Introducción

Las amebas de vida libre (AVL) comprenden un grupo de protozoos anfizoicos de distribución cosmopolita. Estos parásitos facultativos fueron aislados de diferentes hábitats tales como tierra, polvo, aire, agua de mar, agua potable, aguas termales, piscinas, aguas residuales, soluciones oftálmicas, lentes de contacto, unidades de diálisis y de tratamiento dental (1) (2). Los géneros de AVL asociados mayormente a infecciones humanas son Acanthamoeba spp., Naegleria fowleri y Balamuthia mandrillaris (3). Varias especies de Acanthamoeba pueden causar diferentes cuadros clínicos, dentro de los que se incluyen la queratitis amebiana (QA), la encefalitis amebiana granulomatosa (EAG) a nivel del sistema nervioso central en el hospedador inmunocomprometido, lesiones cutáneas e infecciones sinusales (3) (4).

Este protozoo juega un rol destacado en la transmisión y diseminación de microorganismos patógenos ya que sirve de vehículo para la colonización de nuevos hábitats u hospedadores (5). El ciclo de vida de este parásito consta de dos etapas, una etapa activa o de trofozoíto y una etapa latente o de quiste, las cuales poseen características morfológicas distintivas (2). Los trofozoítos tienen un tamaño comprendido entre 13 y 40 μm, generalmente muestran un núcleo y presentan un desplazamiento unidireccional por emisión de pseudópodos hialinos. Además, en su citoplasma poseen un sistema de vacuolas de expulsión de agua que les permite mantener su medio osmótico (6). Los quistes poseen un tamaño que varía según la especie que no supera generalmente los 25 μm de diámetro y se caracterizan por presentar una pared doble y arrugada compuesta por un endoquiste y un exoquiste (6). Estas características morfológicas permiten la clasificación biológica a nivel del género Acanthamoeba (7) (8) y, en este trabajo, se consideraron criterios suficientes para su identificación.

Debido a la resistencia que presentan estas amebas a los biocidas, a la cloración y a condiciones ambientales hostiles como las altas temperaturas, la osmolaridad y el pH (9), se considera que las piscinas constituyen una fuente artificial de transmisión de Acanthamoeba (10). En la Argentina hay poca información disponible acerca de la distribución de este parásito en ambientes acuáticos, por lo cual se realizó un estudio para identificar la presencia de Acanthamoeba spp. en piscinas al aire libre en la ciudad de Córdoba, Argentina y de esta forma proporcionar información de salud pública.

Materiales y Métodos

Recolección de muestras

Se recolectó un total de 30 muestras de agua correspondientes a 10 piscinas al aire libre, ubicadas en diferentes barrios de la ciudad de Córdoba, Argentina (Fig. 1 a y b). El muestreo se realizó utilizando frascos de vidrio estériles de 500 mL de capacidad en 3 puntos de muestreo por cada piscina (el fondo, la interfaz del borde y la entrada del filtro) con el objetivo de evaluar la distribución del parásito dentro de las mismas. Para la toma de muestra se procedió a sumergir cada uno de los frascos bajo el agua en los distintos puntos de muestreo. Una vez sumergidos se abrieron y al completar el volumen se cerraron bajo el agua para impedir el contacto con el aire y de esta forma evitar cualquier tipo de contaminación. Una vez recolectadas las muestras de agua se enviaron al laboratorio para su posterior análisis. El llenado de las piscinas estudiadas se llevaba a cabo mediante agua de red y el mantenimiento de las mismas se realizaba periódicamente por sus dueños.

Figura 1. Ubicación de la ciudad de Córdoba (longitud: O64°10’51.78” y latitud: S31°24’48.6”), provincia de Córdoba, centro de Argentina (A). Mapa de localización de cada una de las piscinas muestreadas dentro de la ciudad de Córdoba (B).

Las muestras se recolectaron en el período comprendido entre los meses de diciembre de 2017 y marzo de 2018. El procesamiento y análisis se realizó en el Laboratorio de Parasitología, Facultad de Ciencias Químicas, de la Universidad Católica de Córdoba.

Aislamiento e identificación de Acanthamoeba spp.

