Efectos hemorreológicos de los glóbulos rojos y sus implicancias en la salud

Hemorheological effects of red blood cells and their implications in health

Efeitos hemorreológicos das hemácias e suas implicações na saúde

La reología es una disciplina científica que se dedica al estudio de las leyes que rigen la deformación y el flujo de la materia o, más precisamente, de los fluidos complejos. Un fluido es capaz de deformarse continuamente cuando está sujeto a esfuerzos y carece de fuerzas restitutivas internas que lo vuelvan a su forma original, a diferencia de los sólidos que no se deforman o sólo lo hacen hasta cierto punto. En un sólido elástico hay fuerzas restitutivas que tienden a recuperar la forma original.

Los materiales se deforman y/o fluyen debido a la suma de las fuerzas aplicadas a los mismos. Entre dichas fuerzas importan las llamadas superficiales que son debidas a la interacción entre las moléculas cercanas a una superficie (que no es necesariamente una frontera del material, sino también una superficie interna en él). En el estudio del grado de deformación (o flujo) de un material deben considerarse los esfuerzos (1), los cuales poseen dos componentes: (i) esfuerzo de corte, de cizalladura o tangencial, que es la fuerza por unidad de área que actúa paralelamente a la superficie y (ii) la presión o esfuerzo normal que es la fuerza por unidad de área que actúa perpendicularmente a la superficie. Se acostumbra medir ambos tipos de esfuerzos en mPa (milipascales).

En el estudio de los flujos es importante considerar la tasa de deformación; esto es la variación espacial de la velocidad. Esta da una idea de la rapidez con la que se deforma una porción infinitesimal del material, y se mide en 1/s. Finalmente, la viscosidad se define como el cociente entre el esfuerzo tangencial y la tasa de deformación y suele medirse en milipascales por segundo (mPa/s) que es equivalente al centipoise (cP).

Desde el punto de vista reológico, los líquidos pueden dividirse en dos grupos principales:

1. Los líquidos newtonianos son aquellos en los que los esfuerzos tangenciales varían linealmente con la tasa de deformación. La viscosidad, por lo tanto, resulta ser una constante independiente de la tasa de deformación en estos líquidos. Puede depender, sin embargo, de otros parámetros como la temperatura.

2. En los líquidos no newtonianos, en cambio, la relación entre las tasas de deformación y los esfuerzos no está dada por una constante y, por lo tanto, su viscosidad depende de la tasa de deformación a la que está fluyendo.

Además de dividir a los fluidos en newtonianos y no newtonianos es importante clasificar a los flujos resultantes en laminares y turbulentos. Para entender estos conceptos es útil recordar que en un tubo de diámetro y longitud constante la resistencia al flujo depende del tipo de fluido y de las condiciones de flujo dentro del tubo. Para un flujo lento, la diferencia de presión entre dos puntos a lo largo del tubo es proporcional a la velocidad de dicho flujo, y las partículas líquidas pueden moverse suavemente en planos adyacentes o láminas paralelas a la pared del tubo. Este tipo de flujo se denomina laminar (2). Con el aumento de la velocidad aparece una tendencia a que el flujo se desplace en patrones irregulares, haciendo que el movimiento de las partículas se vuelva caótico. Este flujo se denomina turbulento y su grado de turbulencia aumenta con el caudal (3).

Cuando un material, bajo la acción de estos esfuerzos, sufre una deformación finita y pequeña (en vez de fluir), se dice que presenta propiedades elásticas. En estos casos, la magnitud de la deformación es proporcional al esfuerzo aplicado y la constante de proporcionalidad es el coeficiente de rigidez, el cual se mide en mPa. En general, un material presenta una combinación de comportamientos viscosos y elásticos que dependen de la rapidez de la deformación. Todos estos factores contribuyen a la complejidad reológica de la sangre.

Desde un punto de vista biológico, la sangre puede considerarse como un tejido que comprende varios tipos de células y un material líquido intercelular (plasma). Aunque la viscosidad de la sangre total depende de muchos factores, como la viscosidad del plasma, la concentración y calidad de los glóbulos blancos y plaquetas, esta revisión se enfoca principalmente en la participación de los glóbulos rojos (GRs). Los GRs son los elementos más importantes desde el punto de vista reológico debido a su abundancia (4) (5). Por otra parte, las propiedades reológicas de la sangre completa tienen relevancia clínica ya que se ha demostrado que éstas pueden alterarse en diversos estados patológicos. La sangre puede estudiarse como un líquido de dos fases; esto es, como una suspensión sólido-líquido en la que las células serían la fase sólida. Sin embargo, también puede ser considerada como una emulsión en la que el líquido del interior de los GRs formaría las micelas.

