_r) y precisión del laboratorio (σ_l) definidas por el fabricante, mediante el cálculo de los valores de verificación para los dos tipos de señalamientos de precisión indicados. El valor de verificación es un cálculo que incluye el desvío estándar del fabricante, los grados de libertad y el punto porcentual seleccionado de la distribución Chi cuadrado (χ²) para el protocolo de 5 días con 3 réplicas. Si la desviación estándar estimada es menor o igual que el valor de verificación, se demuestra concordancia en precisión con la definida por el fabricante y la indicación se considera como condición hallada en el presente estudio. La linealidad se evaluó para tres niveles de concentración, utilizando una muestra de un paciente con diagnóstico confirmado de LES y presencia de anticuerpos anti-dsDNA por CLIFT; se diluyó dos veces, se realizaron los cálculos y la recta de regresión lineal con el software SPSS 11.5 (SPSS, EE.UU.). La medida de asociación entre las variables cualitativas se realizó mediante una tabla de contingencia de 2x2 y se obtuvo el coeficiente de concordancia Kappa de Cohen que se valoró en la escala de Landis y Koch (17). La asociación entre variables cuantitativas se estudió mediante el coeficiente de correlación Rho de Spearman (18).

Tabla II. Comparación descriptiva de los inmunoensayos para anticuerpos anti-dsDNA utilizados.

CLIA: inmunoensayo quimioluminiscente;

CLIFT: test de inmunofluorescencia indirecta en Crithidia luciliae;

N/A no aplica.

Resultados

En la Tabla III se muestran los desvíos estándar obtenidos para S_r y S_l comparados con los informados por el fabricante, σ_r y σ_l y los correspondientes CV%, para los tres niveles de concentración ensayados en la verificación del desempeño de la precisión (N1, N2 y N3). Se observó que los mismos fueron menores que los definidos por el fabricante, a excepción de S_l y (CV%). para N_l. En la Tabla IV se detallan los valores de S_r y S_l con los correspondientes valores de verificación para los mismos tres niveles analizados. Dado que los desvíos estándar hallados fueron menores que los valores de verificación calculados, se verificó el desempeño del método para precisión. Se observó que el método fue lineal en el rango de 43,9 a 494,9 UI/mL, se obtuvo la recta Y =1,0001x - 0,0319 y un coeficiente de regresión R²=0,997. El análisis de concordancia mostró un índice Kappa de 0,58 (95%IC=0,46-0,70) que correspondió con un grado de acuerdo moderado. La concordancia general fue de 87,2% (95%IC=81,8-91,2), la concordancia positiva de 90,5% (95%IC=77,9-96,2) y concordancia negativa de 86,3% (95%IC=79,9-90,8). De los 195 sueros analizados, 38 (19,5%) resultaron positivos y 133 (68,2%) negativos por ambas metodologías. Se encontraron 24 (12,3%) muestras con resultados discordantes que fueron divididas en 2 grupos: 21 CLIFT negativo/CLIA positivo (Grupo I) y 3 CLIFT positivo/CLIA negativo (Grupo II). No se hallaron valores para CLIA en el rango definido como equívoco/indeterminado. Los resultados cualitativos se muestran en la Tabla V. Los 21 sueros del Grupo I presentaron valores comprendidos en el intervalo de medida para CLIA de 35,2 a 471,4 UI/mL. Los tres registros del Grupo II tuvieron títulos para CLIFT de 1/10, 1/20 y 1/40.

Entre los 24 (12,3%) sueros discordantes, se encontraron 17 (17/24) que correspondieron a pacientes con diagnóstico clínico confirmado de LES y los 8 (8/24) restantes que correspondieron a pacientes con otras enfermedades del tejido conectivo no diferenciadas (ETCND). Los 17 sueros de pacientes con LES se agruparon de la siguiente manera: 16 en el Grupo I y 1 en el Grupo II. Para el Grupo I se observó que 12/21 sueros tuvieron resultados mayores de 70 UI/mL (10/12 LES y 2/12 ETCND), es decir que duplicaron el valor de corte de acuerdo con el criterio de clasificación SLICC-2012 para la positividad de anticuerpos anti-dsDNA. Nueve de los 21 sueros presentaron valores menores de 70 UI/mL (6/9 LES y 3/9 ETCND) (Tabla VI).

Tabla III. Repetibilidad y precisión intralaboratorio estimada comparadas con datos del fabricante, de acuerdo al procedimiento EP15-A2.

S_r y S_l: desviación estándar de la repetibilidad y del laboratorio estimada por el usuario; σ_r y σ_l: desviación estándar de la repetibilidad y del laboratorio definidos por el fabricante.

