La técnica de polarización fluorescente para el diagnóstico de Brucella en Chaetophractus villosus

Technique of fluorescence polarization for the diagnosis of Brucella in Chaetophractus villosus

A técnica de polarização fluorescente para o diagnóstico de Brucella em Chaetophractus villosus

La brucelosis es una enfermedad muy extendida por todo el mundo. Es causada por bacterias intracelulares facultativas gram negativas ⁽¹⁾, la cual se caracteriza clí­nicamente en rumiantes por uno o más de los siguien­tes signos: aborto, retención de placenta, eliminación de los microorganismos en las secreciones uterinas y en la leche, orquitis, epididimitis y en ocasiones muy infrecuentes, artritis.

Esta enfermedad también ha sido detectada en muchas especies silvestres alrededor del mundo. En Argentina existen registros en zorro gris (Pseudalopex gymnocercus) 17% ⁽²⁾, zorros colorados y grises (Dusic­yonculpaeus . Dusicyongriseus) 17,8% ⁽³⁾, liebres (Lepuseuropaeus) 6,6% ⁽⁴⁾ y peludos (Chaetophractus villosus) 16% ⁽⁵⁾. En algunas de estas especies se ha aislado la brucella productora de la enfermedad, encontrándose que la misma correspondía a Brucella suis biotipo I en el caso de liebres ⁽⁶⁾ y peludos ⁽⁵⁾. La caza de ambas espe­cies es habitual en la región, utilizándose su carne para consumo. La manipulación que se realiza luego de la caza y el consumo de carne mal cocida, constituye un serio riesgo para la salud humana considerando la alta prevalencia encontrada, particularmente en peludos.

El diagnóstico se realiza mediante el uso de diferentes técnicas, entre ellas el aislamiento del agente etiológico o el diagnóstico por serología utilizando distintas técnicas como la de antígeno bufferado en placa (BPA), seroaglu­tinación lenta en tubo (SAT), 2-mercaptoetanol (2-ME), Fijación del complemento (FC), ensayo por Inmunoad­sorción ligado a enzimas (ELISA) y la técnica de pola­rización fluorescente (FPA), siendo estos dos últimos ensayos similares o superiores a la FC ⁽⁷⁾.

La técnica de PFA requiere manipulaciones míni­mas y se puede completar en pocos minutos ⁽⁸⁾.

La prueba de BPA se utiliza como screening por su alta sensibilidad en paralelo con FC, ELISA y FPA como pruebas confirmatorias; éstas son adecuadas tanto para analizar rodeos como animales individuales, siendo to­dos estos métodos estandarizados y validados para el ganado bovino ⁽⁷⁾.

En otras especies, como por ejemplo en búfalos (Bubalus bubalus), bisonte americano y europeo (Bison bison, Bison bonasus), yak (Bos grunniens), ciervo colo­rado (Cervus elaphus), camellos (Camelusbactrianus . C. dromedarius) y camélidos sudamericanos, la infección por Brucella sp. sigue un curso similar que en el gana­do bovino ⁽⁷⁾⁽⁹⁾. Para estos animales pueden utilizar­se los mismos procedimientos serológicos ⁽¹⁰⁾, pero cada uno debe ser validado para la especie animal es­tudiada^(11)(12).

El objetivo de este trabajo fue comprobar si la técni­ca de FPA utilizada para la determinación de anticuer­pos contra Brucella en diferentes especies puede ser validada para su uso en el diagnóstico de brucelosis en Chaetophractus villosus.

De un total de 150 Chaetophractusvillosus, capturados en predios rurales de la provincia de La Pampa, se extra­jo una muestra de sangre (sin anestesia), por punción de la rete mirabile de la cola ⁽¹³⁾, que fue centrifugada a 2500 rpm durante 15 minutos. Luego se procedió a separar el suero en tubos Eppendorf y se los almacenó a -20 ºC hasta su procesamiento. A cada uno de los sueros se le realizaron las siguientes pruebas BPA, SAT, 2-ME, FC y FPA. Para comparar las distintas técnicas de bruce­losis se utilizó el Test de Concordancia de Diagnóstico (kappa) y la proporción de conformidad observada.