La sangre, al estar compuesta de células que poseen diferentes propiedades elásticas, no solamente presenta efectos ligados a la viscosidad, sino también otros relacionados a la elasticidad. En suma, este líquido complejo manifiesta propiedades viscoelásticas en ciertos casos y, por lo tanto, la hemorreología debe ocuparse tanto del comportamiento del flujo de la sangre completa como de la deformabilidad de los elementos que la componen.

El plasma es un fluido newtoniano y su viscosidad está estrechamente relacionada con el contenido de proteínas. Cambios fisiológicamente significativos en el plasma pueden alterar su viscosidad, por ejemplo, al variar la concentración de los reactantes de fase aguda.

En cambio, la sangre entera se considera una suspensión no newtoniana y su fluidez depende de las propiedades reológicas combinadas del plasma y los componentes celulares. La sangre normal muestra un comportamiento de adelgazamiento ante esfuerzos de corte (shear thinning). Este tipo de comportamiento asegura que a bajas velocidades de corte o esfuerzo de corte, la viscosidad de la sangre es alta y disminuye a un valor mínimo bajo fuerzas de corte elevadas (6). Además, en éstasis, la sangre normal tiene un esfuerzo mínimo de fluencia (o esfuerzo umbral) de aproximadamente 2 a 4 mPa (5), es decir, la sangre sólo puede fluir ante esfuerzos aplicados mayores a este valor. Las variaciones de la fluidez de la sangre influyen en gran medida en la perfusión de los tejidos (4).

Como se dijo previamente, los GRs afectan la viscosidad. En efecto, se observa una relación de crecimiento exponencial de ésta con el hematocrito (Hto). Para valores del Hto menores del 60%, la viscosidad depende además de la tasa de deformación y su crecimiento es más significativo cuanto más alta es dicha tasa (Fig. 1). Cuando el Hto supera el 60%, se produce una disminución significativa de la perfusión tisular (7).

La deformabilidad de los GRs, es decir, su comportamiento bajo esfuerzos de corte, influye fuertemente en la fluidez de la sangre. Los GRs normales son altamente deformables bajo cizallamiento y se orientan con las líneas de flujo. Sin embargo, durante el estrés inflamatorio, los GRs tienden a agregarse en conjuntos lineales como pilas de monedas (rouleaux). El fibrinógeno y otros reactantes de fase aguda en el plasma estabilizan estos agregados, aumentando significativamente la viscosidad de la sangre (8).

Debido a su deformabilidad, los GRs poseen la capacidad de atravesar capilares más pequeños que su diámetro y así desempeñar su papel como portadores de gases entre la sangre y los tejidos (9). Diversas patologías afectan la deformabilidad de los eritrocitos, entre ellas las alteraciones de la hemoglobina, como la anemia de células falciformes (10) o la talasemia (11) y los trastornos hereditarios de la membrana de los GRs (12). Además, se han reportado alteraciones de la deformabilidad de los eritrocitos en diferentes enfermedades infecciosas, metabólicas y cardiovasculares, entre otras: malaria (13), diabetes (14), infarto de miocardio (15) o enfermedades críticas (por ejemplo, sepsis) (16). Debido a su importancia fisiopatológica, la medición de la deformabilidad de los glóbulos rojos ha sido el foco de numerosos estudios en las últimas décadas (17).

Figura 1
Viscosidad de la sangre en función del hematocrito para distintos valores de la tasa de deformación para GR normales suspendidos en plasma (7)

Figura 1. Viscosidad de la sangre en función del hematocrito para distintos valores de la tasa de deformación para GR normales suspendidos en plasma (7).

En condiciones fisiológicas, los GRs adoptan la forma de un disco bicóncavo, con dimensiones de aproximadamente 8 μm de diámetro y 2 μm de grosor. Su deformabilidad permite que atraviesen capilares con diámetros de no más de 3–5 μm. Cuando los GRs circulan a través del bazo, que actúa como un filtro altamente efectivo, estas células traspasan poros en las paredes endoteliales extremadamente estrechas con un diámetro de 0,5 a 1,0 μm. En caso de alteración de la capacidad de deformación, debida a factores patológicos (por ejemplo en la esferocitosis hereditaria, EsH) o envejecimiento fisiológico, se produce el secuestro esplénico y la eliminación de los GRs de la circulación (18).

