Resumen: Escherichia coli shigatoxigénica (STEC) está involucrada en el desarrollo del síndrome urémico hemolítico, entre otras enfermedades que son de gran importancia para la salud pública e inocuidad alimentaria a nivel mundial. La capacidad de STEC de formar biofilms en los alimentos y en diferentes superficies podría conducir a la contaminación cruzada por el desprendimiento de las células bacterianas. El objetivo del presente trabajo fue detectar la presencia de genes que codifican factores de adherencia mediante la técnica de PCR y determinar la capacidad de formación de biofilms por medio de cultivo en microplacas de poliestireno de 96 pocillos y la técnica de cristal violeta, en cepas de STEC aisladas de muestras clínicas humanas en la ciudad de Mar del Plata, Argentina. El perfil de genes de adherencia más frecuente fue efa1, iha, fimCD, ehaA, lpfA1-3, lpfA2-2, cah (43,9%). Todas las cepas de STEC formaron biofilms con valores de densidad óptica entre 0,209 y 3,251 y el 54,4% (31/57) de las mismas fueron clasificadas como fuertes formadoras de biofilms. La capacidad de formación de biofilms de STEC constituye un riesgo evidente en la transmisión de este patógeno al ser humano a tener en cuenta para su vigilancia y control.
Palabras clave: Escherichiacoli shigatoxigénica, Síndrome urémico hemolítico, Biofilms, Factores de adherencia.
Abstract: Shigatoxigenic Escherichia coli (STEC) is involved in the development of hemolytic uremic syndrome, among other diseases that are relevant to public health and food safety worldwide. The ability of STEC to form biofilms in food and on different surfaces could lead to cross-contamination by shedding bacterial cells. The aim of this work was to detect the presence of genes encoding adherence factors by the PCR technique and to determine the biofilm formation ability by culture in 96-well polystyrene microplates and the crystal violet technique, in STEC strains isolated from human clinical samples in Mar del Plata city, Argentina. The most frequent adherence gene profile was efa1, iha, fimCD, ehaA, lpfA1-3, lpfA2-2, cah (43.9%). All STEC strains formed biofilms with optical density values between 0.209 and 3.251. Also, the 54.4% (31/57) of STEC strains were classified as strong biofilm formers. The ability of STEC to form biofilms constitutes an evident risk in the transmission of this pathogen to humans, which must be taken into account for its surveillance and control.
Keywords: Shigatoxigenic Escherichia coli, Hemolytic uremic syndrome, Biofilms, Adherence factors, Shigatoxigenic Escherichia coli.
Resumo: A Escherichia coli shigatoxigênica (STEC) está envolvida no desenvolvimento da síndrome hemolítica urêmica, entre outras doenças relevantes para a saúde pública e segurança alimentar em todo o mundo. A capacidade do STEC de formar biofilmes nos alimentos e em diferentes superfícies poderia levar à contaminação cruzada através do desprendimento de células bacterianas. O objetivo do presente trabalho foi detectar a presença de genes que codificam fatores de aderência através da técnica PCR e determinar a capacidade de formação de biofilme por cultura em microplacas de poliestireno de 96 poços e da técnica de cristal violeta, em cepas STEC isoladas de amostras clínicas humanas na cidade de Mar del Plata, Argentina. O perfil de genes de aderência mais frequente foi efa1, iha, fimCD, ehaA, lpfA1-3, lpfA2-2, cah (43,9%). Todas as cepas de STEC formaram biofilmes com valores de densidade ótica entre 0,209 e 3,251. Também, os 54,4% (31/57) das estirpes STEC foram classificados como fortes formadores de biofilmes. A habilidade de formação de biofilmes de STEC constitui um risco evidente na transmissão deste patógeno ao humano, que deve ser levado em consideração para sua vigilância e controle.
Palavras-chave: Escherichia coli shigatoxigênica, Síndrome hemolítica urêmica, Biofilmes, Fatores de aderência.
MICROBIOLOGÍA
Caracterización genotípica y biofilms de E. coli shigatoxigénica aisladas de casos clínicos humanos
Genotypic characterization and biofilms of shigatoxigenic E. coli isolated from human clinical cases
Caracterização genotípica e biofilmes de E. coli shigatoxigênica isolados de casos clínicos humanos
Federación Bioquímica de la Provincia de Buenos Aires
Recepción: 04 Agosto 2021
Aprobación: 08 Marzo 2022
El síndrome urémico hemolítico (SUH) es una enfermedad que está ampliamente distribuida en el mundo. En la Argentina, el SUH es endémico y se presenta con una de las tasas de incidencia más altas a nivel mundial (1). El SUH se caracteriza por síntomas como falla renal aguda, trombocitopenia, y anemia hemolítica microangiopática (2). En la Argentina constituye la primera causa de insuficiencia renal aguda en pediatría y la segunda de insuficiencia renal crónica y, además, es responsable del 20% de los trasplantes renales en niños y adolescentes. Se producen entre 300 y 400 casos nuevos por año con un importante subregistro (1). La enfermedad no tiene un tratamiento específico pues el tratamiento con antibióticos está contraindicado (3).
