Introducción

La trichinellosis es una enfermedad parasitaria cau­sada por un nematodo filiforme perteneciente al géne­ro Trichinella que abarca varias especies con diferente distribución geográfica. T. spiraliscausa la mayoría de los casos humanos en todo el mundo ⁽¹⁾. Su patoge­nicidad es mayor que la del resto de las especies del género debido a que las hembras producen el número más alto de larvas recién nacidas, las cuales infectan el tejido muscular ⁽²⁾. Actualmente, la trichinellosis es una enfermedad endémica en Argentina, debido prin­cipalmente a las pautas culturales por las que es habi­tual el consumo humano de alimentos que contienen carne cruda o semi-cocida en forma de embutidos, cha­cinados y salazones, utilizándose para su elaboración la carne procedente de cerdos faenados y procesados en el ámbito familiar, sin inspección veterinaria ni diag­nóstico apropiado para detectar la presencia de larvas infectantes ⁽¹⁾.

Durante el ciclo biológico, las larvas recién nacidas de Trichinella (LRN) tienen contacto directo con los glóbulos rojos del hospedador debido a que circulan por el torrente sanguíneo hasta arribar a las células musculares donde se enquistan.

En experiencias previas se demostró que las LRN producen el aumento de la agregación eritrocitaria, in­dicando que capturan el ácido siálico globular ⁽³⁾, así como también que la desialización que provocan pue­de exponer al antígeno críptico T del glóbulo rojo ⁽⁴⁾.

El antígeno T (Thomsen-Friedenreich) es una glico­proteína asociada a cáncer o tumor, que se encuentra au­sente o enmascarada en los tejidos normales ⁽⁵⁾. Algunas sustancias presentes en ciertos microorganismos o sus lipopolisacáridos son responsables de la aparición de an­ticuerpos naturales anti-T, principalmente IgA e IgM, que se encuentran presentes en el suero humano normal de adultos, pero no en neonatos ni infantes tempranos ⁽⁶⁾.

El fenómeno Thomsen-Friedenreich, (poliaglutina­bilidad de los hematíes humanos) se debe al desenmas­caramiento del antígeno T por enzimas microbianas que eliminan residuos terminales de ácido siálico en la membrana del hematíe causando cambios en la estruc­tura de la glicoproteína de membrana de los glóbulos rojos (GR). La activación T desencadena en el hombre adulto poliaglutinación y una posible hemólisis, trom­bocitopenia y trombosis in vivo ⁽⁷⁾ y de ahí la importan­cia clínica de su investigación.

El objetivo del trabajo fue estudiar la desialización de eritrocitos que exponen antígeno T y de los glóbulos que no lo desenmascaran, por contacto con LRN de T. spiralis.

Materiales y Métodos

MUESTRAS

Larvas recién nacidas de T. spiralis (LRN)

Se utilizaron ratones CBi infectados con T. spiralis, provistos por el Bioterio del Instituto de Genética Expe­rimental de la Facultad de Ciencias Médicas (UNR). En­tre los 6 y 13 días post-infección, se obtuvieron hembras grávidas del intestino delgado de los ratones por cirugía, las cuales fueron incubadas en 100 μL de medio RPMI suplementado al 10% con suero fetal bovino y 250 μg/ mL de gentamicina durante 18 horas a 37 ºC en atmós­fera de 5% de CO2. Las LRN fueron separadas de las hembras adultas y recolectadas en solución fisiológica con formol. A las 24 horas se prepararon concentrados de LRN no viables, para lo cual se lavaron las larvas 3 veces por centrifugación en solución salina y se realiza­ron los recuentos, por duplicado, en microscopio óptico (500 LRN/mL) ⁽⁸⁾.

Los protocolos para la obtención de LRN, así como también de otros estadios parasitarios de T. spiralis, son utilizados en líneas de investigación de las Facultades de Ciencias Médicas y de Ciencias Bioquímicas y Far­macéuticas (UNR), los cuales fueron aprobados por los Comités de Bioética de ambas instituciones.