Cada muestra de agua recolectada se dejó reposar en el laboratorio durante 24 horas a temperatura ambiente. Posteriormente, el sobrenadante se descartó, reteniendo aproximadamente un volumen de 60 mL. Este volumen se transfirió a tubos Falcon^TM estériles de 15 mL y se centrifugó sucesivamente a 2000 r.p.m. durante 10 minutos. El sedimento obtenido se resuspendió con solución salina de Page y se sembró en un agar no nutritivo (ANN) con 100 μL de suspensión de Escherichia coli (E. coli) (ATCC 25922). Las placas se incubaron a 37 °C durante 15 días, por duplicado. A las 72 horas se realizó la primera observación para verificar la presencia trofozoítos y quistes, mediante microscopía óptica. Transcurridos los 15 días se descartaron aquellos cultivos que no mostraron crecimiento de AVL. En aquellas placas en las que se evidenció crecimiento, se realizó la identificación genérica de acuerdo a lo establecido por Page (7) y Pussard y Pons (8).

Prueba de transformación amebo-flagelar

Los cultivos que mostraron crecimiento se evaluaron con la finalidad de descartar la presencia de amebas flageladas de vida libre, como las pertenecientes al género Naegleria. Las amebas aisladas se replicaron y se añadió 1 mL de agua destilada estéril para proporcionar la condición necesaria para el proceso de exflagelación y movilidad. Las placas se incubaron a 37 °C durante 4 horas y se evaluó la movilidad por flagelos a cada hora. La observación se prolongó durante 10 días para considerar la prueba negativa.

Análisis de parámetros fisicoquímicos

En cada piscina se registraron datos de temperatura ambiente y temperatura del agua mediante el uso de un termómetro de mercurio. El pH y la concentración de cloro residual de las piscinas se determinaron mediante el empleo de un kit comercial (kit de prueba de 2 vías P1920). Se registró la superficie y profundidad promedio de cada natatorio.

Resultados

El 20% (6/30) de las muestras de agua recolectadas de las piscinas al aire libre en Córdoba, Argentina, presentaron crecimiento de AVL en cultivo en ANN en presencia de E. coli en solución de Page. Estos aislados correspondían a dos de las 10 piscinas estudiadas, que en función de las características morfológicas observadas, por microscópica óptica, se identificaron y clasificaron dentro del género Acanthamoeba. Este protozoo se aisló en los distintos puntos de muestreo estudiados (fondo, interfaz del borde y entrada del filtro). Los trofozoítos contaminaaislados presentaron un tamaño variable de 14 a 23,5 μm, con emisión de pseudópodos hialinos responsables del movimiento ameboideo, vacuolas contráctiles prominentes de exclusión de agua y un solo núcleo (Fig. 2a), mientras que los quistes mostraron un tamaño variable entre 8 y 14 μm y doble pared (Fig. 2b). No se observó exflagelación en ningún aislado, lo que sugiere la ausencia de trofozoítos flagelados y, por lo tanto, el desarrollo de parásitos del género Naegleria. Acanthamoeba spp. se aisló de piscinas con una superficie entre 35 y 36 m2 y una profundidad promedio entre 1,4 y 1,5 m, sin niveles detectables de cloro residual, con un pH moderadamente alcalino (7,2-7,8) y de temperatura templada (24-25 °C). La temperatura ambiental registrada fue de 28 °C en ambos casos (Tabla I).

Discusión y Conclusiones

Acanthamoeba spp. es un parásito ampliamente distribuido en el medio ambiente. Se encuentra frecuentemente en muestras de agua de diversas procedencias. En este trabajo este parásito se aisló e identificó en dos de las 10 piscinas estudiadas, mediante cultivo en ANN con E. coli en medio de Page. Las amebas se encontraron en los diferentes sitios de muestreo de estas piscinas y presentaban una distribución homogénea del parásito en el agua. Esto puede explicarse por la resistencia del quiste de doble pared y el mantenimiento y limpieza inadecuados de estas piscinas que permiten la supervivencia y el desarrollo de las amebas frente a las diferentes condiciones de los puntos de muestreo. Estos hallazgos coinciden con los reportados previamente por Init et al. (11) quienes detectaron la presencia de Acanthamoeba en los cuatro sitios de muestreo que estudiaron. En contraposición, otros autores observaron una distribución no homogénea de este parásito en el agua de los natatorios (12) (13).

Diversos autores han conseguido aislar estos protozoarios de piscinas en diferentes ciudades de América del Sur. Los resultados de este trabajo mostraron ser similares a los publicados por Caumo y Rott (14), en Porto Alegre, Brasil, y superiores a los observados por Muñoz et al. (12) en Santiago, Chile y Garaycochea et al. (15) en Lima, Perú, quienes informaron una tasa de contaminación del 4,7-6,7%, respectivamente. En la Argentina, hay pocos estudios de distribución de Acanthamoeba en fuentes acuáticas artificiales. Gertiser et al. (13) informaron el aislamiento de esta ameba en el 29% de un total de 21 muestras de agua recolectadas de 7 piscinas, en temporada de verano, en la ciudad de Bahía Blanca. A pesar de que el estudio se realizó en natatorios cubiertos y en otra ciudad perteneciente a otra provincia argentina, el porcentaje de contaminación fue similar al descripto en este trabajo. Cabe señalar que la variación en la presencia de AVL en las piscinas puede deberse a las condiciones geográficas, los métodos de muestreo utilizados, los métodos de aislamiento e identificación y las condiciones de mantenimiento de las mismas.

