Introducción

El Bisfenol-A (Bisphenol-A; BPA, por sus siglas en in­glés) es el ingrediente principal en la producción de policarbonato, poliéster insaturado, resinas de polisul­fona y epoxi. Los materiales que contienen BPA se han utilizado para muchas aplicaciones por lo que está pre­sente en productos de uso cotidiano y masivo, como, por ejemplo, en el barniz del interior de latas de con­serva, en envases utilizados para el almacenamiento de productos alimenticios y farmacéuticos, en la produc­ción de componentes de equipos médicos (para diálisis y oxigenación de la sangre), en selladores dentales y prótesis, botellas para la alimentación de lactantes y pla­tos de cocina. Desde hace décadas se conoce la débil es­trogenicidad que provoca el BPA debido a su estructura fenólica, imitando la acción de la hormona endógena (17β-estradiol). Sin embargo, estudios recientes revelan que, en una variedad de tejidos, el BPA no sólo tiene la eficacia del estradiol, sino que es igualmente poten­te, observándose cambios en la función celular a una dosis de 1 picomol ⁽¹⁾. Se lo designa como “disruptor endócrino” (DE) y sus efectos inciden en el desarrollo gonadal y del sistema nervioso central.

La dieta es la principal fuente de exposición humana a este DE ⁽²⁾. Los niveles de BPA en los alimentos están directamente relacionados con el tiempo de almacena­miento en los envases plásticos, y con las temperaturas utilizadas durante la esterilización, la pasteurización o el calentamiento de los mismos antes del consumo. Además, el BPA puede emigrar al contenido de una lata como consecuencia de factores mecánicos tales como abolladuras y remodelado de latas ⁽³⁾.

Estudios en animales demostraron que el BPA atra­viesa la placenta y se distribuye tanto en tejidos placen­tarios como fetales, hallándose valores de concentra­ción más elevados en ciertos tejidos fetales que en el suero materno luego de la dosificación ⁽⁴⁾⁽⁵⁾. Diver­sos estudios en humanos han detectado la presencia de BPA en suero materno, placenta, líquido amniótico, suero de cordón umbilical y en hígado fetal ⁽⁶⁾. En adultos el BPA es mayormente metabolizado al glucuró­nido biológicamente inactivo a través de la enzima he­pática uridinadifosfatoglucuroniltransferasa (UDPGT), pero en el hígado fetal humano la actividad de esta en­zima es escasa o prácticamente nula ⁽⁷⁾⁽⁸⁾. Además, se ha encontrado en tejidos placentarios humanos, que la enzima β-glucuronidasa es altamente activa y puede aumentar aún más la exposición fetal al BPA libre por hidrólisis del BPA conjugado que ingresa al comparti­miento fetal ⁽⁹⁾. Por esta razón, la presencia de BPA in utero podría ser particularmente perjudicial debido a la exposición prolongada del feto a la forma libre duran­te los períodos clave de desarrollo ⁽¹⁰⁾, y su toxicidad puede darse a dosis muy bajas, más allá de los límites que generalmente se consideraban seguros. Por lo tan­to, se ha planteado la necesidad de cuantificar trazas de BPA libre (forma estrogénica activa) en sangre de cor­dón umbilical para estudiar la exposición fetal al mismo y sus efectos en la población de Argentina. El objetivo del presente trabajo es el desarrollo y validación de un método analítico por cromatografía líquida de ultra rendimiento acoplada a un detector de espectrometría de masa en tándem (UPLC-ESI-MS/MS), utilizando un isótopo deuterado estable del BPA como estándar in­terno (BPA-d16), para la detección y cuantificación de trazas de BPA libre en plasma de cordón umbilical.

Materiales y Métodos

Materiales.

Los estándares de Bisfenol-A (BPA) y Bisfenol-A d16 (BPA-d16) fueron comprados a Sigma- Aldrich (Argentina). Los solventes metanol y acetoni­trilo Optima (grado LC/MS) son de Fisher Scientific. Se utilizó el sistema de Agua Ultrapura Sartorius Arium Pro, tubos de vidrio BD VacutainerTM con EDTA K3 y crioviales de polipropileno T310 - Cryovial® Simport.