Tabla IV. Valores de verificación calculados para los tres niveles analizados, de acuerdo al procedimiento EP15-A2.

Tabla V. Resultados cualitativos obtenidos con ambas metodologías para el total de las muestras de pacientes analizadas (n=195).

CLIFT: test de inmunofluorescencia indirecta en Crithidia luciliae; CLIA: inmunoensayo quimioluminiscente.

Tabla VI. Datos clínicos y de laboratorio relevantes de los pacientes con resultados discordantes entre CLIA y CLIFT.

ND: no determinado; ETCND: enfermedad del tejido conectivo no diferenciada ; CLIFT: test de inmunofluorescencia indirecta en Crithidia luciliae; CLIA: inmunoensayo quimioluminiscente; LES: lupus eritematoso sistémico; ANA: anticuerpos antinucleares; anti-Sm: anticuerpos anti-Smith; aCL: anticuerpos anticardiolipinas; a-β2GPI: anticuerpos anti-β2 glicoproteína I; C3 y C4: componentes 3 y 4 de las proteínas del sistema del complemento; CH50: complemento hemolítico total o actividad total del complemento.

En el análisis de correlación de Spearman se obtuvo un valor de Rho=0,637 (95%IC=0,542-0,716) que indicó una asociación positiva fuerte entre los valores de CLIA y los títulos de CLIFT (Fig. 1). Los resultados obtenidos en la evaluación del desempeño del método QUANTA Flash dsDNA se muestran en la Tabla VII.

Discusión y Conclusiones

El análisis de los resultados obtenidos en la verificación del desempeño del método CLIA QUANTA Flash dsDNA, indicó que los valores de S_r, S_l y linealidad estuvieron de acuerdo con las especificaciones del fabricante, con excepción del cálculo de S_l para el nivel 1. Sin embargo, al comparar los desvíos estándar obtenidos para los tres niveles analizados con los valores de verificación calculados, se obtuvieron buenos resultados y se dio por válida la verificación del desempeño del método para precisión. Si bien en este estudio no se evaluó el rendimiento del inmunoensayo en cuanto a sensibilidad y especificidad diagnóstica, es interesante mencionar los datos del fabricante y contrastarlos con otros estudios. El fabricante reportó una sensibilidad diagnóstica de 49,1% (95% IC=45,2-52,9) y una especificidad diagnóstica de 87,5% (95% IC=84,2-90,2). En el mismo sentido, en el estudio de Infantino et al. (11) se reportaron 39,3% (95% IC=27,2-52,7) para sensibilidad y 96% (95% IC=90,1-98,9) para especificidad, mientras que Bentow et al. (12) informaron 77,2% (95% IC=71,3-82,1) y 89,8% (95% IC=87,1-92,0) respectivamente. Los valores detallados en esos estudios no fueron coincidentes debido, principalmente, a diferencias basadas en las cohortes seleccionadas de pacientes con LES. Es interesante observar la alta especificidad informada para el método de CLIA evaluado, comparable con la alta especificidad de CLIFT (10) (11). En el análisis de concordancia se obtuvo un acuerdo cualitativo moderado entre ambas metodologías. Resultados con Kappa más bajos fueron publicados en el estudio de Infantino et al. (11), al comparar el mismo método QUANTA Flash dsDNA con el ensayo CLIFT NOVA Lite dsDNA. Como fue mencionado, la posibilidad de obtener resultados discordantes entre diferentes métodos para la determinación de anticuerpos anti-dsDNA, se debe al uso de diferentes antígenos, a la configuración de los inmunoensayos y fundamentalmente a la existencia de diferentes poblaciones de anticuerpos anti-dsDNA presentes en el suero de los pacientes con LES. Por estos motivos, aunque se comparen ensayos calibrados contra el estándar internacional de referencia, se pueden obtener resultados cualitativos discordantes para la misma muestra analizada (6) (13) (19). Como se mostró en la Tabla VI, entre los 21 pacientes del Grupo I se encontraron 16/21 pacientes con diagnóstico clínico de LES y varios de ellos cumplieron también con más de un criterio inmunológico de clasificación según SLICC 2012, como fueron: positividad para ANA, Sm, anticuerpos antifosfolípidos e hipocomplementemia (pacientes numerados como 3, 8, 10, 14, 18 y 21). Es importante mencionar que para estos pacientes la mayor sensibilidad diagnóstica de CLIA respecto de CLIFT (10), es coincidente con la baja sensibilidad diagnóstica para CLIFT informada en el estudio multicéntrico de Compagno et al. (7). En el Grupo I se observó también que el paciente 1 fue ANA negativo, con un valor por CLIA de 35,2 UI/mL y no reunía los criterios inmunológicos de clasificación para LES. Sin embargo, es interesante resaltar la importancia de medir anticuerpos anti-dsDNA en pacientes ANA negativos, dado que existe un 6,2% de pacientes con LES de diagnóstico temprano que son negativos en la determinación de anticuerpos anticelulares en sustrato de células Hep-2 por IFI (20). La prevalencia de pacientes con LES que son ANA negativos varía entre 5 y 23% para diferentes ensayos comerciales de ANA (21). A su vez, se ha informado para una gran cohorte de pacientes con LES, que un 11,3% de los pacientes ANA negativos eran positivos por el método CLIA QUANTA Flash dsDNA utilizado (20).