La deformabilidad de un eritrocito depende principalmente de los siguientes tres factores:

1. El exceso de área de superficie respecto a la que tendría una esfera del mismo volumen. En efecto, considerando que el volumen celular medio (VCM) de un GR es de ∼90 fL, si fuera una esfera tendría una superficie de 97 μm². Sin embargo, debido a su forma bicóncava presenta un área de superficie media (MSA) de ∼135 μm², que es notablemente mayor.

2. La viscosidad del fluido intracelular dominada por el tipo y la concentración de hemoglobina.

3. Las propiedades viscoelásticas de la membrana celular, que es un material compuesto que consta de tres capas: un glicocálix rico en hidratos de carbono en la superficie exterior, una bicapa lipídica capaz de resistir la flexión y una red de proteínas subyacentes que sirve como esqueleto de membrana y es responsable de facilitar la deformabilidad, flexibilidad y recuperación de la forma discoide (12). La extensibilidad lineal de esta malla proteica define los límites de la deformabilidad de los glóbulos rojos (12).

El aumento anormal en la rigidez de los GRs se ha asociado con alguna alteración de estos factores. El comportamiento mecánico de la membrana de los GRs se expresa en términos de tres módulos fundamentales: (a) el módulo elástico de corte, (b) el módulo de compresibilidad del área y (c) el módulo de flexión. El primero se asocia con una deformación de área constante. El módulo de compresibilidad del área caracteriza su resistencia a la compresión o la expansión. El módulo de flexión que presenta la curvatura de la membrana es importante para impulsar los cambios en la forma de reposo (17) (19). Otro parámetro elástico que resulta de mediciones en microscopía de fuerza atómica (20) es el módulo de Young, que es la medida de la rigidez del material elástico según la dirección en la que se aplica la fuerza.

En bifurcaciones vasculares y cambios en la sección transversal de los vasos se producen deformaciones transitorias en los GRs. El parámetro característico de estos fenómenos es el tiempo de relajación, definido como el tiempo que tarda un GR deformado en recuperar su forma bicóncava original (21). Se han hecho algunos avances prometedores que muestran la interacción entre la forma de los vasos y la deformabilidad de los GRs (22).

Los GRs maduros se deforman de manera reversible bajo tensiones de corte que se presentan durante el tránsito circulatorio (8). Las proteínas integrales de transmembrana como AE-1 (también llamada B3) y las glicoforinas están ancladas de manera reversible a una malla de proteínas filamentosas del citoesqueleto (Fig. 2). El mantenimiento de las interacciones entre la membrana lipídica y la malla proteica y el robusto comportamiento mecánico de los GRs dependen de las bombas de iones asociadas al ATP, así como del apoyo de los sistemas antioxidantes de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato en su forma reducida (NADPH) (23).

Los métodos experimentales disponibles se pueden dividir en dos categorías: 1) instrumentos que miden la sangre total o suspensiones de GRs diluidos y 2) técnicas de célula única.

Los primeros, que incluyen el viscosímetro rotacional y el ectacitómetro, se consideran métodos de alto rendimiento. Sin embargo, éstos no tienen en cuenta la heterogeneidad o las diferencias de tamaño dentro de la población de células. El ectacitómetro (24) emplea una técnica de difracción láser y mide la deformabilidad de los GRs en función de la osmolalidad del medio en la que están suspendidos (a una dada tasa de deformación). Las curvas de índice de deformabilidad (ID) brindan información sobre el área de la superficie de los glóbulos rojos, la relación entre la superficie y el volumen y la viscosidad interna. El ID (a menudo llamado índice de elongación) se define como la relación (L-W)/(L+W), donde L y W son respectivamente los ejes mayor y menor de una elipse que representa un GR deformado promedio. La curva para muestras de sangre normal alcanza un ID máximo (ID_max) a los 290 mOsm/kg, lo que indica que los GRs normales tienen una capacidad de deformación óptima cuando se exponen a la osmolalidad (o tonicidad) normal. Cuando la osmolalidad del medio de suspensión disminuye, la ID también disminuye y la ID mínima (ID_min) indica el volumen máximo posible que una célula puede alcanzar antes de la hemólisis.