Uno de los microorganismos mayormente asociados al SUH es Escherichia coli productor de toxina Shiga o shigatoxigénica (STEC), un patógeno emergente de gran importancia para la salud pública y la inocuidad alimentaria a nivel mundial. Las infecciones con STEC van desde diarrea acuosa, colitis hemorrágica hasta el SUH (4). Usualmente, STEC afecta en mayor medida a niños menores de 5 años, personas adultas mayores y pacientes inmunocomprometidos (4).
La transmisión de esta bacteria a los seres humanos puede ocurrir por el consumo de alimentos contaminados en los diferentes procesos de la cadena productiva (fundamentalmente carne, leche y otros subproductos del ganado bovino) (5), aunque también puede producirse por la vía fecal-oral, persona-a-persona o por el contacto directo con los animales. Los rumiantes son descriptos como el principal reservorio, pero la transmisión puede también ocurrir a través de otras especies domésticas, mamíferos salvajes, aves y peces (6). Por otro lado, el consumo de agua contaminada, los natatorios (7) (8) y el consumo de productos frescos y legumbres han emergido como responsables de importantes brotes de SUH en varios países (9) (10).
Más de 150 serotipos de STEC han sido descriptos asociados con brotes e infecciones humanas esporádicas. O157:H7 es el serotipo que se encuentra en mayor proporción en pacientes con SUH en la Argentina (1) (11) (12). Sin embargo, el número de infecciones asociadas a STEC no-O157 se ha incrementado en los últimos años y otros serotipos como O26:H11, O103:H2, O111:NM y O113:H21 O145:NM han sido implicados como causantes de enfermedad humana severa (13). Este escenario trae consigo nuevos desafíos para el diagnóstico y el control de este patotipo tanto en el ambiente de la salud pública como en la industria de los alimentos.
La patogenicidad de STEC está asociada con varios factores de virulencia, entre los que se incluyen principalmente la producción de la toxina Shiga (stx1, stx2), esenciales para características patogénicas y secuelas de la infección (2). Además, puede producir una enterohemolisina (EHEC-Hly) codificada por el gen ehxA que podría contribuir a la enfermedad mediante la lisis de los eritrocitos y la liberación de hemoglobina como fuente potencial de hierro para las bacterias. Por otra parte, dado que un paso importante para la patogénesis es la adherencia al intestino del hospedador, STEC puede secretar una proteína de membrana externa llamada intimina, codificada por el gen eae que se encuentra localizado en la isla de patogenicidad LEE (del inglés, locus of enterocyte effacement); esta proteína favorece la adherencia íntima de las bacterias a los enterocitos y la destrucción de microvellosidades (“attaching and effacing”, A/E) (14). En las cepas eae-negativas se han identificado varias proteínas con función de adherencia, algunas de las cuales están codificadas en una nueva isla de patogenicidad llamada locus de adhesión y autoagregación (LAA) (15) (16) (17). Se han descripto, además, otros factores de colonización del hospedador como, por ejemplo: una proteína homóloga a IrgA (iha) que confiere adherencia y permite la unión a células epiteliales en un patrón difuso (18), un factor de adherencia de E. coli enterohemorrágica (efa1) implicado en la colonización intestinal de terneros (19) y fimbrias como la fimbria tipo 1 (fim) y la fimbria curli (crl) que contribuyen a la adhesión al hospedador a las superficies abióticas y a la formación de biofilms (20) (21) y la fimbria larga polar (lpf) que participa en la adhesión a las células epiteliales y la colonización (22). En STEC se han descripto varias proteínas pertenecientes a la familia de proteínas autotransportadas (AT), como el antígeno 43 (agn43), el homólogo del antígeno 43 de unión al calcio (cah) (15) (16) y la proteína autotransportada de EHEC (ehaA) (23), que promueven la autoagregación celular, la adhesión a superficies y la formación de biofilms. Se considera que, bajo condiciones ambientales adecuadas, todos los microorganismos son capaces de vivir bajo la forma de biofilms o biopelículas, que se definen como comunidades de microorganismos embebidos en una matriz de exopolisacáridos y adheridos a una superficie inerte o un tejido vivo (24). Las bacterias que crecen dentro del biofilm tienen diferencias en la tasa de crecimiento y en la transcripción de genes con respecto a sus contrapartes planctónicas (24). Este estilo de vida contribuye a aumentar la supervivencia frente a condiciones adversas del entorno natural, procedimientos de desinfección y terapias con antibióticos (25) (26). La capacidad de STEC de formar biofilms en los alimentos y en diferentes superficies podría conducir a la contaminación cruzada por el desprendimiento de las células bacterianas, lo que constituye un riesgo para la salud (27) (28), razón por la cual resulta relevante el estudio de la formación de biofilms por parte de estos patógenos (29).
