Introducción

La tasa de filtración glomerular estimada (TFGe)⁴ se aplica ampliamente para el diagnóstico de la enfermedad renal y el monitoreo de la función renal en pacientes con enfermedad renal crónica (ERC) (1). Se define ERC como la presencia de daño renal o una tasa de filtración glomerular (TFG) <60 mL/min/1,73 m² por un período ≥3 meses, independientemente de la causa (1)(2). Las ecuaciones de la Chronic Kidney Disease – Epidemiolog Collaboration (CKD-EPI) y la Modification of Diet in Renal Disease (MDRD) son las más comúnmente usadas en la práctica clínica para estimar la TFG (3)(4). Aunque las ecuaciones se construyen de forma diferente, el cálculo de CKD-EPI y MDRD se basa en los 2 biomarcadores renales: creatinina y cistatina C (3,4,5). Las concentraciones séricas de creatinina y cistatina C pueden fluctuar durante el día, ya sea debido a diferencias circadianas verdaderas en la TFG o a una variación biológica aleatoria, sin que reflejen cambios reales (6)(7). Estas fluctuaciones podrían afectar la interpretación de los valores de TFGe calculados en base a valores de creatinina y/o cistatina C. La comprensión de la magnitud de estas fluctuaciones diurnas podría evitar que los profesionales médicos interpretasen erróneamente variaciones aleatorias como cambios de relevancia clínica (8).

Los estudios de variación biológica permiten una evaluación sistemática de la variación aleatoria diurna de biomarcadores. Hasta ahora, la mayoría de los estudios que han evaluado la variación biológica de los biomarcadores renales y la TFGe estudiaron la variación interdía (6)(9,10,11,12,13,14,15,16,17), pero los datos sobre la variación biológica intradía son escasos (18). Además, la mayoría de los estudios se llevaron a cabo con voluntarios sanos o en sujetos con función renal alterada, pero faltan datos respecto a una comparación directa de sujetos con y sin ERC (6)(15)(19)(20). En este estudio, se intentó construir perfiles de concentraciones de creatinina y cistatina C durante 24 horas, así como las estimaciones de TFG basadas en creatinina y/o cistatina C. Además, se evaluó si la variación a lo largo del día es de magnitud similar en sujetos con ERC y sujetos sin ERC.

Materiales y Métodos

DISEÑO DEL ESTUDIO Y POBLACIÓN

Este estudio sobre la variabilidad a lo largo de 24 horas en la función renal y la TFGe se realizó entre enero de 2013 y octubre de 2015, tal como se describió anteriormente (21)(22). Se llevó a cabo de acuerdo con los principios de la Declaración de Helsinki (23) y fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional y el comité de ética del Centro Médico de la Universidad de Maastricht. Cada participante proporcionó el consentimiento informado por escrito.

El diseño del presente estudio cumplió con los requerimientos actuales para estudiar la variación biológica tanto como fue posible (24)(25).

En total, 44 sujetos fueron incluidos y divididos en 2 grupos de estudio: El primer grupo de estudio consistió en 24 individuos sin diagnóstico clínico de ERC (79% hombres y 21% mujeres), y el segundo grupo (70% hombres y 30% mujeres) consistió en 20 pacientes (participantes número 25 al 44) con ERC clínicamente diagnosticada como estadio 3 o superior (TFGe, <60 mL/ min/1,73 m²) (2). El número de individuos en cada grupo proporcionó suficiente poder estadístico para hacer estimaciones fiables sobre la variación biológica (26). Todos los sujetos enrolados en el estudio fueron de raza blanca y tenían entre 39 y 83 años. Glucosa en ayunas ≥126 mg/dL y/o HbA1c≥6.5% (47 mmol/mol) fueron criterios para definir diabetes (27). Los criterios de exclusión fueron: estar bajo tratamiento de diálisis en el momento del estudio, ocurrencia de infarto agudo de miocardio en los 12 meses anteriores al estudio, presencia de enfermedad cardíaca activa (angina de pecho, miocardiopatía o miocarditis) y anemia (hemoglobina <10,5 g/dL).

RECOLECCIÓN Y MANEJO DE MUESTRAS

Tanto la creatinina como la cistatina C fueron medidas en un autoanalizador Cobas® 8000 (Roche Diagnostics) usando los siguientes reactivos de Roche: CREP2 (Creatinine plus ver.2, código 05168589) y CYSC2 (Tinaquant Cystatin C Gen.2, código 06600239). Se utilizó un método enzimático para medir la creatinina, basado en la conversión de creatinina mediante las enzimas creatininasa, creatinasa y sarcosina oxidasa en glicina, formaldehído y peróxido de hidrógeno. Se utilizaron controles Bio-Rad para creatinina y Cystatin C Control Set Gen.2 para cistatina C (Roche Diagnostics).