Tabla VII. Resultados obtenidos para la evaluación del desempeño del método CLIA QUANTA Flash dsDNA.

Figura 1. Correlación cuantitativa de Spearman entre CLIA QUANTA Flash dsDNA y CLIFT.

Es interesante observar el caso de la paciente 24 del Grupo II (CLIA negativo/CLIFT positivo), donde los anticuerpos anti-dsDNA no fueron detectados por CLIA y sí fueron detectados por CLIFT con título 1/40. Este caso correspondió a una paciente con LES que además reunía otros criterios inmunológicos como positividad para ANA e hipocomplementemia.

Para la correlación de Spearman, el valor del estadístico Rho fue de 0,637 (95% IC=0,542-0,716) y se interpretó como una buena asociación cuantitativa entre los valores de CLIA y los títulos de CLIFT. Sin embargo, es necesario destacar que el método de CLIA es cuantitativo y podría ser más adecuado para el seguimiento clínico de pacientes con LES, para monitorear el tratamiento y la actividad de la enfermedad, predecir recaídas o identificar riesgo de compromiso renal y nefritis (22) (23). Varios estudios han evaluado el desempeño de diferentes inmunoensayos en el monitoreo de la actividad de la enfermedad mediante puntuaciones o scores basados en la afectación de órganos y parámetros clínicos. En estos trabajos se encontró una correlación fuerte entre la medida de los anticuerpos anti-dsDNA por el método evaluado y la actividad de la enfermedad en cohortes bien definidas de pacientes con LES (12) (24). Uno de estos índices es el SLEDAI-2K que incluye la medida de anticuerpos anti-dsDNA entre los parámetros a evaluar.

Habiendo verificado el buen desempeño del método y considerando los datos aportados por la bibliografía respecto a mejoras en la sensibilidad diagnóstica, adecuada especificidad y buena correlación de la medida con la actividad de la enfermedad, fue parte del objetivo del presente estudio determinar la estrategia en la implementación de esta nueva metodología, es decir, si se utilizará como primera línea en la determinación de anticuerpos anti-dsDNA o de manera combinada con CLIFT. De acuerdo con todas las consideraciones previas y los resultados discordantes analizados, la mejor estrategia sería utilizar ambas metodologías, lo que aumentaría la sensibilidad diagnóstica sin perder especificidad. Sin embargo, se encontró una limitación en el costo de los reactivos por determinación, superior en 4 veces al costo del método en uso de CLIFT, lo que condujo a pensar en más de una alternativa para su implementación. Teniendo presente que la mayoría de las solicitudes de anticuerpos anti-dsDNA recibidas en el laboratorio son solicitadas por médicos reumatólogos, la utilización de CLIA como primera línea podría ser más adecuada para confirmar el diagnóstico y aumentar la sensibilidad en la detección de los cambios en el curso de la enfermedad. Finalmente, se observó la importancia de utilizar dos inmunoensayos con diferentes características y desempeño analítico aceptable para la determinación de anticuerpos anti-dsDNA, como una herramienta más robusta en el diagnóstico y seguimiento de pacientes con LES (13).

Fuentes de financiación

No hubo fuentes de financiación externas para la realización del presente trabajo.

Conflictos de intereses

Los autores declaran no tener conflictos de intereses respecto del presente trabajo.

Agradecimientos

A la Dirección técnica del laboratorio D’Agostino-Bruno por contribuir con la tecnología y reactivos necesarios para la realización del estudio.

Correspondencia

Bioq. MARÍA SOLEDAD MARTÍNEZ METHOL

Laboratorio D’Agostino-Bruno

Calle 14 Nº 280, (1900) La Plata , Argentina

Correo electrónico: smartinezmethol@dagostino-bruno.com.ar

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Notas de autor

Laboratorio D’Agostino-Bruno Calle 14 Nº 280, (1900) La Plata , Argentina Correo electrónico: smartinezmethol@dagostino-bruno.com.ar

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