Caracterización del perfil de reordenamientos génicos de inmunoglobulinas y receptores de linfocitos T en leucemia linfoblástica aguda pediátrica

Pattern of immunoglobulins and T lymphocyte receptor gene rearrangements in childhood acute lymphoblastic leukemia

Caracterização do perfil de rearranjos gênicos de imunoglobulinas e receptores de linfócitos T na leucemia linfoide aguda pediátrica

La linfopoyesis resulta en la producción continua de linfocitos B y linfocitos T maduros, los cuales forman parte del sistema inmune. Ambos tipos de linfocitos expresan receptores únicos en la membrana celular que permiten el reconocimiento antigénico y su capacidad de reconocer específicamente a los antígenos se basa en la enorme diversidad de receptores (1).

Las moléculas de inmunoglobulinas (Ig) consisten en dos cadenas pesadas (lGH) y dos cadenas livianas (IGK o IGl) unidas por enlaces disulfuro, las cuales están compuestas de un dominio variable, que participa en el reconocimiento de antígenos, y un dominio constante. El dominio variable de una cadena pesada de inmunoglobulina está codificado por una recombinación de un segmento génico V (variable), D (diversidad) y J (joining, unión) mientras que en las cadenas livianas el dominio variable resulta de la recombinación de segmentos V y J (2).

Los precursores de linfocitos B comienzan reordenando en primer lugar el locus IGH con un ensamble inicial de la región variable de segmentos Dh-Jh, seguido del acoplamiento de Vh a la recombinación Dh-Jh. La recombinación de los genes de las cadenas livianas Kappa precede a la de las cadenas livianas Lambda, comenzando con el reordenamiento de Vk con Jk. La cadena Lambda sólo se reordena si las cadenas IGK no logran reorganizar sus genes de forma productiva. Para que un reordenamiento de Igλ ocurra, prácticamente todo el segmento génico IGK debe ser deletado. Este proceso de deleción sucede a través del elemento de eliminación denominado Kappa deleting element (Kde), el cual se reordena con segmentos del gen Vk o con una secuencia de señal de recombinación (SSR) en el intrón entre los segmentos Jk y el segmento constante Ck, originando los reordenamientos no funcionales Vk-Kde e Intrón-Kde, respectivamente (3). Estos reordenamientos originados son terminales, es decir que no poseen capacidad de continuar recombinándose.

Las moléculas del receptor de linfocitos T (TCR) están formadas por dos cadenas unidas por puentes disulfuro. Se han reconocido dos tipos de TCR: el TCRαβ y el TCRγδ. De forma similar a las cadenas de inmunoglobulinas, cada cadena de TCR consta de dos dominios: un dominio variable y un dominio constante donde el dominio variable de las cadenas del TCRA y TCRG está codificado por una recombinación de los segmentos génicos V y J; mientras que en el caso de cadenas TCRB y TCRD, el dominio variable resulta de una recombinación de los segmentos génicos V, D y J (1).

El reordenamiento al azar de los segmentos V, (D) y J que codifican para las regiones variables de las cadenas de Ig y TCR es mediado por un complejo de enzimas recombinasas, RAG1 y RAG2, el cual reconoce SSR ubicadas en los extremos 5’ y/o 3’ de cada segmento V, D y J codificante (4). Durante este proceso de recombinación puede producirse la deleción de algunos nucleótidos de las secuencias germinales de los segmentos utilizados, por imprecisiones del complejo enzimático involucrado. Además, por la presencia de la enzima desoxinucleotidil transferasa terminal (TdT), se produce la inserción al azar de nuevos nucleótidos en la región 3’ del ADN entre los segmentos V, D y J. De esta manera, las secuencias de los genes Ig/TCR, resultantes de las regiones de unión de los genes reordenados V-(D)-J, son únicas y específicas de cada clon linfoide que las genera, independientemente de que sea normal o maligno, y son consideradas como una “huella digital” del clon linfoide (3).