La TFGe se calculó usando las fórmulas MDRD y CKD-EPI (3)(5). Se calcularon tres estimaciones de CKD-EPI: CKD-EPI_creatinina, CKD-EPI_cistatina C y CKDEPI_{creatinina-cistatina C}(4). Se tomaron muestras de sangre con intervalos de una hora en tubos con EDTA como anticoagulante (8 mL). Las muestras de plasma se centrifugaron inmediatamente después de la recolección (centrifugación a 2700 x g durante 12 min a temperatura ambiente), y el plasma se almacenó a -80 °C hasta el momento del análisis. Las muestras de plasma se descongelaron y todas las muestras del mismo individuo se analizaron en una sola corrida.

Para estimar la variación analítica (CV_A), se analizaron por duplicado las muestras de 8 individuos seleccionados al azar (4 individuos sin ERC y 4 individuos con ERC, representando el 18% de todas las muestras).

PROCEDIMIENTO DE ESTUDIO

Para estudiar la variabilidad biológica intradía, se tomaron muestras de sangre cada hora durante 24 h usando una cánula intravenosa. Los participantes ingresaron al laboratorio a las 8 AM, después de un ayuno nocturno. Durante el día de la prueba, los participantes fueron restringidos al laboratorio en reposo. Los horarios de ingestas fueron estandarizados de la siguiente manera: a las 8:30 AM (desayuno), a las 12:30 PM (almuerzo) y a las 6 PM (cena). Los participantes podían seleccionar entre aproximadamente 4 diferentes opciones de cena. La mayoría de las opciones de cena consistieron en platos que contenían carne. Las opciones de comida y el contenido de carne no fueron estandarizados. El desayuno y el almuerzo consistían en sándwiches con queso, jamón o coberturas dulces. Los participantes se acostaron a las 11:30 PM y se levantaron a la mañana siguiente a las 7 AM. Durante la noche, se unió una línea de extensión a la cánula para evitar la alteración del sueño durante el muestreo de sangre.

ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Tal como se recomienda para los estudios de variación biológica, se realizaron análisis de valores atípicos en los 3 niveles (analítico, intraindividual e interindividual) (7)(26). Se utilizó la prueba de Cochran para identificar valores atípicos a nivel analítico e intraindividual, y el criterio de Dixon-Reed se realizó para identificar valores atípicos a nivel interindividual (7)(8)(28)(29). Sujetos con variaciones intraindividuales atípicas fueron excluidos de los cálculos debido a su heterogeneidad de varianza (24). Dado que los datos en los niveles analíticos, intra- e inter-individual presentaron una distribución gaussiana (prueba de Shapiro-Wilk), no se necesitó transformación de datos. Para la verificación de la normalidad analítica, se utilizaron datos de 8 individuos que se midieron por duplicado (192 repeticiones). Para el nivel intraindividual, se verificó la normalidad para cada participante. Para el nivel interindividual, se verificó la normalidad para las medias de cada sujeto. La variación en 3 niveles, la variación interindividual (CV_G), la variación biológica intraindividual (CV_I) y el CV_A, se calcularon usando un ANOVA anidado con IC del 95% determinado según el método de Burdick y Graybill (8)(26)(30).

Los valores de referencia para el cambio (VRC) (score Z de 1,96) y el índice de individualidad (II) se calcularon de acuerdo con el método de Fraser y Harris (8):

Se utilizó la prueba F para corroborar si el grado de insuficiencia renal era estable en los sujetos con ERC. Para investigar esto, se examinó la TFGe 1 semana, 1 mes y 3 meses después del día de la prueba inicial. Los valores P<0,05 se consideraron estadísticamente significativos.

Para visualizar el ritmo diurno de la cistatina C, se ajustaron las curvas de concentración de 24 horas para ambos grupos de estudio usando Cosinor Rhythmometry.

Todos los cálculos estadísticos se realizaron con SPSS para Windows versión 23 (IBM SPSS Statistics).