Como se dijo previamente, la deformabilidad de los eritrocitos está gobernada por tres factores: la relación superficie/volumen, la viscosidad citoplasmática y la rigidez intrínseca de la membrana. Con el ectacitómetro se obtiene una curva de deformabilidad osmótica, cuyos puntos característicos son los siguientes (Fig. 3):

• El índice de deformabilidad máximo, ID_max. Se alcanza en un medio isotónico y depende del área de membrana disponible del eritrocito.

Figura 2
Esquema de la estructura bidimensional de la membrana es una estructura compuesta por una bicapa lipídica anclada a una red bidimensional elástica de proteínas del citoesqueleto a través de ankirina y proteína 4.1. La deficiencia o alteración de alguna de las proteínas de la unión vertical involucrando el complejo ankirina conduce a la pérdida de cohesión entre la bicapa lipídica y el esqueleto de la membrana como así también a la pérdida de área de superficie Las uniones horizontales entre dimeros espectrinaespectrina y entre espectrinaactinaproteína 41R en el complejo de unión determinan la integridad mecánica de la membrana Las uniones horizontales defectuosas disminuyen esta integridad y favorecen la fragmentación de la célula

Figura 2. Esquema de la estructura bidimensional de la membrana: es una estructura compuesta por una bicapa lipídica anclada a una red bidimensional elástica de proteínas del citoesqueleto a través de ankirina y proteína 4.1. La deficiencia o alteración de alguna de las proteínas de la unión vertical involucrando el complejo ankirina conduce a la pérdida de cohesión entre la bicapa lipídica y el esqueleto de la membrana, como así también a la pérdida de área de superficie. Las uniones horizontales entre dimeros espectrina-espectrina y entre espectrina-actina-proteína 4.1R en el complejo de unión determinan la integridad mecánica de la membrana. Las uniones horizontales defectuosas disminuyen esta integridad y favorecen la fragmentación de la célula.

Figura 3
Ectacitometría de gradiente osmótico. Línea gruesa (normal): perfil de deformabilidad osmótica de los GRs humanos normales que muestra el índice de deformabilidad (ID) como una función continua de la osmolalidad del medio en suspensión. El ID máximo, que se alcanza en la osmolalidad isotónica es una medida del área de superficie de la membrana. El ID mínimo en la región hipotónica (O_min) corresponde a la osmolalidad en la que el 50% de los glóbulos rojos se lisan en la prueba de fragilidad osmótica y el O’ en la región hipertónica corresponde al estado de hidratación de las células y por lo tanto a la CHCM. Línea de puntos (EsH): perfil de deformabilidad osmótica de un paciente con EsH. La disminución del ID máximo es consecuencia de la reducción del área de superficie de la membrana, el aumento del ID en O_min es el resultado del incremento de la fragilidad osmótica y la disminución del ID en la mayor osmolalidad refleja la deshidratación celular. Adaptado de (36).

Figura 3. Ectacitometría de gradiente osmótico. Línea gruesa (normal): perfil de deformabilidad osmótica de los GRs humanos normales que muestra el índice de deformabilidad (ID) como una función continua de la osmolalidad del medio en suspensión. El ID máximo, que se alcanza en la osmolalidad isotónica es una medida del área de superficie de la membrana. El ID mínimo en la región hipotónica (O_min) corresponde a la osmolalidad en la que el 50% de los glóbulos rojos se lisan en la prueba de fragilidad osmótica y el O’ en la región hipertónica corresponde al estado de hidratación de las células y por lo tanto a la CHCM. Línea de puntos (EsH): perfil de deformabilidad osmótica de un paciente con EsH. La disminución del ID máximo es consecuencia de la reducción del área de superficie de la membrana, el aumento del ID en O_min es el resultado del incremento de la fragilidad osmótica y la disminución del ID en la mayor osmolalidad refleja la deshidratación celular. Adaptado de (36).

• La O_min es la osmolalidad para la cual el ID es mínimo y corresponde al 50% de hemólisis en una prueba de fragilidad osmótica. Se produce en un medio hipotónico y depende de la relación superficie/volumen.