Dada la importancia de STEC para la salud pública y el riesgo de la formación de biofilms para su transmisión, el objetivo del presente trabajo fue detectar la presencia de genes que codifican factores de adherencia y determinar la capacidad de formación de biofilms en cepas de STEC aisladas de muestras clínicas humanas en la ciudad de Mar del Plata.
Se utilizaron 57 cepas de STEC aisladas entre los años 1996 y 2013 de pacientes con diarrea sanguinolenta (n=9), de casos de SUH (n=40) y de sus contactos asintomáticos convivientes (n=8), atendidos en la ciudad de Mar del Plata, Argentina. Las cepas provienen de la vigilancia microbiológica para este microorganismo que, a nivel local, realiza desde el año 1996 el laboratorio del Instituto Nacional de Epidemiología “Dr. Juan H. Jara” (INE)-Administración Nacional de Laboratorios e Institutos de Salud “Dr. Carlos G. Malbrán” de la ciudad de Mar del Plata. Las características de las cepas utilizadas en este estudio se muestran con más detalle en la Tabla I.
En el Laboratorio de Inmunoquímica y Biotecnología de la Facultad de Ciencias Veterinarias (UNCPBA, CIVETAN-CONICET, Tandil), las cepas fueron reactivadas en 5 mL de caldo LB durante 18 h a 37 °C. Se tomaron 10 μL de cultivo que fueron sometidos a ebullición en 500 μL de agua bidestilada para la extracción del ADN. Los siguientes genes que codifican para factores de adherencia y colonización -efa, iha, fimCD, ehaA, agn43, cah, lpfA1-3 y lpfA2-2- fueron detectados mediante la técnica de reacción en cadena de la polimerasa PCR (16) (18) (19) (21) (22) (23). Dichos genes formaron parte de un proyecto de investigación que se realizó en el Laboratorio y son algunos de los más utilizados en la caracterización de cepas de STEC. Los productos de PCR se visualizaron mediante electroforesis en gel de agarosa (2%), con tinción con bromuro de etidio.
La capacidad de formar biofilms se estimó mediante cultivo en microplacas de poliestireno de 96 pocillos (Corning, Thermo Fisher Scientific) utilizando la técnica de cristal violeta (CV) según Cáceres, et al. (30). Brevemente, se realizó una dilución 1:100 del cultivo overnight de cada cepa y una alícuota (10 μL) fue sembrada en pocillos que contenían 190 μL de LB.
Las placas se incubaron estáticamente durante 48 h a 37 °C con una intervención a las 24 h donde se retiraron los sobrenadantes de los pocillos y se reemplazaron por LB suplementado con glucosa al 0,5%. Los pocillos se tiñeron con 200 μL de CV al 0,1% durante 20 min. El colorante adherido a las biopelículas se eluyó con alcohol al 96% y se leyó la densidad óptica (DO570) en un lector de microplacas Labsystem Multiscan EX (I.C.T, S.L. Instrumentación Científica Técnica, S.L.).
Para cada cepa se utilizaron tres pocillos consecutivos y se previeron tres pocillos control sembrados con medio de cultivo estéril. Las DO se promediaron y se ajustaron (DOa) mediante una DO de corte (DOc) (suma del promedio de DO de los pocillos de control y tres veces su desviación estándar). De acuerdo con la DOa, las cepas se clasificaron en 4 categorías: no formadora de biofilm (NFB) (DOa < DOc); débil formadora de biofilm (DFB) (DOc ≤ DOa < 2DOc); moderada formadora de biofilm (MFB) (2DOc ≤ DOa < 4DOc) y fuerte formadora de biofilm (FFB) (DOa > 4DOc) según Gómez, et al. (31). Se realizó el análisis descriptivo de variables en estudio y de asociación de las mismas mediante el uso de los paquetes estadísticos informatizados EpiInfo™ 7.2 y EpiDat 3.1.