La detección y caracterización molecular de los reordenamientos de Ig y TCR tiene múltiples aplicaciones en la práctica de la Hemato-Oncología. Entre ellas, se destacan la determinación de clonalidad en procesos linfoproliferativos, el diagnóstico diferencial entre una recaída de la enfermedad leucémica original versus segundas enfermedades malignas, en la confirmación de cambios de linaje de blastos intra o postratamiento (5) (6) (7). Pero, sin dudas, una de las aplicaciones más importantes es su utilización como blanco molecular para la cuantificación de la enfermedad mínima residual (EMR) en leucemia linfoblástica aguda (LLA). Ésta es considerada como la técnica gold standard para tal determinación (8). Actualmente se ha demostrado que la EMR es uno de los factores pronósticos más importantes para la evaluación in vivo de la respuesta al tratamiento en LLA pediátrica y constituye una información esencial para la toma de decisiones clínicas acerca de la intensidad de quimioterapia que debe recibir el paciente.

Los objetivos del presente trabajo fueron evaluar la incidencia de los distintos reordenamientos de Ig/TCR, de los segmentos V, D y J involucrados, y las recombinaciones V-(D)-J más frecuentemente halladas en nuestra población de pacientes pediátricos con diagnóstico de LLA, con el fin de caracterizar los blastos leucémicos.

La población de estudio estuvo constituida por los pacientes pediátricos con diagnóstico de LLA que ingresaron a los centros participantes de la Sociedad Argentina de Hemato-Oncología Pediátrica (SAHOP), incluidos en los Protocolos de Tratamiento ALLIC-BFM 2002/HPG, ALLIC-BFM 2009/HPG, Interfant-99 e Interfant-06. Los centros participantes de SAHOP fueron: Hospital de Pediatría Prof. Dr. Juan P. Garrahan, Hospital de Niños de San Isidro, Hospital Nacional de Clínicas, Hospital del Niño Jesús de Tucumán, Hospital Eva Perón de Catamarca, Hospital Juan Pablo II de Corrientes y Hospital Avelino Castelán de Chaco.

El número de casos incluidos para analizar la incidencia de reordenamientos Ig/TCR fue de 769 pacientes, diagnosticados entre diciembre de 1999 y junio de 2018. Fueron ingresados en este estudio todos los pacientes menores de 17 años que reunieron los criterios de diagnóstico de LLA, que tuvieron estudios diagnósticos completos: morfológicos, de citometría de flujo, moleculares y citogenéticos y en los cuales fue posible la obtención de ADN para la determinación del perfil molecular de reordenamientos de Ig/TCR completo. Se excluyeron del estudio todos los pacientes que habían recibido algún tipo de tratamiento quimioterápico previo al diagnóstico de LLA y los pacientes con patologías subyacentes que son causa de comorbilidades (síndrome de Down, inmunodeficiencias, síndromes de fragilidad cromosómica, HIV+).

Las determinaciones se realizaron a partir de células mononucleares obtenidas por centrifugación con gradiente de densidad de muestras de médula ósea (o sangre periférica cuando el recuento leucocitario fue mayor de 100 x10⁹/L con evidencia de más de 80% de blastos) y preservadas a -80 °C hasta su utilización.

La caracterización de los reordenamientos Ig/TCR fue realizada a partir de ADN genómico de alto peso molecular. El ADN total correspondiente a 10⁷ células mononucleares fue extraído utilizando un kit de extracción de ADN QIAamp DNA Mini Kit .Qiagen, Alemania). Para comprobar la integridad de las muestras y la ausencia de posibles inhibidores de reacción se realizó la amplificación del gen ABL1 como control.

Las determinaciones por PCR de las recombinaciones de segmentos de las regiones variables de Ig/TCR incluyeron la búsqueda de reordenamientos completos e incompletos de IGH, IGK, TCRB, TCRG y TCRD. Los oligonucleótidos y protocolos utilizados han sido estandarizados y publicados por el grupo cooperativo europeo Biomed-2 (9). Se realizaron para ello 15 reacciones de PCR multiplex por paciente. Para la detección de reordenamientos clonales, el producto de PCR fue sometido al proceso de heteroduplex y posterior visualización mediante electroforesis en gel de poliacrilamida al 6% y observación bajo luz ultravioleta previa tinción con bromuro de etidio. Las bandas de homoduplex obtenidas fueron eluidas y secuenciadas por el método de Sanger, utilizando el equipo de secuenciación Big Dye Terminator v1.1 (Applied Biosystems, California, Estados Unidos) y el secuenciador automático de ADN (Modelo ABI3130 o ABI3500; Applied Biosystems, California, Estados Unidos). Las secuencias obtenidas fueron analizadas utilizando los programas IMGT/V-quest e Ig-Blast, de acceso libre a través de internet (10) (11) (12).