• O’ es la osmolalidad a la cual el ID es igual a la mitad del ID_max. Este parámetro depende de la viscosidad intracelular y, por lo tanto, se relaciona con la concentración hemoglobínica corpuscular media (CHCM).

Las muestras de sangre patológicas se caracterizan por diferencias en la forma de la curva de ID frente a la osmolalidad en comparación con un control normal. La ectacitometría de gradiente osmótico es extremadamente útil para el diagnóstico en la mayoría de las patologías hereditarias de la membrana eritrocitaria (25).

Existen varios métodos experimentales unicelulares, que incluyen la aspiración con micropipeta, las pinzas ópticas, el análisis de parpadeo, la microscopía de fuerza atómica y las técnicas de microfluídica y ultrasonido (26). Además, la interferometría láser de campo completo, una técnica óptica no invasiva, se ha utilizado para cuantificar las características materiales de las células vivas en escalas del nanómetro y del milisegundo. Los métodos anteriores basados en células individuales permiten la estimación de las propiedades de la membrana que afectan la capacidad de deformación de los GRs. En general, estos métodos tienen más interés teórico y básico que clínico ya que pueden no representar completamente las condiciones reales que ocurren en la microcirculación.

En los últimos años, se han desarrollado técnicas basadas en el flujo en microcapilares y en dispositivos microfluídicos (27) (28). El análisis automatizado de imágenes en estos dispositivos permite estudiar un gran número de células mediante el uso de patrones que imitan la microcirculación (29) en sustratos transparentes, como polidimetilsiloxano y vidrio, haciendo uso de videomicroscopía. Los métodos incluyen: (i) visualizaciones de la deformación celular en función de la caída de presión, en la cual la forma clásica de paracaídas observada in vivo también se obtuvo en experimentos in vitro (30), (ii) estimaciones de las propiedades viscoelásticas de la membrana celular mediante el uso de canales divergentes (31) y (iii) arreglos de cámaras micrométricas que contienen una sola célula (SiCMA, del inglés: single-cell microchamber array chip) (21) (32) en las que se aplica una fuerza dielectroforética para deformar los GRs y se utiliza el análisis de imágenes para evaluar la deformabilidad de los eritrocitos individuales en términos del porcentaje del índice de elongación (33).

Un parámetro geométrico de un conjunto de GRs es el ancho característico de distribución eritrocitaria (RDW, del inglés: red distribution width) que es una medida de la variación de tamaño y un índice de la heterogeneidad celular. Éste se puede utilizar como una herramienta de diagnóstico y pronóstico en afecciones cardiovasculares y trastornos trombóticos (34). Recientes investigaciones han estudiado el patrón de secado de gotas de sangre completa en busca de pistas para correlacionar dichos patrones con diversas condiciones que afecten la salud humana. La morfología de los patrones de gotas secas sobre un sustrato presenta regiones denominadas corona, placas y grietas radiales, los cuales difieren en pacientes con patologías de diferente etiología (35). Los patrones de secado de gotas se ven afectados por numerosos efectos físicos que dependen de la reología de la sangre. En efecto, en estos problemas hay flujos de Marangoni acoplados con la evaporación que dependen, entre otros factores, de la composición de la sangre, la concentración de solutos (que puede alterarse con la lisis o crenación de los GRs), la viscosidad del plasma y los fenómenos de gelación que alteran la reología del sistema. Por ello, no es igual el patrón resultante del secado de sangre normal, uno con 50% de GRs y 50% de solución fisiológica y uno de sangre hemolizada como se muestra en la Figura 4. Aunque aún es prematuro sacar conclusiones definitivas, en nuestro laboratorio se está trabajando en esta metodología tratando de obtener información cuantificable de dicha morfología con el objetivo de que resulte útil para presumir u orientar hacia el diagnóstico de ciertas patologías.