Resultados

SELECCIÓN DE PARTICIPANTES

Un total de 44 individuos, 24 sin ERC y 20 con ERC, participaron en este estudio de variabilidad biológica. Dos participantes (1 y 8) abandonaron el estudio prematuramente y de otros 2 participantes (15 y 23) se perdieron datos debido a problemas con la cánula endovenosa durante la noche. Para mantener un diseño equilibrado y en línea con las condiciones estadísticas para un ANOVA anidado, se consideró a estos sujetos como no seleccionados y fueron excluidos de los análisis posteriores (31). Además, se excluyó al participante 20 porque este participante sufría un resfrío severo en el día del examen; por lo tanto, su situación clínica era inestable. A pesar de que los participantes 10 y 18 no estuvieran clínicamente diagnosticados con ERC, estos participantes fueron excluidos del estudio debido a que sus concentraciones de creatinina no se ajustaban al grupo sin ERC (concentraciones medias, 1,8±0,2 mg/dL y 2,0±0,08 mg/dL, respectivamente). En la Figura 1 de resultados suplementarios que acompaña a la versión en línea de este artículo en http://www.clinchem.org/content/vol64/issue5, se muestra el diagrama de flujo del estudio. Eventualmente, 37 sujetos fueron consideradas elegibles para análisis. Las características basales de los 2 grupos de estudio se muestran en la Tabla I.

Figura 1
Perfiles de variación a lo largo de 24 horas en personas sin enfermedad renal crónica

Los valores representan la media (Error Estandar). Todos los participantes durmieron entre las 11:30 p.m. y las 7 a.m. (Area sombreada).

Tabla I
Características basalesa

a Variables continuas se muestran como media �} desvio estandar, y variables categoricas se muestran como n (%).b La diabetes se definio como glucosa plasmatica en ayunas ≥126 mg/dL y/o HbA1c ≥6,5% (= 47 mmol/mol) (27).c NA, no aplica.

ESTABILIDAD CLÍNICA DE LOS SUJETOS CON ERC

Para verificar que los sujetos con ERC estuvieran clínicamente estables y no progresaran rápidamente en términos de su ERC, se tomaron muestras de sangre adicionales a la semana, a 1 mes y a los 3 meses después del día de la prueba, a la misma hora que la medición de referencia en el día de la prueba inicial (8:30 AM). Los valores de TFGe (calculados con MDRD, CKDEPI _creatinina, CKD-EPI _{cistatina C} y CKD-EPI _{creatinina-cistatina C}) no mostraron disminuciones significativas durante el período de seguimiento (intervalos de concentración mínimo- máximo en el seguimiento: MDRD, 18,7 -19,3 mL/ min/1,73 m², P=0,63; CKD-EPI _creatinina, 18,3-18,9 mL/ min/1,73 m², P=0,99; CKD-EPI _{cistatina C}, 20,1-20,3 mL/ min/1,73 m², P=0,49; CKD-EPI _{creatinina-cistatina C}, 18,6 -19,0 mL/min/1,73 m², P=0,99). Por ende, se consideró que los participantes con ERC tenían una enfermedad crónica estable.

PERFILES DE VARIABILIDAD DURANTE 24 HORAS

Las Figuras 1 y 2 muestran perfiles de variabilidad de 24 horas de creatinina, cistatina C y de todas las ecuaciones de TFGe para ambos grupos de estudio. Las concentraciones medias de creatinina y cistatina C fueron, por definición, significativamente más bajas en sujetos sin ERC que en aquellos con ERC (creatinina: 1,0±0,3 mg/dL vs. 3,3±1,0 mg/dL, P<0,01; cistatina C: 1,0±0,3 mg/L vs. 2,7±0,8 mg/L, P<0,01). En consecuencia, todos los valores promedio de TFGe fueron significativamente superiores en sujetos sin ERC en comparación con los sujetos con ERC (MDRD: 75±21 mL/ min/1,73 m² vs. 20±9 mL/min/1,73 m², P<0,01; CKD- EPI _creatinina: 74±18 mL/min/1,73 m² vs. 20±10 mL/min/1,73 m², P<0,01; CKD-EPI _{cistatina C}: 77±17 mL/min/1,73 m² vs. 24±14 mL/ min/1,73 m², P<0.01; CKD-EPI _{creatinina- cistatina C}: 76±17 ml/ min/1,73 m2 frente a 21±12 mL/min/1,73 m², P<0,01).

Figura 2
Perfiles de variación a lo largo de 24 horas en personas con enfermedad renal crónica

Los valores representan la media (Error Estandar). Todos los participantes durmieron entre las 11:30 p.m. y las 7 a.m. (Area sombreada).

Discusión

En el presente estudio, se presentaron perfiles de variación de 24 horas de creatinina, cistatina C y las estimaciones de TFG de ellas derivadas (MDRD, CKD-EPI _creatinina, CKD-EPI _{cistatina C} y CKD-EPI _{creatinina-cistatina C}) en sujetos sin ERC y en sujetos con ERC. Además, se calcularon componentes de variación separados y fueron comparados entre ambos grupos de estudio.