De un total de 150 muestras de sueros de C. villosus, se obtuvieron 24 muestras positivas a BPA. Las mismas también resultaron positivas por medio de las técnicas SAT, 2-Me, FC y FPA, estableciéndose un límite de corte de 82 mP para esta última técnica. A ese nivel de corte la sensibilidad y especificidad del FPA se ubicó en el 100%, al igual que los valores predictivos positivos y negativos.

El nivel de anticuerpos para las distintas técnicas ana­lizadas fue registrado en UI (unidades internacionales) para cada una de las 24 muestras de sueros positivas (Tabla I).

El índice Kappa fue de 1 para todos los tests de diag­nóstico comparados con FPA (IC: 0,84-1), considerán­dose un nivel de confianza de 0,95%, siendo la sensi­bilidad y especificidad del 100% para una prevalencia verdadera y aparente del 16%, siendo los límites de pre­valencia entre 10,1 y 21,8 (Win Episcope 2.0).

Los valores mínimos y máximos obtenidos mediante el uso de la técnica de Polarización Fluorescente estu­vieron entre 3,4 mP y 81,5 mP para los sueros negativos y entre 82,6 mP y de 277,3 mP para los sueros positivos (Tabla II).

Para los dos animales infectados naturalmente en los cuales fue posible aislar Brucella suisbiotipo 1 ⁽⁵⁾, la sero­logía resultó positiva para todas las pruebas diagnósticas, registrándose valores de FPA del orden de 106,2 mP y 271,3 mP, respectivamente, para cada uno de los sueros.

En Argentina la técnica de FPA ha sido utilizada para la detección de brucelosis en fauna silvestre en Lepus europaeus ⁽⁴⁾, Pseudalopexgymnocercus ⁽²⁾, Hydrochoerushydrochaeris ⁽¹⁴⁾, Blastocerusdichotomus ⁽¹⁵⁾ y Bubalusbubalis ⁽¹⁶⁾.

En C. villosus, la utilización de FPA resultó ser muy eficaz, ya que detectó los mismos sueros positivos que las Técnica de Aglutinación en Placa, SAT, 2-Me y FC. La alta concordancia entre las técnicas se ve reflejada con un valor de Kappa de 1, por lo que se puede afir­mar que el test de FPA a los valores de corte establecidos (≥82 mP), resulta ser una técnica aplicable a la detec­ción serológica de Brucella en Chaetophractus villosus.

Tabla 1
Muestras Positivas a BPA y grado de titulacion de titulacion de SAT, 2- ME, FC Y FPA

T: titulos (U/mL), grado de aglutinacion; Np: muestras positivas; Nt: muestra total; (%): prevalencia

Trabajos previos realizados en animales infectados experimentalmente con B. suis, en los cuales fue posi­ble aislar el microorganismo de distintos órganos, mos­traron valores muy superiores a los indicados a partir de la tercera semana de inoculación (datos sin publicar). También fue posible constatar los mismos valores en dos animales infectados naturalmente en los cuales B. suis biotipo 1 fue aislada siendo los valores registrados para FPA de 106,2 mP y 271,3 mP respectivamente.

Tabla 2
Valores minimos y maximos de FPA

La importancia de poder utilizar una técnica como FPA, que es rápida, sencilla y de bajo costo, redunda en un beneficio para el diagnóstico en animales silvestres en situaciones de reintroducción de individuos en una población salvaje, en las translocaciones de los mismos o en relación con proyectos de reproducción ex situ. Otro de los posibles usos de esta técnica sería para la confirmación de la ausencia de brucellas en armadillos (Chaetophractusvillosus) destinados a consumo humano.

Como conclusión se puede decir que la técnica de FPA mostró excelente correlación con las otras técni­cas utilizadas (BPA, SAT, 2-ME, FC), siendo la aplicación del test práctica y rápida, pudiendo recomendarse para el diagnóstico de rutina de la brucelosis en Chaetophractus villosus.