El principal impacto de los GRs en la formación de coágulos in vivo es reológico, debido a que un flujo laminar con cizalladura promueve la marginación de las plaquetas y la concentración de los GRs en el centro (77). La cizalladura ocurre cuando la velocidad del flujo varía en la dirección perpendicular al movimiento. La agregación y deformabilidad eritrocitaria favorece el soporte, ensamblado y retracción del coágulo. Además, durante la formación del trombo, los GRs interactúan con las células endoteliales y las plaquetas (78). La efectividad con la que la superficie procoagulante logra estimular la producción de trombina (mediante la exposición de la fosfatidilserina en la región externa de la bicapa lipídica) junto con la rigidez de los eritrocitos son dos factores importantes en la generación y maduración de un coágulo (79) (80). A su vez, las micropartículas liberadas de las membranas de los GRs durante los cuadros de hemólisis tienen un fuerte potencial procoagulante junto con los efectos protrombóticos de la hemoglobina y el hemo extracelular (61) (81). Por otro lado, los GRs interactúan directamente con la fibrina/fibrinógeno y afectan la estructura, las propiedades mecánicas y la resistencia lítica de los coágulos y los trombos (82). La visualización directa por microscopía confocal y scanning electrónico demuestra que las concentraciones bajas de GRs se incorporan heterogéneamente en la red de fibrina, mientras que las altas concentraciones se ordenan más uniformemente. El agregado de GRs conduce a la formación de fibrinas más gruesas y modifica la viscoelasticidad del coágulo incrementando el comportamiento viscoso respecto del elástico (83).

Finalmente, los GRs adquieren en un coágulo una forma de teselado que es un patrón repetitivo de figuras geométricas poliédricas que encajan y cubren el plano sin superponerse y sin dejar huecos. Se los denomina poliedrocitos y se reconocen como un componente estructural importante de los coágulos contraídos, produciendo una barrera impermeable que es muy importante para la hemostasia y la curación de las heridas (84).

Esta reseña de los aspectos biofísicos de la reología de la sangre se ha concentrado en la importancia de los GRs en el comportamiento de este fluido no newtoniano. Se han descripto algunos modelos experimentales in vitro que se pueden usar para medir la deformabilidad de los GRs, en especial las alteraciones de la membrana eritrocítica en las anemias hemolíticas hereditarias. La ectacitometría se considera actualmente como una técnica útil para estimar las propiedades de la membrana, ya que caracteriza fundamentalmente la deformabilidad de los GRs en términos de cambios en la curva ID. Se describieron las alteraciones de la deformabilidad de los GRs en trastornos metabólicos y su influencia en las complicaciones concomitantes. Aunque se ha logrado un enorme progreso, la comprensión del papel de la deformabilidad de los GRs en tales enfermedades está lejos aún de ser completa. Se han mencionado algunas pruebas que apoyan una relación causal entre la disfunción adquirida de los GRs y las morbilidades relacionadas con la perfusión que complican las enfermedades graves. Todas ellas están afectadas por la inflamación, el estrés oxidativo y el control vascular disfuncional.

Muchos ensayos bioquímicos y biológicos tradicionales, como la citometría de flujo, la extracción de ADN y la reacción en cadena de la polimerasa, que proporcionan información de parámetros múltiples de las células, ya se han transferido a dispositivos microfluídicos integrados (26). Se están diseñando nuevos sistemas microfluídicos que deberían permitir observaciones de alta velocidad y gran aumento del flujo que representen bien la microvasculatura humana. Trabajos recientes se han centrado en las células sanas y en algunas patologías, como la malaria y la anemia falciforme (85) (86).

El estudio de la hemorreología es un campo abierto que incluye otros aspectos que no han sido tratados en este trabajo, tales como la respuesta de la sangre a flujos pulsantes, su comportamiento viscoelástico y la interacción del flujo con la elasticidad de las paredes de los vasos. Es preciso desarrollar nuevas técnicas experimentales y mejorar las simulaciones numéricas de los problemas para mejorar la comprensión de estos efectos.

La Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires (UNCPBA) ha financiado estos estudios a través del Proyecto Estratégico de Investigación, Desarrollo y Transferencia (PEIDyT) denominado “Diseño de un dispositivo de bajo costo para determinar patologías eritrocitarias” dentro del Programa de Fortalecimiento de la Ciencia y la Tecnología en Universidades Nacionales de la Secretaría de Políticas Universitarias (Convocatoria 2018).

Los autores declaran no tener conflictos de intereses respecto del presente trabajo.

Los autores agradecen a la UNCPBA por apoyar estos estudios y al Dr. Mario Fainberg de la Unidad de Terapia Intensiva del Instituto del Diagnóstico, La Plata.

Dr. LEONARDO JULIO FELDMAN Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Nacional del Centro de la Provincia de Buenos Aires Pinto 399, Tandil, Argentina. Correo electrónico: leonardofeldman2009@gmail.com