Las características clínicas, de laboratorio, de inmunofenotipo y las alteraciones genéticas de los 769 pacientes estudiados se muestran en la Tabla I.

Del total de los 769 pacientes, en el 95% (n=730) se pudo detectar al menos un reordenamiento clonal de Ig/TCR. Se detectó un promedio de 3 reordenamientos por paciente, con un rango que varió de 0 a 12. En el 5% (n=39) de los casos, no fue posible detectar recombinaciones de genes Ig/TCR. En este último grupo, el 62% de los casos correspondieron a LLA precursor B, 26% a LLA precursor T, y el 12% restante a leucemias agudas de linaje ambiguo (LALA). Adicionalmente, el 21% de los pacientes sin reordenamientos de Ig/TCR fueron menores de 1 año y la mediana de edad del grupo fue de 5,9 [0,1-15,3] años.

Teniendo en cuenta el total de pacientes que presentaron recombinaciones de segmentos Ig/TCR, en el 68% de los casos se caracterizaron reordenamientos IGH, en el 43% IGK, en el 25% se detectaron reordenamientos TCRB, en el 49% TCRG y en el 55% de los casos se encontraron recombinaciones génicas TCRD.

Un total de 2506 reordenamientos de Ig y TCR fueron caracterizados y analizados a partir de los 730 pacientes que presentaron algún producto clonal, para determinar la incidencia de las recombinaciones génicas de Ig y TCR individuales.

Se identificaron en total 1161 reordenamientos de inmunoglobulinas que comprendieron 696 recombinaciones génicas de cadenas pesadas IgH y 465 cadenas livianas Kappa, mientras que en los receptores de linfocitos T se detectaron en total 1345 reordenamientos, de los cuales 168 correspondieron a TCRB, 533 recombinaciones a TCRG y 644 a TCRD. Es decir que, del total de reordenamientos detectados, el 28% correspondieron a IGH, 19% a IGK, 7% a TCRB, 21% a TCRG y 26% a TCRD.

Con respecto a las frecuencias de reordenamientos de Ig/TCR en relación con el inmunofenotipo, en los pacientes con fenotipo LLA precursor B, se detectó una frecuencia variable de recombinaciones génicas en cadenas IGH e IGK y receptores TCR, mientras que en los casos de LLA precursor T, se observaron frecuencias significativamente mayores de reordenamientos en las cadenas TCRB, TCRG y TCRD respecto a IGH e IGK (p<0,00001) (Fig. 1).

Análisis de la región de unión V-(D)-J de los genes de inmunoglobulinas

La incidencia de las diferentes recombinaciones de segmentos V-(D)-J de las cadenas completas e incompletas de IGH e IGK se muestra en la Tabla II. Como se puede observar, los reordenamientos más frecuentes en IGH fueron las recombinaciones completas Vh-Dh-Jh, mientras que para IGK, fueron los reordenamientos que involucraron el elemento de deleción IGKde.

Tabla I
Características clínicas, de laboratorio, inmunofenotipo y alteraciones genéticas de los 769 pacientes estudiados para incidencia de reordenamientos Ig/TCR.

M: masculino. F: femenino. LLA: leucemia linfoblástica aguda. LALA: leucemia aguda de linaje ambiguo. Hiper: hiperdiploides. Hipo: hipodiploides. Crom: cromosomas.

Tabla I.Características clínicas, de laboratorio, inmunofenotipo y alteraciones genéticas de los 769 pacientes estudiados para incidencia de reordenamientos Ig/TCR.

Figura 1
Frecuencia de reordenamientos Ig/TCR del total de pacientes estudiados de acuerdo con el inmunofenotipo

Figura 1.Frecuencia de reordenamientos Ig/TCR del total de pacientes estudiados de acuerdo con el inmunofenotipo.

LLA: leucemia linfoblástica aguda. LALA: leucemia aguda de linaje ambiguo.