Glóbulos rojos en medio enzimático de bromelina (GR)

Se trabajó con eritrocitos Grupo 0 provenientes de dadores voluntarios sanos. Se colocó un volumen de se­dimento eritrocitario, previamente lavado en solución salina, con un volumen y medio de bromelina durante 30 min a temperatura ambiente. Posteriormente, los gló­bulos fueron lavados 3 veces con solución fisiológica ⁽⁹⁾.

MÉTODOS

Tratamiento de los eritrocitos

El tratamiento consistió en incubar 50 µL del sedi­mento globular con igual volumen del concentrado de LRN a 37 ºC durante 120 min, con agitación continua­da utilizando un agitador magnético (Decalab, Argenti­na) (GR Tratados).

Se realizó el tratamiento de 15 suspensiones eritro­citarias, y en cada uno de ellas hubo un control (eritro­citos en medio enzimático, sin contacto con LRN) que fue incubado de la misma manera con igual volumen de solución salina. Al finalizar el tiempo de incubación, los sedimentos de GR Tratados y del correspondiente control fueron lavados 3 veces en solución salina y se prepararon suspensiones de distintas concentraciones a partir de ellos, según requería el método empleado posteriormente.

Pruebas en tubo y placa de aglutinación anti-T con antígeno T

A los fines de determinar si el tratamiento de los eri­trocitos con las LRN, exponía el antígeno T, se prepara­ron suspensiones de GR tratados y GR controles al 2-5% para las pruebas en tubo y al 20% para las de placa. Se colocaron 20 µL de las suspensiones (2-5% y 20%) de GR tratados y controles en 2 tubos para cada prueba. A uno de cada par se le agregaron 20 µL de suero de individuos adultos sanos (sueros anti-T) y al restante 20 µL de suero de cordón (control negativo de anti-T). Todos los tubos se homogeneizaron por agitación y se colocaron, con tapones de goma, a 4 ºC durante 24 h. Pasado este tiempo, para la prueba en placa se volcó el contenido de los tubos correspondientes en una placa de vidrio y para la prueba en tubo fueron centrifugados durante 1 min a baja velocidad (500 rpm) y luego fue­ron agitados. En ambos métodos se observó la presen­cia o ausencia de aglutinación (9).

Para estudiar la desialización eritrocitaria por efecto del tratamiento con las larvas, en los GR tratados y con­troles, se aplicaron los métodos de titulación por Poli­brene y de Análisis Digital de Imágenes.

Método de titulación por polibrene en placa de vidrio

El método se aplicó simultáneamente en eritrocitos no tratados (Control) y en los mismos eritrocitos tra­tados con el parásito. Se realizaron diluciones seriadas progresivas en solución salina del Polibrene (Puro, 1/2; 1/4;……1/128). A continuación, se colocaron en una placa de vidrio, 15 µL de la suspensión globular al 20% con 15 µL de cada una de las diluciones del Polibrene, mezclando con varilla de vidrio. Se homogenizó por movimientos circulares de la placa durante 1 min, hasta que se produjo la agregación entre los eritrocitos con carga negativa y el policatión Polibrene ^(10)(11).

A los fines de comparar la agregación de los glóbulos tratados con la del respectivo Control, se semicuantifi­có con cruces la agregación obtenida con cada dilución del policatión (4+, 3+; 2+: 1+; +/-; -) asignándole un score a cada una según Goudemand y Marsalet ⁽¹²⁾, de acuer­do con la siguiente escala:

1. 4+ 10

   3+ 8

   2+ 5

   1+ 2

   + - 1 (agregación apenas visible)

   - 0 (sin agregación)

Coeficiente experimental de score total (CexpST) como el cociente entre el score total de la agregación de los eri­trocitos tratados y el score total de la agregación de los eritrocitos Control ⁽¹¹⁾.

Este coeficiente es igual a 1 cuando no hay modifica­ción de ácido siálico por acción del parásito y es igual a 0 cuando el tratamiento ocasiona la pérdida total del ácido siálico del eritrocito, o sea que la captación del mismo es máxima.

