Introducción

Uno de los problemas más importantes de la salud universal está relacionado con la salud bucal. De las enfermedades bucales, las caries dentales y las enfermedades periodontales son las más comunes en el mundo y representan las principales causas de pérdida de dientes.

Estas patologías son causadas por la biopelícula o biofilm microbiano, que consiste en una comunidad microbiana compleja, organizada en una matriz extracelular adhesiva que se adhiere a las superficies dentales. Un alto consumo de hidratos de carbono fermentables puede desequilibrar este microecosistema, dando lugar a alteraciones microbiológicas y bioquímicas que favorecen el proceso de desmineralización (1).

En consecuencia, el control de las biopelículas es fundamental para prevenir la aparición y progresión de enfermedades bucodentales. El cepillado de los dientes es el método de higiene bucal más importante. Sin embargo, su efecto puede ser limitado en ciertos pacientes o áreas específicas. Por lo tanto, para lograr una óptima higiene bucal, el cepillado dental puede ir acompañado del uso de agentes quimioterapéuticos (2).

Entre los agentes antimicrobianos disponibles, el gluconato de clorhexidina se considera eficaz para reducir el número de microorganismos, así como para prevenir y tratar la inflamación gingival. Sin embargo, tiene muchos efectos secundarios, que incluyen tinción dental, formación de cálculos y alteración de la percepción del gusto (3).

La resistencia actualmente desarrollada por bacterias patógenas a los antibióticos y quimioterápìcos ha motivado en todo el mundo el estudio de opciones de tratamientos seguros, eficaces y con una relación costobeneficio favorable para la población. Surge así el interés por el empleo de plantas o sustancias naturales derivadas de ellas, para prevenir, aliviar o curar enfermedades (3).

Entre las plantas usadas en la medicina popular, Xenophyllum poposum (Phil) V.A. Funk, también llamada Werneria poposa Phil., es una planta anual ampliamente distribuida en el noroeste de la Argentina, Chile, Perú y Bolivia. Entre sus nombres vernáculos se reconocen “poposa”, “pupusa” o “fosfosa”. Crece en las altas montañas del noroeste argentino (4) y sus partes aéreas se emplean empíricamente en el tratamiento de hipertensión, trastornos digestivos, sobre todo intestinales, reumatismo, neumonía, mal de altura, también como antipirético, sedante, antiinflamatorio y remedio antirreumático (5) (6).

La incorporación de las medicinas tradicionales y la prescripción de fármacos naturales en el sistema local de salud debe obedecer a los criterios sugeridos por la Organización Mundial de la Salud en el año 2002 (7).

Entre la variedad de métodos utilizados para medir la sensibilidad in vitro de los microorganismos patógenos a antimicrobianos, el de uso más común en los laboratorios de microbiología es la difusión en agar y se basa en el método descripto por Bauer et al. en 1966 (8).

En consecuencia, el objetivo de este trabajo fue evaluar la actividad inhibitoria in vitro de distintos extractos de Xenophyllum poposum sobre microorganismos acidógenos como Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Lactobacillus casei, Actinomyces naeslundii, Actinomyces odontolyticus, Candida albicans y Veillonella sp., este último como indicador de salud en relación a caries dental (9).

Materiales y Métodos

Extractos vegetales

Las partes aéreas de X. poposum recolectadas en época de floración fueron desecadas y pulverizadas; luego se trataron por maceración con solventes de diferente polaridad (hexano, cloroformo y etanol) a temperatura ambiente durante 7 días. Los extractos obtenidos se concentraron al vacío en evaporador rotatorio a presión reducida; de esta manera, los solventes empleados para la extracción de los principios activos se evaporaron completamente y se obtuvieron extractos secos que se redisolvieron en etanol de 96º. Quedaron así conformados los extractos: hexánico (EH), clorofórmico (EC) y etanólico (EE). También se estudió el aceite esencial (AE) obtenido por hidrodestilación de las partes aéreas y una sustancia aislada de la porción acuosa remanente de la extracción del aceite esencial, la 6-hidroxitremetona (AP). Los extractos se prepararon a una concentración de 10 000 ppm.