Caracterización genotípica de factores de adherencia
Entre los genes asociados a la adherencia y la formación de biofilms, el gen fimCD se presentó con mayor frecuencia (55/57; 96,5%), seguido por los genes iha y ehaA (52/57; 91,2% cada uno), efa1 (51/57; 89,5%) y lpfA1-3, lpfA2-2 y cah presentes en el 66,7% de las cepas (38/57). El gen agn43 fue el que se detectó en menor proporción (5/57; 8,8%) (Tabla I).
Todos los aislados de STEC O157:H7 recuperados de casos de SUH (n=32) fueron positivos para los genes efa1, iha, fimCD y ehaA. Los genes lpfA1-3 y lpfA2-2, sólo fueron detectados en 38/40 cepas O157:H7 y en un aislamiento O145:HNM. En las cepas STEC eae-negativas, ONT:NM y OR:H7 solo fueron detectados los genes iha, fimCD y cah (Tabla I). Se encontraron distintos perfiles de adherencia, entre los cuales el más frecuente fue efa1, iha, fimCD, ehaA, lpfA1-3, lpfA2-2, cah, presente en el 43,9% de las cepas, seguido de efa1, iha, fimCD, ehaA, lpfA1-3, lpfA2-2 presente en el 21,1% de las cepas de STEC analizadas (Fig. 1).
Se evidenció la capacidad de producción de biofilms en el total de las cepas estudiadas, y se obtuvieron valores de DO entre 0,209 y 3,251. Según la regla de clasificación utilizada, el 54,4% (31/57) de las cepas fue FFB, el 26,3% (15/57) MFB y el 19,3% (11/57) resultó DFB (Fig. 2). Ninguna cepa resultó clasificada como NFB. Los datos correspondientes a las DOa obtenidas para cada cepa se muestran en la Tabla I.
Cuando se agruparon las cepas en STEC 0157 y no-O157 y se relacionaron con la capacidad de formación de biofilms, no se evidenciaron diferencias estadísticamente significativas al comparar las distintas capacidades entre ambos subgrupos: FFB (p= 0,489),MFB (p= 0,261) y DFB (p= 0,704).
STEC se encuentra altamente asociado al SUH y a otras enfermedades; el serotipo O157:H7 es el más implicado en enfermedades, aunque en los últimos años se han aislado serotipos de STEC no-O157 de casos y brotes esporádicos de diarrea y SUH (32). La capacidad de STEC de formar biofilms en los alimentos o en diferentes superficies, podría conducir a la contaminación cruzada y a la transmisión del patógeno desde el medio ambiente hasta el ser humano provocando enfermedad. Por eso, este trabajo estuvo orientado a la caracterización genética de cepas STEC aisladas de casos clínicos de la ciudad de Mar del Plata y a la evaluación de su capacidad de formar biofilms.
El 96,5% de las cepas STEC eran portadoras del gen eae asociado a la producción de intimina y en la mayoría se detectó la presencia de uno o más de los genes codificantes de factores de adherencia y colonización: efa, iha, fimCD, ehaA, agn43, cah, lpfA1-3 y lpfA2-2. Estos genes codifican proteínas implicadas en la adherencia y la autoagregación celular necesarias para colonizar al hospedador y formar biofilms (33) (34).
Se observó que un gran porcentaje de cepas eae-positivas fueron también positivas para efa1 (89,5%), lo que coincide con otros estudios donde efa1 se ha detectado en cepas aisladas de bovinos, humanos y alimentos en su mayoría eae-positivas (23) (35) (36) y no así en cepas de STEC eae-negativas (33) (36). Por otro lado, iha se detectó en el 91,2% de las cepas, independientemente de la presencia o ausencia de eae. En varios trabajos previos, este gen se observó ampliamente distribuido entre diferentes patotipos de E. coli -STEC, enteropatogénica (EPEC) y uropatogénica (UPEC)- (18) (37) (38), entre distintos orígenes (bovinos, humanos o de alimentos) (35), e independientemente de los serogrupos (39) y de la presencia o ausencia de eae (40).
Los genes fimCD y ehaA fueron detectados en un gran porcentaje de las cepas (96,5 y 91,2%, respectivamente). Estos genes participan tanto en la adherencia a superficies (fimCD) como en la autoagregación celular necesaria para la formación de biofilms .ehaA) (21) (41). La fimbria larga polar (LP) se ha identificado primeramente en E. coli O157:H7 y está implicada en la interacción de la bacteria con las células eucariotas y la formación de microcolonias (42). Las variantes lpfA1-3 y lpfA2-2 utilizadas en este estudio, que fueron detectadas en diferentes cepas de E. coli eae-positivas, son específicas del linaje O157:H7 y no se han encontrado en otros serotipos de STEC, independientemente de la fuente de aislamiento o de su asociación con la enfermedad (33) (43). En concordancia con estos hallazgos, todas las cepas O157:H7 analizadas en este trabajo resultaron positivas para estos genes; sin embargo, llamativamente, una cepa O145:HNM también resultó positiva.