REACTIVOS

1. Polibrene 0,1%

   Solución de reserva 10% (1 g de Polibrene + 10 mL de Solución Fisiológica)

   Solución de Trabajo (5 mL de solución de reserva + 495 mL de Solución Fisiológica)

DISTRIBUCIÓN DE LOS AGREGADOS ERITROCITARIOS POR ANÁLISIS DIGITAL DE IMÁGENES

Los GR tratados y controles fueron suspendidos en plasma autólogo al 0,13% y mantenidos en reposo en un portaobjetos cóncavo durante 5 minutos para permitir la agregación. Las imágenes de las diferentes poblacio­nes de agregados para cada muestra, fueron obtenidas por duplicado con una cámara digital Mikova DCM500 (USB2.0) incorporada a un microscopio óptico (obje­tivo 40X). Se determinó la distribución del tamaño de los agregados eritrocitarios, para lo cual se realizó el conteo de agregados, y se clasificó de acuerdo con las siguientes categorías: células individuales; agregados de 2 ó 3 células; agregados de 4 a 6 y agregados de 7 o más células. Se calculó en las imágenes de cada muestra, el porcentaje de eritrocitos correspondiente a cada catego­ría y finalmente se promediaron los valores obtenidos. Se calculó el valor del Coeficiente de células aisladas (CCA) definido como la diferencia entre el número de células individuales iniciales (control) y finales (tratados) en re­lación al número de células aisladas observado antes del tratamiento. Cuando el valor de CCA es igual a 0 indica que no hubo variación en el número de células aisladas por acción del tratamiento, y cuando es igual a 1 señala la ausencia de células aisladas (agregación total) ^(13)(14).

Resultados

Los resultados de las Pruebas de Aglutinación anti-T con antígeno T mostraron en 5 de las 15 suspensiones globulares, que el tratamiento con las LRN provocó el desenmascaramiento del antígeno T. En 2 de estas sus­pensiones se observó la presencia de aglutinados en am­bas pruebas, mientras que en las otras 3 solamente en el método en placa. Ninguno de los GR tratados, aglutinó al ser enfrentado a suero de cordón. Los GR controles no aglutinaron con sueros de adulto ni de cordón.

El CexpST obtenido por el método de Titulación por Polibrene, en los eritrocitos que expusieron el antígeno T, estuvo comprendido entre 0 y 0,39, siendo la media ± desviación estándar=0,22±0,155, mientras que en las suspensiones en que el criptoantígeno no se desenmas­caró los valores del coeficiente oscilaron entre 0,65 y 1 con una media ± desviación estándar de 0,86±0,125. Los análisis estadísticos determinaron que el valor pro­medio de CexpST cuando se expuso el antígeno fue sig­nificativamente menor que cuando no hubo exposición (.<0,0001).

El estudio de la distribución de los agregados eritro­citarios mostró que las poblaciones de glóbulos rojos que expusieron el antígeno presentaron una marcada disminución de las células aisladas y un pronunciado aumento de los agregados formados por 7 o más glóbu­los en relación a los controles correspondientes, mien­tras que en las suspensiones eritrocitarias donde no hubo exposición, la disminución de las células aisladas con respecto a los controles fue menor, y el aumento de agregados fue menos pronunciado y estuvo homogé­neamente distribuido entre todas las categorías.

Los valores de CCA también variaron significativa­mente en los eritrocitos que expusieron el antígeno T y en los que no lo hicieron. En las suspensiones globula­res en las que hubo desenmascaramiento T, el coeficien­te varió entre 0,62 y 0,88 (media ± desviación estándar = 0,73±0,108), mientras que en las que no, el CCA alcanzó valores entre 0,01 y 0,45 (media ± desviación estándar = 0,205±0,163). Los resultados estadísticos mostraron que el valor promedio del coeficiente cuando se expuso el antígeno fue significativamente mayor que cuando no hubo exposición (.<0.0001).

Los resultados se muestran en las Figuras 1 y 2.