Preparación de estándares de calibración, controles de calidad, y solución de estándar interno. El estándar de BPA y el estándar interno BPA-d16 fueron disueltos por se­parado en metanol y se preparó una solución de reserva de 0,1 mg/mL de cada uno. Por diluciones seriadas en metanol de la solución de reserva de BPA se prepararon las soluciones de trabajo que fueron utilizadas para for­tificar plasma humano normal. Se obtuvieron los están­dares de calibración plasmáticos necesarios para crear la curva de calibración de siete niveles de concentración, en un rango de 1,1 a 12,0 ng/mL. Las muestras de con­trol de calidad plasmáticas (Quality Control; QC, por sus siglas en inglés) fueron preparadas de la misma manera en tres niveles de concentración: 10,0 ng/mL (QC Alto), 5,6 ng/mL (QC Medio) y 3,3 ng/mL (QC Bajo). Por dilución en acetonitrilo de la solución de reserva de BPA-d16 se obtuvo la solución de trabajo de estándar in­terno de 10,2 ng/mL. Las soluciones de reserva fueron almacenadas a 4 ºC. Las soluciones de trabajo fueron almacenadas a 4 ºC y al abrigo de la luz por no más de una semana.

Recolección y preparación de muestra. Las muestras de sangre de cordón umbilical fueron recolectadas en el momento del nacimiento en tubos de vidrio con EDTA K3 como anticoagulante e inmediatamente enviadas al laboratorio, donde fueron centrifugadas a 3.500 rpm por 10 minutos a 4 ºC. Cada plasma sobrena­dante fue separado por aspiración con pipeta de poli­propileno, almacenado en crioviales de polipropileno, y conservado en freezer a -20 ºC hasta el momento de su análisis. Se analizaron en total 390 muestras de sangre de cordón umbilical de niños nacidos en el Hospital Italiano entre los años 2013-2014. Se les explicó a los padres los objetivos del estudio, se les garantizó la con­fidencialidad y se obtuvieron sus consentimientos infor­mados por escrito. Las muestras se recolectaron con la aprobación del Comité de Ética de Protocolos de Inves­tigación del Hospital Italiano de Buenos Aires (CEPI, N° de Protocolo: 2008).

Procesamiento de muestras (calibradores, QC’s y mues­tras en estudio). Una alícuota de 225 μL de plasma se co­locó en un vial de vidrio; se agregaron 900 μL de la so­lución de trabajo de estándar interno y se homogeneizó en vortex durante 30 segundos. La mezcla fue centrifu­gada a 3.500 rpm y a 4 ºC por 10 minutos. Se obtuvo un sobrenadante que fue transferido a otro vial de vidrio y luego inyectado (3 μL) en el UPLC-MS/MS a través del automuestreador. Todas las muestras fueron procesadas y analizadas en febrero de 2016. Se ha demostrado que el BPA es estable en biofluidos humanos almacenados en freezer a -20 ºC por más de 20 años ⁽¹⁰⁾.

Separación y cuantificación.

Los análisis se realizaron utilizando un equipo de cromatografía líquida de ultra rendimiento marca Waters, modelo ACQUITY UPLC H-Class, acoplado al espectrómetro de masa de triple cua­drupolo marca Waters, modelo Xevo TQ S. El programa de control de instrumentos es el MassLynx v.4,1 (adqui­sición de datos y procesado de espectros). El programa TargetLynx fue utilizado para el procesamiento de los datos del monitoreo de reacciones múltiples (MRM). Para la cromatografía analítica se utilizó una columna ACQUITY UPLC BEH C18 (2,1 x 100 mm, 1,7 μm de Waters) operando a 45 ºC. La fase móvil se compone de agua: acetonitrilo (50:50). El flujo fue de 0,4 mL/min en elución isocrática durante 3 minutos, siendo el volumen de inyección de muestra de 3 μL. La fuente de ionización por electrospray (ESI) fue utilizada en modo negativo. Los parámetros de operación fueron optimizados bajo las siguientes condiciones: voltaje del capilar, 2,69 kV; temperatura de la fuente, 150 ºC; temperatura de desol­vatación, 550 ºC; flujo del gas de desolvatación, 1000 L/ hr (N2); flujo del gas nebulizador (N2), 7 bares; flujo del gas del cono (N2), 150 L/hr; flujo de gas de colisión (Ar), 0,10 mL/min. Los datos para la cuantificación y confirmación fueron adquiridos en el modo monitoreo de reacciones múltiples (MRM). Las transiciones ion pre­cursor a ion producto, las energías de cono y de colisión óptimas para cada analito están listadas en la Tabla I. La concentración de BPA en cada muestra fue medida por interpolación en la curva de calibración de la relación de áreas de pico entre el analito y su estándar interno.

Evaluación de la contaminación por BPA.

Para poder evaluar la posible contaminación por el BPA presente en el ambiente del laboratorio analítico y en los mate­riales utilizados, se prepararon diferentes blancos. Se evaluaron los tubos contenedores de muestra, los crio­viales, las puntas para pipetas, viales para automuestrea­dor, etc. Asimismo, se analizó el aporte de BPA prove­niente de las tubuladuras del equipo cromatográfico. No se ha detectado la presencia de BPA por encima del límite de detección (LD) en todas las pruebas realiza­das. Además, se evaluó el posible aporte de BPA (no deuterado) a partir del BPA d16 (estándar interno) debido a un enriquecimiento isotópico incompleto, y resultó por debajo del LD.