En la Figura 2.A se describe la incidencia de las distintas familias de segmentos génicos IGH del total de reordenamientos caracterizados y se observa que los segmentos involucrados con mayor frecuencia en las recombinaciones génicas fueron los miembros de la familia Vh3 (39%), Vh4 (21%) y Vh1 (19%), los segmentos Dh2 (32%), Dh3 (30%) y Dh6 (13%) y miembros de la familia Jh6 (36%), Jh4 (36%) y Jh5 (16%). Al analizar la frecuencia de recombinación de las distintas familias de segmentos génicos de IGH Vh con Jh4, Jh5 y Jh6, por ser los segmentos Jh más frecuentemente encontrados, se observó que los reordenamientos con el segmento VH3 fueron los más frecuentes, en el 36%, 34% y 35% de los casos, respectivamente. Adicionalmente, se observó que los reordenamientos más frecuentes que involucraron al segmento Jh4 fueron Vh3-Dh3-Jh4 y Vh4-Dh3-Jh4, para el segmento Jh5 las recombinaciones Vh3-Dh2-Jh5 y Vh4-Dh2-Jh5 y finalmente, los reordenamientos Vh3-Dh3-Jh6 y Vh3-Dh2-Jh6 para Jh6.

En cuanto a los reordenamientos en el locus IGK, los miembros de las familias Vk1 (29%), Vk2 (22%) y el reordenamiento que involucra la señal en el intrón (20%) fueron los más frecuentemente identificados, así como el elemento IGKde (66%) y las familias Jk4 (11%), y Jk2 (9%) (Fig. 2.B). Además, el segmento Jk4 se reordenó con mayor frecuencia con los segmentos Vk1 (47%), Vk2 (34%) y Vk3 (13%), cubriendo un 94% de los casos. Del total de 309 reordenamientos que involucraron al segmento IGKde, el 30% fueron intrón-Kde, el 22% Vk1-Kde y el 20% Vk2-Kde.

Con respecto a la complejidad observada en los reordenamientos, representada por nucleótidos insertados y deletados, la media de nucleótidos deletados de los segmentos Vh, Dh y Jh, de IGH fue de 5 (rango=0-49) y de nucleótidos insertados de 7 (rango=0-40). Para IGK la media de deleción de Vk, intrón, Jk y Kde y las inserciones entre las recombinaciones génicas Vk-Jk, intrón- Kde y Vk-Kde fue de 5 (rango=0-46) y 5 (rango=0-30) nucleótidos, respectivamente.

Tabla II. Incidencia detallada de los diferentes reordenamientos génicos de inmunoglobulinas caracterizados.

Tabla II
Incidencia detallada de los diferentes reordenamientos génicos de inmunoglobulinas caracterizados

Figura 2
Incidencia de familias de segmentos génicos V-(D)-J de inmunoglobulinas

Figura 2

Figura 2. Incidencia de familias de segmentos génicos V-(D)-J de inmunoglobulinas.

A. Locus IGH. B. Locus IGK.

Análisis de la región de unión V-(D)-J de los receptores de linfocitos T

En el caso de los receptores de linfocitos T, se identificaron en total 1345 reordenamientos, de los cuales 168 fueron TCRB, 533 TCRG y 644 TCRD.

La incidencia de las diferentes recombinaciones de segmentos V-(D)-J de las cadenas completas e incompletas de TCR se muestra en la Tabla III. Como se puede observar, en TCRB se encontró una proporción semejante de reordenamientos completos e incompletos, Vb-Db-Jb y Db-Jb; mientras que para TCRD, se caracterizaron con mayor frecuencia reordenamientos incompletos Vd-Dd.

Cuando se analizaron los reordenamientos del locus TCRB, se observó que las recombinaciones de segmentos más frecuentes involucraron a los miembros de la familia Vb12 (11%), Vb7 (7%); y a los segmentos Jb2,3 (16%), Jb2,5 (23%) y Јb2,7 (20%). Los segmentos Db1 y Db2 estuvieron involucrados en los reordenamientos en similares proporciones (Fig. 3.A). Pudo observarse que los segmentos Јb caracterizados con mayor frecuencia (Jb2,3, Jb2,5 y Jb2,7), se reordenaron preferentemente con el segmento Db2 formando recombinaciones génicas incompletas.

En el caso del locus TCRG, los reordenamientos más frecuentes fueron los que involucraron a los segmentos génicos Vg9 (26%), Vg2 (21%) y Vg3 (17%); y a las familias Jg1 (68%) y JPg1 (18%) (Fig. 3.B). Las recombinaciones génicas Vg2-Jg1 y Vg9-Jg1 fueron las más habitualmente halladas.