El material vegetal se encuentra depositado en el Herbario del Instituto Miguel Lillo (LIL29301) en San Miguel de Tucumán, Argentina (5).

Controles

Como se empleó etanol para redisolver los extractos, se utilizó etanol de 96º como control negativo de inhibición.

La actividad antimicrobiana de los extractos se comparó con la producida por clorhexidina 0,12% (Plac out NF®) como antiséptico de referencia (control positivo de inhibición).

Microorganismos

Las cepas utilizadas en este trabajo fueron aisladas a partir de saliva en medios selectivos e identificadas en este laboratorio de acuerdo a sus características fenotípicas.

Las especies aisladas fueron las siguientes: S. mutans, S. sobrinus, L. casei, A. naeslundii, A. odontolitycus, C. albicans y Veillonella sp.

La identificación fenotípica de Veillonella se hizo hasta identificar solamente el género; esto se decidió porque todas las especies de Veillonella tienen el mismo comportamiento metabólico en la cavidad bucal (9).

Los microorganismos se activaron en caldo BHI y se ajustó la concentración para obtener una turbidez correspondiente al tubo Nº 0,5 de la escala de McFarland, que equivale a 1,5 x 108 UFC/mL.

Medios de cultivo

Los medios de cultivo utilizados en este trabajo para estudiar la acción antimicrobiana fueron: Agar Mitis Salivarius con bacitracina (AMSB) para S. mutans y S. sobrinus, Agar Rogosa (AR) para L. casei, Agar tioglicolato (ATG) para A. naeslundii y A. odontolitycus, Agar glucosado de Sabouraud (ASG) para C. albicans y Agar Veillonella (AV) para Veillonella sp.

Método

Para evaluar la acción antimicrobiana se empleó el método de difusión radial en agar. Se tomaron alícuotas de 1 mL de la suspensión bacteriana y se inocularon en tubos con 20 mL de los medios de cultivo mencionados mantenidos a 45 ºC en baño termostatizado. La siembra se realizó por inmersión para permitir un crecimiento en césped. Luego se colocó en placas, se dejó enfriar y una vez solidificado se hicieron perforaciones de 5 mm de diámetro con sacabocados estéril. En las perforaciones se colocaron 30 µL de las diferentes sustancias a evaluar, incluyendo el etanol usado en la preparación de los extractos y la clorhexidina como control positivo de inhibición (Plac out NF®).

Las placas se sometieron a una predifusión a temperatura ambiente, durante 3 h y luego se incubaron a 37º C, durante 72 h, en atmósfera adecuada para cada cepa microbiana (S. mutans, S. sobrinus, L. casei y Actinomyces en presencia de aire más 5-10% de dióxido de carbono; C. albicans en presencia de oxígeno y Veillonella sp. en anaerobiosis estricta). Transcurrido el tiempo de incubación, se evaluaron los resultados mediante la lectura del diámetro del halo de inhibición del crecimiento en milímetros (10). Además, se realizó el cálculo del porcentaje del efecto inhibitorio relativo respecto al control positivo de la manera siguiente (11):

Todas las determinaciones se realizaron por duplicado y para el estudio estadístico de los datos se utilizó el análisis de varianza. También se empleó la prueba de Tukey para determinar la diferencia entre las medidas comparadas y establecer diferencias entre los extractos evaluados y el control (Plac out NF®).

Resultados

Los resultados de la evaluación antimicrobiana de los diferentes extractos de X. poposum se muestran en la Tabla I, en la cual se observa el promedio de la medida de los halos de inhibición expresado en mm. En dicha tabla se puede observar que los extractos clorofórmico y etanólico produjeron inhibición de todos los microorganismos estudiados con un intervalo de confianza del 95% (p<0,05), donde los mayores halos de inhibición en términos de mm se obtuvieron con el extracto etanólico. Sin embargo, la diferencia entre ambos extractos no fue estadísticamente significativa p≥0,05). No se evidenció diferencia significativa en ambos extractos con respecto al control de Plac out NF®, a excepción de Veillonella, ya que el extracto etanólico presentó un halo de inhibición significativamente menor sobre este microorganismo, con un nivel de significación del 95%.