Un hallazgo importante de este estudio es que el CV_I para creatinina fue significativamente mayor en los sujetos sin ERC que en los sujetos con ERC. En este estudio, el efecto del pico de creatinina post-cena en el CV_I fue sustancial, especialmente para los sujetos sin ERC, dado que estos sujetos tienen bajas concentraciones basales de creatinina (media, 1,0 mg/dL). Para los sujetos con ERC, el efecto sobre el CVI fue menor debido a concentraciones de creatinina basales más altas (media, 3,3 mg/dL). Esta diferencia fue incluso más pronunciada en el análisis de sensibilidad que incluyó individuos con un aumento de creatinina post-cena (fisiológico) elevado, probablemente debido al consumo de carne, aumentando su CV_I y determinando su eliminación en base a criterios estadísticos. Sin embargo, la variación en las concentraciones de creatinina causada por la composición de la cena es de interés para la práctica clínica, dado que los pacientes a menudo cenan con carnes y otros contenidos desconocidos. Para la práctica clínica, esta variación podría incluirse idealmente, incluso si esta variación es estadísticamente grande y aparentemente divergente. Rivara et al. realizaron un análisis de sensibilidad similar en el que mostraron un ligero aumento del CV_I de creatinina después de incluir individuos que se excluyeron en el análisis primario debido a la heterogeneidad de las varianzas (19).

EL CV_I para creatinina en este estudio fue más alto que el reportado en el proyecto EUBIVAS (6,2% vs. 4,4%), lo que probablemente pueda atribuirse al hecho de que las concentraciones de creatinina medidas en el proyecto EUBIVAS fueron valores de CVI entre días medidos en sangre en ayunas en muestras recolectadas una vez al día a la misma hora entre las 8 AM y las 10 AM (20)(32). Por lo tanto, el aumento de creatinina después del consumo de carne no está integrado en el valor de CV_I de EUBIVAS. Debido a que el CVI intradía y el CVI interdías son conceptos diferentes, los resultados de este estudio no son directamente comparables con los del proyecto EUBIVAS.

El diseño de este estudio ha cumplido con los requerimientos actuales en relación a la variación biológica tanto como ha sido posible (24)(25). Solo en el ítem 7 de los requerimientos de variación biológica más reciente, el cual versa sobre la condición de estado estacionario, hubo un desvío respecto de los requerimientos, al no incluir el consumo de carne en el modelo para la concentración de creatinina para crear un estado de equilibrio. Si se incluye el consumo de carne en un modelo para creatinina, esto tiene consecuencias en cuanto a la cantidad de variabilidad que queda sin explicar, y con eso, el tamaño del CVI. En un entorno clínico, ni el momento de la cena de un paciente ni el contenido de carne de la cena (u otra comida) son conocidos por el médico que interpreta los resultados de laboratorio de creatinina. Por lo tanto, para fines clínicos, la variación resultante del consumo de carne no debe excluirse del modelo y debe incluirse en la estimación de CVI para permitir esta incertidumbre adicional. Debido a que la mayoría de los sujetos consume carne en su dieta, se puede considerar que nuestra estimación de CVI para un período de 24 horas refleja las condiciones fisiológicas típicas que enfrenta la interpretación de los resultados de creatinina y TFGe.

Debido a que este estudio no fue originalmente diseñado para investigar la influencia del consumo de carne sobre las concentraciones de creatinina, no se dispuso de datos individuales de los participantes detallados con respecto al consumo de carne durante el día. Sin embargo, el estudio de Nair et al. estandarizó el consumo de carne de todos los participantes y comparó sus resultados con una comida sin carne. El estudio de Nair describió un aumento significativo de la concentración de creatinina después de una comida con carne en todos los participantes del estudio (33). Para individuos sanos e individuos con ERC en estadio 1 o 2, el estudio reportó incrementos estadísticamente significativos en creatinina de 5 μmol/L (0,06 mg/dL) y 8 μmol/L (0,09 mg/dL), respectivamente. Se observó un aumento promedio similar, de 0,07 mg/dL (6,2 μmol/L) entre 6 PM y 10 PM, que presumiblemente estaría relacionado con la composición de la cena. Para los sujetos con ERC, el estudio de Nair et al., reportó aumentos máximos de creatinina de hasta 0,25 mg/dL (22 μmol/L), que es más pronunciado que el aumento promedio de 0,13 mg/dL (12 μmol/L) que se observó en los sujetos con ERC.