TAF: Transformación amebo-flagelar.

Tabla I. Identificación de Acanthamoeba spp. en piletas al aire libre de la ciudad de Córdoba, Argentina y parámetros fisicoquímicos obtenidos durante la toma de muestra en el período 2017/18.

Figura 2. Fotografía de microscopía óptica de trofozoíto (A) y quistes (B) de Acanthamoeba spp. (400X), obtenida de cultivos de las muestras de agua de las piscinas estudiadas.

En referencia a la relación de los parámetros fisicoquímicos con la presencia de AVL, diversos autores demostraron la resistencia de este protozoo a la cloración, ya que aislaron Acanthamoeba spp. de muestras de agua de piscinas con una concentración de cloro residual de hasta 3 ppm (13) (16). También se ha reportado el crecimiento del parásito en rangos de pH comprendidos entre 5,6 y 8,4, en ensayos in vitro (17). Sin embargo, en este estudio este protozoo se aisló de piscinas con niveles no detectables de cloro residual y pH dentro del rango permitido por la ordenanza 11566: Natatorios Públicos y Privados, (Municipalidad de la ciudad de Córdoba, Argentina, Boletín N° 2881 del 15 de diciembre de 2008), la cual establece que el agua de piscinas debe mantener una concentración de cloro residual entre 0,5-1,5 ppm y un rango de pH de 7,2-7,8. El resto de los natatorios estudiados, que se encontraron dentro de los parámetros exigidos, no mostraron desarrollo de AVL. La temperatura ambiente y del agua registradas fueron óptimas para el crecimiento y la reproducción de estos protozoos (2). A fin de establecer una asociación clara entre la variación de estos parámetros con el crecimiento de estas amebas se realizarán mayores estudios.

Se ha demostrado que las piscinas contaminadas por cepas patógenas de Acanthamoeba spp. son un posible factor de riesgo epidemiológico importante en el desarrollo de QA y EGA, especialmente en usuarios de lentes de contacto y hospedadores inmunocomprometidos, respectivamente (9) (18). Un estudio reciente ha reportado un número considerable de casos de QA en la ciudad de Córdoba (18). De estos casos, 17 de 21 (80,9%) de los pacientes eran usuarios de lentes de contacto que tenían un historial de mantenimiento inapropiado de los mismos, además, el 67% de los pacientes que participaron en el estudio manifestaron nadar con lentes de contacto in situ (18). Es por eso que los resultados de este trabajo enfatizan la importancia de considerar el agua de piscinas recreativas como una fuente artificial de Acanthamoeba spp. y un vehículo de transmisión de enfermedades causadas por estos microorganismos. Se recomienda una limpieza profunda de las piscinas para minimizar los riesgos de infección. Este estudio demuestra por primera vez la presencia de Acanthamoeba spp. en piscinas recreativas al aire libre en la ciudad de Córdoba, Argentina.

Fuentes de financiación

Este estudio fue financiado por la Universidad Católica de Córdoba.

Conflictos de intereses

Los autores declaran no tener conflictos de intereses respecto del presente trabajo.

Agradecimientos

Los autores agradecen a la Dra. María Cecilia Carpinella por donar la cepa bacteriológica y al Dr. Sixto Raúl Costamagna por sus enseñanzas.

Correspondencia

Bioq. Farm. JERÓNIMO LAIOLO

Instituto de Recursos Naturales y Sustentabilidad José Sánchez Labrador S.J. (IRNASUS-CONICET)

Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Católica de Córdoba

Avda. Armada Argentina 3555

X5016DHK, Córdoba, Argentina.

Correo electrónico: jeronimolaiolo@ucc.edu.ar

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Notas de autor

Bioq. Farm. JERÓNIMO LAIOLO Instituto de Recursos Naturales y Sustentabilidad José Sánchez Labrador S.J. (IRNASUS-CONICET), Facultad de Ciencias Químicas, Universidad Católica de Córdoba. Avda. Armada Argentina 3555, X5016DHK, Córdoba, Argentina. Correo electrónico: jeronimolaiolo@ucc.edu.ar