Frente a A. naeslundii y a C. albicans, el extracto etanólico presentó actividad similar a la clorhexidina. Sin embargo, cuando se analizaron los resultados en forma estadística mediante la prueba de Tukey y t de Student, los extractos etanólico y clorofórmico no evidenciaron diferencias significativas entre ellos según los valores de p (p≥0,05) ni con respecto a Plac out NF, frente a las cepas mencionadas previamente.

Con respecto al género Veillonella, el extracto etanólico produjo menor inhibición que el extracto clorofórmico. Clorhexidina también evidenció una importante acción antibacteriana sobre este microorganismo. La inhibición producida por el extracto etanólico fue estadísticamente menor si se compara con clorhexidina (p=0,035), lo cual sería favorable desde el punto de vista ecológico.

El alcohol empleado como control negativo de inhibición no ejerció actividad antimicrobiana per se sobre ninguna de las cepas microbianas empleadas en este trabajo.

El cálculo del porcentaje de inhibición relativa se expresa en la Tabla II y se efectuó considerando que el antiséptico de referencia producía el 100% de inhibición; en base a esto se calculó el porcentaje de inhibición producido por el extracto en estudio (11).

Cuando se realizaron los cálculos de porcentaje de inhibición relativa de los extractos, tomando como antiséptico de referencia a Plac out NF®, se encontró que el extracto etanólico superó el efecto inhibitorio de clorhexidina sobre S. mutans y S. sobrinus, L. casei y A. odontolitycus. Además, se obtuvieron también resultados satisfactorios sobre las demás cepas, según los datos expresados en la Tabla II. En base a esto, y teniendo en cuenta el porcentaje de inhibición relativa (11), X. poposum podría ser considerado de alta eficacia antimicrobiana ya que ésta resultó ser superior al 70% con respecto a clorhexidina sobre todas las cepas estudiadas, excepto sobre Veillonella sp.

Discusión y Conclusiones

Los mayores halos de inhibición para S. mutans fueron obtenidos con los extractos clorofórmico y etanólico. Con S. sobrinus se obtuvieron resultados similares, como sería de esperar debido a que ambos microorganismos pertenecen al mismo género y grupo, por lo tanto, comparten características similares.

Las cepas del género Actinomyces, tanto la especie A. naeslundii como A. odontolitycus, se mostraron muy sensibles a los extractos de X. poposum como así también frente al control positivo, mientras que el aceite esencial y la 6-hidroxitremetona no tuvieron efecto inhibitorio sobre estos microorganismos.

A pesar de que algunos autores atribuyeron actividad antimicrobiana al aceite esencial de X. popusum y al benzofurano- 6-hidroxitremetona, en esta experiencia no se observó actividad importante con estas sustancias (12).

El diámetro del halo de inhibición producido por el extracto etanólico de X. poposum y por Plac out NF® sobre C. albicans fue similar y de dimensiones considerables. El extracto clorofórmico evidenció menos actividad sobre este microorganismo.

Veillonella presentó elevada sensibilidad al extracto clorofórmico, seguido por el extracto hexánico. Los demás extractos naturales tuvieron menor actividad sobre este microorganismo. Se debe recordar que, como Veillonella es considerada indicador de salud con respecto a la caries dental, sería importante que las sustancias antimicrobianas usadas para el control del biofilm de la placa bacteriana mantengan los niveles de este microorganismo compatibles con la salud dental.

El etanol usado como control negativo no tuvo acción inhibitoria sobre ninguna de las cepas bacterianas empleadas en este trabajo. Aunque algunos autores han encontrado una eficacia parcial del etanol contra los microorganismos orales y actividad antimicrobiana contra las células planctónicas de S. mutans en la superficie de los brackets de ortodoncia (13), en este estudio la actividad in vitro del etanol fue nula.