En el locus TCRD, se pudo observar que los reordenamientos que involucraron a los segmentos Vd2 (68%) y Dd3 (67%) fueron los más frecuentemente detectados (Fig. 3.C).

Tabla III. Incidencia detallada de los diferentes reordenamientos génicos del receptor de linfocitos T caracterizados.

Tabla III
Incidencia detallada de los diferentes reordenamientos génicos del receptor de linfocitos T caracterizados

Como se puede observar en la Tabla III, el 79% de los reordenamientos de TCRD detectados fueron incompletos, de los cuales, el 97% de las recombinaciones Vd-Dd correspondieron a Vd2-Dd3 y todos los reordenamientos Dd-Dd caracterizados fueron Dd2-Dd3, como resultado de la estrategia metodológica empleada. El 19% de los reordenamientos TCRD fueron recombinaciones completas con un segmento Dd. El reordenamiento Vd2-Dd3-Ja29 fue el más frecuente (60% de los casos). El 2% restante de los reordenamientos totales de TCRD fueron recombinaciones génicas completas con 2 segmentos Dd, donde el reordenamiento Vd1-Dd2-Dd3-Jd1 fue el más común.

En los reordenamientos TRDV2-TRAJ el subgrupo Vd2 se detectó con mayor frecuencia en recombinación con el gen TRAJ29 y, en menor frecuencia, con Ja36, Ja48, Ja58 y Ja61, producto de la estrategia de búsqueda utilizada.

Con respecto a la complejidad observada en los reordenamientos, representada por nucleótidos insertados y deletados, la media de nucleótidos deletados e insertados de los segmentos V-(D)-J de los productos TCRB fue de 5 (rango=0-37) y 5 (rango=0-24); TCRG 4 (rango=0-41) y 6 (rango=0-26); y TCRD 5 (rango=0-33) y 6 (rango=0-35), respectivamente.

En el presente trabajo fue realizado el estudio de la incidencia de reordenamientos de inmunoglobulinas y receptores de linfocitos T en un total de 769 pacientes pediátricos con diagnóstico de LLA. Las frecuencias halladas de los reordenamientos fueron, IGH en el 68% de los casos e IGK en el 43% (principalmente IGKde); mientras que, para los receptores de linfocitos T, TCRD fue el más frecuentemente hallado con el 55% de los casos, seguido de TCRG en el 49% y TCRB en el 25%.

Cuando se compararon las incidencias de las recombinaciones de segmentos V-(D)-J de las Ig/TCR de la población de pacientes estudiada con series internacionales se pudo observar que los reordenamientos de IGKde y TCRD mostraban una incidencia similar, en rangos de 40-43% y 55-61%, respectivamente (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20). Sin embargo, se encontró que la frecuencia de reordenamientos IGH de la población estudiada era inesperadamente menor que lo publicado previamente por grupos europeos de referencia, como los polacos, holandeses e italianos, un grupo de la India, así como por un grupo chileno, con frecuencias de 74%, 82%, 77%, 98% y 100%, respectivamente (15) (16) (17) (18) (19) (20).

En cuanto a TCRG, los resultados hallados en el presente trabajo son similares a los descriptos por el grupo polaco (21), pero difieren de los resultados publicados por el grupo brasilero quienes encontraron reordenamientos TCRG en el 69% de los pacientes (14).

El resultado de la comparación de incidencias de reordenamientos de la Argentina con otros grupos latinoamericanos, como Chile y Brasil, contradice la postulación de Scridelli et al., al suponer que regiones con similitud socioeconómica y étnica presentarían hallazgos similares (22).

Para confirmar si los factores socioeconómicos, étnicos y geográficos tienen implicancia en los perfiles de reordenamientos génicos, probablemente, debería realizarse una mayor cantidad de estudios en pacientes de diferentes poblaciones, sobre todo latinas, que incluyan además variables socioeconómicas y caracterización étnica precisa.

En cambio, cuando se compara la frecuencia de los reordenamientos Ig/TCR, pero particularmente la población de pacientes con LLA de fenotipo B, se encuentra que los reordenamientos IGH, IGKde, TCRG y TCRD presentaron una incidencia similar a la mencionada en las publicaciones internacionales (20) (21) (22) (23). Esto hace suponer que la menor incidencia de IGH y TCRG en la población total de pacientes se debería a una menor frecuencia de los reordenamientos en los casos con fenotipo LLA-T y LALA. De hecho, cuando se analizó al grupo particular de pacientes con LLA-T, se pudo observar que la incidencia de reordenamientos TCRG (68%), fue menor a la informada por un grupo brasilero que publicó frecuencias del 94% y 100%, aunque con un menor número de pacientes (14) (24).