Discusión y Conclusiones

Los parásitos del género Trichinella infectan a anima­les domésticos y silvestres, así como también al hombre. Se ha comunicado que aproximadamente once millo­nes de personas en el mundo pueden estar infectadas con parásitos de este género, siendo T. spiralis la especie que causa más infecciones en humanos. Las caracterís­ticas que distinguen a las especies de Trichinella son el rango de distribución de sus hospedadores y la toleran­cia a la temperatura ⁽¹⁶⁾.

El ciclo de vida de estos parásitos consta de dos fases. La primera, llamada enteral o entérica, se inicia cuando el hospedador ingiere carne cruda o mal cocida contaminada con larvas musculares de Trichinella, y la segunda, que es la fase sistémica, comienza cuando las hembras fecundadas producen y liberan LRN, las cua­les penetran en la pared del intestino del hospedero y se distribuyen a otros tejidos a través de la corriente sanguínea o del sistema linfático ⁽¹⁶⁾. En esta segunda fase, el parásito tiene contacto directo con los glóbu­los rojos de su hospedador, por lo que el estudio de los efectos que puede producir sobre los eritrocitos tiene importancia clínica.

La activación T está frecuentemente asociada con la producción de neuraminidasas de organismos como Clostridium perfringens. Streptococcus pneumoniae, Bacteroi­des, Escherichiacoli, Vibrio Cholerae, bacilos gram-negati­vos como Actinomyces y el virus de la Influenza ⁽¹⁷⁾. El grado de activación T de los glóbulos rojos puede estar influenciado por la cantidad de neuraminidasas en la circulación sanguínea y probablemente disminuya por inhibidores de neuraminidasas presentes en el suero. Estos glóbulos rojos transformados son destruidos rápi­damente por hemólisis intravascular y eliminados de la circulación debido a la fijación de complemento y a la unión de IgM anti-T ⁽¹⁷⁾.

Investigaciones previas han comunicado que las LRN de T. spiralis alteran la agregación eritrocitaria ⁽³⁾. La desialización producida por las larvas provoca modifica­ciones hemorreológicas ⁽¹⁸⁾, así como también puede exponer el antígeno T en los glóbulos rojos ⁽⁴⁾.

El Método de Titulación por Polibrene permite es­tudiar, de forma indirecta, la carga y el contenido de ácido siálico superficial del eritrocito. Este policatión induce la agregación inespecífica de los glóbulos ro­jos. Mollison ha descripto esta técnica en tubo ⁽⁹⁾, uti­lizando la misma concentración de polímero que fue empleada en esta experiencia en placa (0,1%). Este autor ha comunicado que la deficiencia de ácido siáli­co debe superar el 12% para que los hematíes no sean agregados ⁽⁹⁾. Los resultados mostraron que la media ± desviación estándar de CexpST varió significativamente para las poblaciones globulares que expusieron el antí­geno T y para las que no. En las suspensiones que hubo exposición, el valor medio fue 0,22±0,155, lo que indi­ca la pérdida casi completa de ácido siálico, mientras que en las poblaciones que no lo desenmascararon fue 0,86±0,125, valor que representa una leve desialización.

El Análisis Digital de Imágenes es otra metodología de utilidad para estudiar la disminución en la carga eritrocitaria, traducida en el aumento de la agregación ⁽¹⁴⁾. El valor promedio de CCA en las poblaciones globulares que expusieron el antígeno T (0,73±0,108) señaló una marcada agregación y disminución de célu­las aisladas, en concordancia con el estudio de la Dis­tribución de los agregados eritrocitarios, en el cual se observaron bruscas disminuciones de células aisladas en relación al Control y pronunciado aumento de los agregados formados por 7 o más glóbulos.

En las poblaciones eritrocitarias que no lo expusie­ron el valor promedio de CCA (0,205±0,163) indicó una leve variación en el número de células aisladas por acción del tratamiento, coincidiendo con las observa­ciones del estudio de la Distribución de los agregados eritrocitarios, donde también se evidenciaron peque­ños aumentos de agregados distribuidos uniformemen­te entre todas las categorías en relación a los controles correspondientes. El análisis estadístico determinó qué valor promedio de CCA cuando se expuso el antígeno fue significativamente mayor que cuando no hubo ex­posición.