El presente trabajo in vitro evidenció una buena sensibilidad de los microrganismos a la clorhexidina. Sin embargo, el empleo de cepas microbianas aisladas pudo no reflejar con fidelidad lo que sucede en la cavidad bucal. Esto es debido a que en la cavidad bucal se producen interacciones importantes entre los distintos microorganismos que integran el biofilm, que resultan en una mayor resistencia a los antimicrobianos en general (14). Sin embargo, los estudios de sensibilidad deben realizarse en un primer momento sobre microorganismos aislados y, como proyección, se podrían incorporar estudios sobre modelos de biofilms o sobre mezclas de microorganismos.

El medio base recomendado para realizar un antibiograma por difusión es el agar Mueller Hinton debido a su reproducibilidad aceptable y a ser un medio de cultivo económico. Sin agregados, solamente es recomendado para bacterias aerobias o anaerobias facultativas no exigentes en su metabolismo (10). Dado que las bacterias objetivo de este trabajo eran nutricionalmente muy exigentes, se utilizaron medios especiales para cada una de ellas (15).

La acción antibacteriana se considera alta cuando su porcentaje de inhibición relativo es mayor del 70%, intermedia entre el 50 y el 70% y baja cuando es menor del 50% con respecto al antimicrobiano de referencia (11). En base a esto, el extracto etanólico de X. poposum podría ser considerado de elevada acción antimicrobiana, ya que con todas las cepas microbianas en estudio evidenció porcentajes de inhibición relativa a la clorhexidina mayores al 70%, excepto con Veillonella. Esto es importante para contribuir a mantener el equilibrio ecológico en la cavidad bucal.

Por otro lado, al ser una sustancia nueva y en estudio, no hay demasiados datos sobre la toxicidad de X. poposum, salvo un trabajo realizado con 6-hidroxitremetona donde encontraron que no posee genotoxicidad, aunque resultó citotóxica para células vegetales (6). En el presente trabajo, la porción acuosa que contiene la 6-hidroxitremetona junto con el aceite esencial fueron justamente los que menor actividad antimicrobiana demostraron sobre las cepas evaluadas. Sería importante evaluar, en un futuro, la toxicidad de los demás extractos de esta sustancia natural.

A la luz de estos resultados, se cree que el extracto etanólico de X. poposum sería el más adecuado para continuar los estudios para conocer la concentración inhibitoria mínima y concentración bactericida mínima de esta nueva sustancia antimicrobiana.

Aun cuando pueden usarse antimicrobianos, como la clorhexidina u otra sustancia con la finalidad de disminuir eficazmente la carga microbiana en el biofilm dental a corto plazo (2), se debe tener en cuenta que la caries es una enfermedad dependiente de azúcares y está mediada por múltiples factores (1). Por lo tanto, se necesita un enfoque más amplio para controlar esta condición clínica.

Fuentes de financiación

Este trabajo fue subsidiado por el Consejo de Investigaciones de la Universidad Nacional de Tucumán (CIUNT).

Conflictos de intereses

Los autores declaran no tener conflictos de intereses respecto del presente trabajo.

Correspondencia

Dra. SOFÍA CRISTINA TORRES

Colombia 4562

4000 SAN MIGUEL DE TUCUMÁN, República Argentina

Correo electrónico:sofiatorresar@gmail.com

Referencias bibliográficas

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15. Castro Arqueros VM. Tesis de Especialidad: Inhibición del crecimiento in vitro de Streptococcus mutans por papaína y Sanitrend. Universidad de Chile. Facultad de Odontología. 2005.

Notas de autor

Dra. SOFÍA CRISTINA TORRES Colombia 4562 4000 SAN MIGUEL DE TUCUMÁN, República Argentina Correo electrónico:sofiatorresar@gmail.com