Al evaluar la situación de los reordenamientos TCRB, se pudo observar que la incidencia en el total de la población fue similar a los resultados de grupos holandeses (17), pero en los pacientes con LLA-B (13%) fue menor que lo descripto por el grupo de Szscepanski et al., cuya frecuencia fue del 35%. Esta diferencia probablemente se debe a la diferente metodología de estudio empleada, ya que el grupo holandés utilizó la técnica de Southern blot para la caracterización clonal, la cual presenta mayor sensibilidad de detección (25). Similares hallazgos se encontraron al comparar nuestros resultados con los publicados por Van der Velden et al. que reportaron una incidencia de 33% de TCRB mediante PCR mutiplex (17).

De acuerdo con los resultados de este trabajo es de destacar que se detectaron reordenamientos génicos de TCR en LLA de fenotipo B y, en menor medida, reordenamientos de Ig en LLA T. La aparición de reordenamientos de linaje cruzado ha sido ampliamente descripta en la bibliografía, y hace referencia a la presencia de recombinaciones de segmentos V-(D)-J de TCR en linfoblastos de fenotipo B y, a la inversa, reordenamientos de cadenas pesadas y livianas de inmunoglobulinas en blastos de linaje T. Una posible explicación de este fenómeno podría ser la aberrante actividad de las recombinasas en las células transformadas, debido a una mayor actividad y en tiempos más prolongados de la acción de las enzimas RAG1 y RAG2, lo cual podría favorecer el surgimiento de reordenamientos genéticos atípicos en las células leucémicas (25). Este fenómeno contribuye enormemente en la diversidad de reordenamientos V-(D)-J en los linfoblastos ampliando la posibilidad de detección de blancos moleculares para EMR y, por otro lado, demuestra que se debe ser cauteloso en asignar linaje a una población en procesos linfoproliferativos sin realizar una exhaustiva caracterización feno-genotípica, ya que la mera presencia de reordenamientos de Ig o TCR, no es específica e indicativa de linaje B o T, respectivamente.

En el caso particular de las LLA de fenotipo T, se pudo observar una frecuencia significativamente menor de reordenamientos completos e incompletos IGH e IGK, y mayor frecuencia de reordenamientos completos e incompletos de TCRB y completos de TCRD que en el resto de los pacientes, lo cual sigue en línea con lo publicado en series internacionales donde se muestra una baja incidencia de reordenamientos de inmunoglobulinas en este grupo fenotípico (26).

Adicionalmente, se analizaron las frecuencias de los segmentos génicos variables, de diversidad y de unión en los reordenamientos Ig/TCR identificados, para determinar los perfiles V-(D)-J más frecuentemente utilizados y obtener una información más detallada de los mismos. Los reordenamientos en el locus IGH con mayor frecuencia involucraron a los miembros de la familia Vh3, Vh4y Vh1, los segmentos Dh2 y Dh3, y miembros de la familia Jh6, Jh4 y Jh5, y principalmente fueron reordenamientos completos. La frecuencia de reordenamientos Jh6 (36%) de la población estudiada fue menor que en los resultados publicados por otros grupos europeos (61%) (27).

De los reordenamientos en el locus IGK, los miembros de las familias Vk1, Vk2 e Intrón, así como IGKde (66%), Jk4 y Jk2 fueron los más frecuentemente identificados. Hallazgos similares fueron descriptos por el grupo austríaco y suizo, aunque con una incidencia menor de IGKde del 44% y 42%, respectivamente (23) (28).

En el locus TCRB, los reordenamientos mostraron un uso casi restringido del segmento génico Jb, ya que la mayoría de los reordenamientos involucraron el locus Jb2. Los segmentos Db1 y Db2 mostraron reordenarse en similares proporciones, mientras que la utilización de segmentos Vb fue muy variada, sin segmentos destacados por frecuencia. Estos hallazgos fueron similares a los publicados por Van der Velden et al. (17).