La experiencia realizada permite concluir que los va­lores de los coeficientes obtenidos por estos métodos di­fieren marcadamente en las poblaciones globulares que exponen el antígeno T y en las que no, por lo que estas técnicas podrían ser predictivas para detectar el desen­mascaramiento del antígeno T. Debido a la importancia clínica de la activación T, se propone continuar estos estudios con un mayor número de muestras, a los fines de determinar el valor de corte de los coeficientes en los eritrocitos que lo exponen y en los que no.

Referencias bibliográficas

1. Caracostantogolo J, Martínez M. Epidemiología de la trichinellosis y situación en la Argentina. Vet Argent 2009; 26(257). Disponible en: http://www.produccion-animal.com.ar/sanidad_intoxicaciones_metabolicos/ parasitarias/parasitarias_cerdos/08-Trichinellosis.pdf. (Fecha de acceso: 10 de julio de 2017).

2. Pozio E, KD Murrell. Systematics and epidemiology of Trichinella. Adv Parasitol 2006; 63: 367-439.

3. Ponce de León P, Fernandez A, Racca L, Vasconi MD. Alteración de la agregación eritrocitaria por larvas re­cién nacidas de Trichinella spiralis. Acta Bioquím Clín Latinoam 2015; 49 (4): 417-23.

4. Ponce de León P, Nocelli J, López Murúa G. Exposición de criptoantígeno eritrocitario por larvas recién naci­das de Trichinella spiralis. Acta Bioquím Clín Latinoam 2017; 51 (4): 669-73.

5. Carrasco Carrasco M, García Espinosa Rubio Campal F. Hematología 2: Hemostasia. Banco de Sangre. Control de Calidad. Madrid: Ed Paraninfo, 2002.

6. Borolessa H, Modi N, Cockburn H, Malde R, Edwards M, Roberts I, et al. RBC T activation and hemolysis in a neonatal intensive care population: implications for transfusion practice. Transfusion 2002; 42: 1428–34.

7. Martinez de Salinas J, Cosme A, Blasco E, Torrado J, Arenas JI, Cuadrado E Anticuerpos circulantes anti T (Thomsen-Friedenreich) y expresión anormal de este antígeno en carcinomas digestivos. Rev Doyma Inmunol 1988: 8-11.

8. Luebke RW. Nematodes as host resistance models for de­tection of immunotoxicity. Methods 2007; 41 (1): 38-47.

9. Mollison PL. Transfusión de Sangre en Medicina Clíni­ca. 1ª ed. Madrid: Ed Reverté SA; 1987.

10. Lin M. A safe, simple and efficient cross matching using the slide polybrene method. Transfusion Today 2006; 66: 28.

11. Goudemand M, Marsalet ID. Elements d´immuno-héma­tologie. Paris: Flammarion, 1967.

12. Ponce de León P, Racca L, Menendez M, Biondi C, Val­verde J. Acción de Ascarislumbricoides sobre la carga aniónica de eritrocitos y eritrocitos desializados. Acta Bioquím Clin Latinoam 2012; 46 (2): 247-56.

13. Foresto P, D’Arrigo M, Carrera L, Etcheparre R, Valverde J, Rasia R. Evaluation of red blood cell aggregation in diabetes by computerized image analysis. Medicina 2000; 60: 570-2.

14. Ponce de León P, Del Balzo G, Riquelme B. Biorheologi­cal action of Ascaris lumbricoides larvae on human eryth­rocytes. Cell Biochem Biophys 2013; 65 (2): 237-42.

15. Wackerly D, Mendenhall W, Scheaffer R. Estadística matemática con aplicaciones. 7ª ed. México: Thomson Learning; 2013.

16. Ortega Pierres MG. Triquinelosis. Ciencia 2017; 68 (1): 74-7.

17. Naomi L. Review T activation. British J Haematol 2001; 112: 259-63.

18. Ponce de León P, Toderi M, Castellini H, Riquelme B. In vitro alterations of erythrocyte aggregation by action of Trichinella spiralis newborn larvae. Clin Hemorheol Microcirc 2017; 65: 195–204.