Validación del método.

Se utilizó un procedimiento basado en los criterios de validación publicados por la EMA ⁽¹¹⁾. El método de UPLC-MS/MS fue validado para selectividad, linealidad, límite de detección (LD), límite inferior de cuantificación (LIC), exactitud y pre­cisión intradía e interdía.

La selectividad fue evaluada por comparación del área del pico cromatográfico entre el blanco de mues­tra y la muestra del estándar de calibración. El área del pico en el tiempo de retención esperado para cada ana­lito en las muestras blanco debe ser menor al 20% del promedio de áreas de pico en las muestras del LIC.

La curva de calibración fue construida trazando la relación de áreas de pico entre el analito medido y el estándar interno en el eje de ordenadas (eje Y) con res­pecto a la concentración nominal del analito en el eje de abscisas (eje X), para cada uno de los calibradores. Se realizó un análisis de regresión lineal por mínimos cuadrados con una ponderación 1/x, y fueron calcula­das la pendiente, la ordenada al origen, y el coeficiente de determinación (R2) de la curva de calibración (soft­ware Masslynx 4,1; módulo TargetLynx).

El LIC del ensayo fue definido como la menor con­centración de la curva de calibración que se podía cuantificar (LIC, relación señal/ruido (S/N) ≥5). El LD fue definido como la menor concentración que se podía detectar (LD, S/N ≥3).

La exactitud y precisión del método fue evaluada mediante las muestras de QC’s plasmáticas a concen­traciones baja, media y alta. Se midieron cinco repli­cados de cada nivel de concentración para evaluar la precisión y exactitud intra-día, luego se evaluó la inter-día durante los cinco días de validación. La precisión del ensayo es expresada como un Coeficiente de Varia­ción Porcentual (CV%) de la concentración medida a cada nivel. La exactitud del ensayo se expresa como un porcentaje de desviación de la concentración medida con respecto a la concentración nominal en cada ni­vel, y se denomina Error Relativo Porcentual (ER%). La precisión y exactitud intra-día e inter-día no debe exceder de 15%.

Análisis de datos y estadística. Se utilizó el software Tar­getLynx 4,1 para generar “tablas de cuantificación” que contienen: tiempo de retención (Tr), valores del área de señal, y concentración para cada variable en cada mues­tra. Los cálculos de la relación lineal entre áreas de señal y concentraciones se obtuvieron mediante regresión de mínimos cuadrados ponderados. Los resultados se pre­sentaron como la media ± desviación estándar.

Resultados

Selectividad. El método analítico permitió diferen­ciar al BPA y a su estándar interno de otros componen­tes plasmáticos (Fig. 1).

Figura 1
Selectividad. (A): No se observó pico de BPA (Transición 227>212) en el blanco cero (Plasma Normal + Estándar Interno). (B): Presencia de BPA y BPA d16 en el calibrador.

Linealidad, Límites de Detección y Cuantificación. La curva de calibración preparada en plasma humano nor­mal resultó ser lineal entre 1,1 y 12,0 ng/mL, con un co­eficiente de determinación (R2) mayor a 0,99 (Fig. 2). El Límite de Detección fue de 0,6 ng/mL y el Límite de Cuantificación fue de 1,1 ng/mL (ambos límites fueron analizados para BPA en 225 μL de plasma).

Tabla I

Transiciones MRM seleccionadas.

Precisión y Exactitud. En la Tabla II están representa­dos los valores de Precisión (CV%) y Exactitud (ER%) para los tres QC´s utilizados, en las mediciones de repli­cados Intra-Día (n=5) y para las mediciones de replica­dos Inter-Día (n=13).

Valores de BPA libre hallados en plasma de cordón um­bilical. Se detectó la presencia de BPA libre en un 5,1% (20/390) del total de muestras analizadas. La Media ob­tenida del total de muestras cuantificadas fue de 3,69 ng/mL (desviación estándar: 3,55). Sólo dos muestras (0,5 % del total) resultaron por encima del Límite Su­perior de Cuantificación (LSC). En la Tabla III están re­sumidos los valores obtenidos con el método validado.

Figura 2
Linealidad. Curva de calibración.