Sin embargo, el estudio de Nair et al. enfatiza el hallazgo de que la disminución relativa de TFGe después del consumo de carne es proporcionalmente menor en pacientes con estadios más avanzados de ERC (33), lo que es consistente con nuestros hallazgos. Otro estudio de Preiss et al., demostró que el efecto del consumo de carne podría tener un impacto en el diagnóstico debido a clasificaciones erróneas de estadios de ERC, si las mediciones se realizan después de consumir una comida de carne cocida (34). Los autores de este estudio afirman que los médicos deben asegurarse de que, al clasificar el estadio de la ERC, las muestras hayan sido tomadas en las condiciones adecuadas (34). Se aprobó esta conclusión, especialmente en el contexto de un estudio de variación biológica a lo largo de 24 h. En nuestro estudio se incluyó la determinación de creatinina para poder determinar el TFGe calculado, pero no para ser un indicador de TFG (35).

A diferencia de la creatinina, el CVI de cistatina C se ubicó en el mismo rango para los sujetos con o sin ERC, y su perfil de 24 h no se caracterizó por un pico posterior a la cena. A pesar de las diferencias sustanciales en la variación biológica y los VRC entre la cistatina C y la creatinina, especialmente en sujetos sin ERC, estas diferencias no se traducen en diferencias similares en la variación biológica y los VRC de las ecuaciones de TFGe derivadas de estos biomarcadores. De hecho, los valores CVI y VRC de la ecuación CKD-EPI _creatinina son de la misma magnitud en ambos grupos de estudio. Sin embargo, los valores CVI y VRC de la CKD-EPI cistatina C son de diferente magnitud. La transformación de _{cistatina C} a CKD-EPI _{cistatina C} conduce a valores CKD-EPI más dispersos que la transformación de creatinina a CKD-EPI _creatinina.

Los perfiles diurnos de cistatina C mostraron ritmos diurnos intrínsecos moderados, con una ligera disminución durante el día y un aumento durante la tarde y la noche. Esto concuerda con una filtración glomerular modestamente reducida en la noche, en comparación con el día (36)(37). Una ritmicidad diurna similar puede ser aparente en los perfiles de creatinina (al menos un patrón decreciente desde la mañana hasta la noche), pero se ve opacada por el pico de creatinina posterior a la cena. Curiosamente, el ritmo diurno de la cistatina C está algo disminuido en los sujetos con ERC. Este efecto puede explicarse por la reducción del aclaramiento renal en sujetos con ERC, lo que lleva a la acumulación de cistatina C y la consiguiente reducción en su ritmo diurno (38).

Las grandes oscilaciones rítmicas diurnas impiden el cálculo de los componentes de variación general y de los VRC, ya que se volverían dependientes de la hora del día. En cambio, se pueden calcular los VRC de hora a hora, que consideran el cambio estructural de acuerdo con el ritmo diurno. Tal enfoque ha sido aplicado previamente por nuestro grupo y otros para el cálculo de VRC para varios biomarcadores hematológicos y troponina T cardíaca (39)(40). Sin embargo, la variación rítmica de la cistatina C en este estudio fue tan pequeña que el cálculo de los componentes de variación de hora a hora y VRC habría complicado su interpretación sin ofrecer un beneficio sustancial en términos de precisión matemática.

Algunas limitaciones de este estudio merecen consideración: en primer lugar, el diseño del estudio no se limitó a la evaluación de la variación biológica de los biomarcadores renales. Aunque las horas de comida fueron estandarizadas entre los participantes del estudio, el contenido de las comidas no lo fue. Por lo tanto, el consumo de carne entre las comidas fue variable y puede haber explicado los incrementos muy variables de creatinina, especialmente después de la cena.

En segundo lugar, la relación entre hombres y mujeres estuvo sesgada (77% hombres y 23% mujeres), lo que impidió una evaluación sólida de posibles diferencias entre sexos. En tercer lugar, la extrapolación de este estudio a otras etnias puede ser limitada porque todos los participantes fueron de raza blanca. En cuarto lugar, la mayoría de los individuos, incluidos aquellos sin ERC, tenían comorbilidades. Sin embargo, la presencia de comorbilidades, así como el hecho de que las comidas no fueron estandarizadas, son representativas de un paciente promedio (tanto hospitalizado como ambulatorio) y proporcionan estimaciones de la vida real de la variación biológica de interés cuando se interpretan los resultados.

En conclusión, se muestra que el CVI de creatinina es mayor en los sujetos sin ERC que en los sujetos con ERC. A pesar de las diferencias en la variación biológica, los VRC de todas las estimaciones de TFG derivadas (MDRD, CKD-EPI _creatinina, CKD-EPI _{cistatina C} y CKD-EPI _{creatinina-cistatina C}) están dentro del mismo rango (13% -20%) y son similares para sujetos con o sin ERC.

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Notas de autor