En el locus TCRG, los reordenamientos más frecuentes fueron los que involucraron a las familias génicas Vg9, y Vg2, y a las familias Jg1 y JPg1. Si se comparan los resultados de este trabajo con los del grupo brasilero, por similitud geográfica, se pueden observar pequeñas variaciones de incidencias en Vg9 (30% y 37%, respectivamente) y en Vg2 (18% y 11%, respectivamente), pero una diferencia notoria en la frecuencia de Jg1 (68% vs. 84%, respectivamente). Debe tenerse en cuenta que el grupo de trabajo brasilero analizó una población de pacientes más pequeña que la descripta en el presente trabajo (n=108) (24).

En el locus TCRD se pudo observar que el 79% de los reordenamientos detectados fueron incompletos y Vd2-Dd3 y Dd2-Dd3 fueron los más frecuentes. De los reordenamientos completos, las recombinaciones que involucraron a Ja29 y Jd1 fueron las más comúnmente caracterizadas, incluyendo en la mayoría de los casos a Vd2. Es importante aclarar que, a diferencia del reordenamiento jerárquico que ocurre en las cadenas de IGH y TCRB, donde los segmentos D se reordenan en primer lugar con segmentos J y luego V se une al DJ, en el locus TCRD, los reordenamientos VD y DD ocurren con mayor frecuencia que los DJ. Estos hallazgos han sido corroborados por los resultados de este trabajo.

Figura 3
Incidencia de familias de segmentos génicos V-(D)-J de TCR.

Figura 3. Incidencia de familias de segmentos génicos V-(D)-J de TCR.

A. Locus TCRB. B. Locus TCRG. C. Locus TCRD.

La diversidad de regiones variables de estos receptores se basa en el número de segmentos disponibles para recombinación y en la variedad de regiones de unión entre los segmentos de reordenamiento. La enzima TdT tiene un papel clave en la generación de diferentes regiones de unión.

Al analizar en detalle las características de la región de unión de los segmentos V-(D)-J de los diferentes reordenamientos se pudo observar que los tamaños entre ellos eran similares, tanto en reordenamientos completos como incompletos, con un promedio total de inserción de 6 nucleótidos en un rango de 0 a 40. Las deleciones de los segmentos V, D y J detectadas en los diferentes reordenamientos génicos, también fueron similares, con una media de deleción en segmentos V de 4 nucleótidos, de 4 en D y de 5 en segmentos J.

Los resultados que forman parte del presente trabajo constituyen el primer estudio multicéntrico realizado en la Argentina sobre la detección y caracterización de reordenamientos génicos de inmunoglobulinas y receptores de linfocitos T en un número muy significativo de pacientes con diagnóstico de LLA. El hecho de haber sido identificados reordenamientos de Ig y TCR en el 95% de los casos, ha demostrado la factibilidad de emplear esta tecnología con fines de caracterización diagnóstica y determinación del grupo de riesgo de los pacientes a través de la medición de la respuesta in vivo al tratamiento.

Disponer de esta estrategia metodológica ha permitido no sólo conocer en detalle el perfil de reordenamientos de Ig/TCR de la población de pacientes estudiada, sino también, posibilitar que dichas recombinaciones génicas puedan ser utilizadas para establecer la relación clonal entre diagnósticos iniciales y probables segundas enfermedades malignas, brindar diagnósticos certeros en los casos con switches de linaje y para la determinación de la EMR a fin de aplicar una adecuada intensidad de tratamiento quimioterápico a los niños con LLA.

El presente trabajo fue realizado sin haberse recibido una financiación específica.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses respecto del presente trabajo.

Los autores agradecen a los doctores: María Angélica Fernández Barbieri, Ezequiel Recondo, Patricia Luna, María Soledad Vides Herrera, Cristina Cabral y Vanina Livio por sus importantes aportes. También agradece al Hospital de Niños de San Isidro, Hospital Nacional de Clínicas de CABA, Hospital del Niño Jesús de Tucumán, Hospital Eva Perón de Catamarca, Hospital Juan Pablo II de Corrientes y al Hospital Avelino Castelán de Chaco.

Bioq. Patricia Rubio

Laboratorio de Diagnóstico Molecular del Servicio de Hematología y Oncología. Hospital de Pediatría “Prof. Dr. Juan P. Garrahan”

Combate de los Pozos 1881

(1245) CIUDAD AUTÓNOMA DE BUENOS AIRES, Argentina.

Correo electrónico: patrirubio@gmail.com