Discusión y Conclusiones

El mayor desafío por resolver en la cuantificación plasmática de BPA es su presencia como contaminante en la recolección y preparación de muestra, y en el siste­ma cromatográfico. El BPA está presente en el plástico de la mayoría de los materiales utilizados en el labora­torio (puntas de pipetas, tapas de viales y botellas, viales tipo Eppendorf, etc.). Las tubuladuras del UPLC por donde circulan los solventes (fases móviles) también pueden contener BPA. Algunas marcas comerciales de los solventes utilizados (metanol, acetonitrilo, etc.) presentan contaminación con BPA. El agua ultrapura que se utiliza en el laboratorio puede contener trazas de BPA debido a que los filtros de polisulfona que uti­liza el equipo de purificación están hechos a partir del mismo. Por todo lo expuesto, el problema más noto­rio a sortear en el análisis de ultra trazas de BPA es la “contaminación de fondo” (background) que dificulta lograr bajos límites de detección. Cuando los niveles de contaminación en el blanco de muestra no son estables se pueden producir sub o sobre estimaciones en los re­sultados analíticos. Es necesaria una rigurosa revisión de las fuentes de contaminación para identificarlas y poder minimizarlas o evitarlas por completo. Incluso el muestreo, el almacenamiento y la filtración de muestras pueden ser fuentes de contaminación.

Luego de un largo y laborioso trabajo, tendiente a reducir la contaminación de fondo de BPA para lograr buena repetitividad en las mediciones a nivel de ultra­trazas, el pico cromatográfico de BPA seguía estando presente no solo en la inyección de muestras blanco sino también cuando se hacían inyecciones vacías (sin volumen) utilizando una elución en modo gradiente. Se evaluaron distintas soluciones de lavado del sistema de inyección del equipo ya que se creía que el BPA pre­sente era producto de una deficiente limpieza del sis­tema cromatográfico. Además, se probaron diferentes gradientes de elución sin obtener resultados satisfacto­rios. Por último, se decidió cambiar la elución en gra­diente por una isocrática, compuesta por partes igua­les de fases acuosa y orgánica. Luego de una serie de pruebas se llegó a la misma conclusión que Wilczewska et al ⁽¹²⁾, las trazas de BPA presentes en los solventes utilizados para las fases móviles (incluso los de grado LC/MS) se van reteniendo y enriqueciendo en el fren­te de la columna durante su acondicionamiento (don­de la fuerza de elución de la fase móvil es baja), y se observó que la intensidad del pico de BPA aumentaba proporcionalmente al período de acondicionamiento utilizado. El uso de una fase móvil con mayor poder de elución (50% v/v acetonitrilo) y en un modo isocrático evitó la acumulación de BPA en el frente de la columna cromatográfica.

Tabla II

Precisión y Exactitud.

Tabla III

Resumen de los resultados obtenidos de BPA libre en plasma de cordón umbilical humano.

De esta manera se obtuvo un método rápido, sensi­ble y selectivo para la medición de BPA en sangre de cordón umbilical que, además, solo requiere de un sim­ple pretratamiento de muestra, teniendo en considera­ción evitar el uso de material de plástico en todas las etapas, desde la toma de muestra hasta la obtención del extracto a inyectar en el UPLC-MS/MS.

En la Tabla IV están indicados los valores de BPA li­bre publicados en bibliografía hasta el presente estu­dio. Se destaca este trabajo por ser el de mayor tamaño muestral y por el uso de la UPLC para la separación de los componentes de la muestra. Los métodos que uti­lizan la detección por espectrometría de masa poseen mayor selectividad, cualidad necesaria para una cuan­tificación precisa en matrices biológicas complejas. Los únicos métodos de detección directa de BPA, en los cuales no se utilizó derivatización previa a la cuantifi­cación, corresponden al trabajo de Gerona et al ⁽⁶⁾ y al presente, por lo tanto, en el resto de los estudios existe la posibilidad de pérdida de analito por una deficien­te derivatización. La diferencia entre estos dos trabajos radica en cuándo fue el momento en que se realizó la toma de muestra. Gerona et al reclutó a mujeres emba­razadas que electivamente terminaban su embarazo en el segundo trimestre a diferencia del trabajo realizado en nuestro laboratorio donde las muestras fueron reco­lectadas al nacimiento.

Tabla IV

Valores publicados de BPA libre en sangre de cordón umbilical.

an: número de muestras. bLD: límite de detección. cDE: desviación estándar. dNR: no reportado.

En resumen, este trabajo es el primero que ha cuan­tificado BPA en sangre de cordón umbilical humano en Argentina y los resultados obtenidos son de suma im­portancia para evaluar la exposición fetal al mismo y sus posibles efectos en la población afectada.

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Notas de autor

Información adicional

CONSIDERACIONES ÉTICAS: Este protocolo de investigación y su financiación fueron registrados y aprobados por el Comité de Éti­ca de Protocolos de Investigación del Hospital Italiano de Buenos Aires (CEPI, N° de Protocolo: 2008). Se dio a los participantes una explicación de los objetivos del estudio, se les garantizó la confidencialidad y se obtuvo su consentimiento.