Las proteínas Antígeno 43 (Agn43) y Cah median la adherencia de las bacterias a líneas celulares, la autoagregación y la formación de biofilms en distintos materiales vivos e inertes, bajo distintos medios y formas de cultivo (34) (44) (45). En este estudio se detectó una mayor presencia de cah que de agn43, especialmente entre las cepas O157:H7 y O145:HNM, dos de los serotipos más asociados a enfermedad grave en seres humanos. La proteína Cah es homóloga al Agn43 por lo que cumplirían funciones parecidas; por su parte, el Agn43 se sintetiza durante casos de enfermedad humana, lo que sugiere que desempeña un papel importante en el desarrollo del SUH (15) (16). Si bien la sola presencia o ausencia de los genes no puede explicar la habilidad para producir biofilms o generar enfermedad (46), los genes de adherencia detectados en este estudio se asociarían al potencial virulento de estas cepas circulantes en la región, mientras que los genes detectados asociados a la formación de biofilms indicarían la capacidad de subsistencia de estos microorganismos en el medio ambiente.
Por otra parte, todas las cepas de STEC estudiadas fueron capaces de formar biofilms en las condiciones brindadas, y más del 50% de las mismas resultaron ser fuertes formadoras de biofilms, según la clasificación empleada. La distinta capacidad de formación de biofilms de STEC O157 y no-O157 no arrojó diferencias estadísticamente significativas entre ambos subgrupos. Otros autores han encontrado diferencias en la capacidad de formar biofilms según el origen, como el caso de lo descripto por Biscola, et al. (46), donde aislados provenientes de ganado, de alimentos o de agua resultaron mejores formadoras de biofilms que aquellos obtenidos de casos clínicos humanos. En otros casos se ha diferenciado por el serotipo o la presencia o ausencia de eae. Se observó que algunos serogrupos eae-negativos, como O113 y O91, exhibieron el mayor potencial de formación de biofilms frente a otros, incluido O157:H7 (27); y que serotipos eae-positivos como O111:NM y O145:NM, han demostrado menor capacidad formadora de biofilms en poliestireno (47). Esta diversidad y variabilidad de resultados sumados a los expuestos en este trabajo reafirman que esta capacidad de formar biofilms es fuertemente dependiente de la cepa y de las condiciones más que del serotipo o el perfil genético (48).
El propósito de este estudio fue aportar el conocimiento de las potenciales capacidades virulentas de cepas STEC como agentes etiológicos circulantes en la población de Mar del Plata, a través de la detección de genes que posibilitan la colonización del hospedador y la formación de biofilms. Se concluye que el potencial patogénico infectante de estas cepas, representado fundamentalmente por la capacidad de producción de la toxina Shiga, se vería acompañado por la presencia de genes codificantes de proteínas asociadas a la adherencia y colonización en el hospedador, como así también por la capacidad de subsistencia en el medio ambiente a través de la formación de biofilms. La preocupación por STEC como un problema de inocuidad alimentaria se ve agravada por la inexistencia de una inmunización o tratamiento de acción sobre las infecciones por este patotipo en los seres humanos. Por ello se considera muy importante continuar con los estudios relacionados a los mecanismos que subyacen la colonización y formación de biofilms y la realización de actividades educativas para la comunidad sobre los vehículos de transmisión y prevención de STEC.
Los autores agradecen a María R. Ortiz, del Laboratorio de Inmunoquímica y Biotecnología (UNCPBA, Tandil, Buenos Aires, Argentina) por su asistencia técnica.
Este trabajo fue financiado por PICT 2015/2666, PICT 2013/1749 y SECAT, UNCPBA.
Los autores declaran no tener conflictos de intereses respecto del presente trabajo.
Dra. MARÍA EMILIA CÁCERES
Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica (IMPaM)
Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas - Universidad de Buenos Aires
Correo electrónico: mariaemic.tandil@gmail.com
Dra. MARÍA EMILIA CÁCERES Instituto de Investigaciones en Microbiología y Parasitología Médica (IMPaM) Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas - Universidad de Buenos Aires Correo electrónico: mariaemic.tandil@gmail.com
