Visión general y perspectivas futuras del estudio de las variaciones epigenéticas

Overview and future perspectives of the study of epigenetic variations

Visão geral e perspectivas futuras do estudo das variações epigenéticas

Reconocimiento a la trayectoria del Prof. Dr. Juan Miguel Castagnino†

Para nosotros es un privilegio contribuir a esta publicación especial en homenaje al Dr. Juan Miguel Castagnino. Fue nuestro maestro, nuestro colega y amigo por más de 50 años. Nuestras carreras científicas y profesionales fueron tomando caminos divergentes con el correr de los años, pero no obstante ello, siempre nos mantuvimos en contacto.

Aprendimos con él y su equipo docente, “Análisis Biológicos”, pero no sólo eso, aprendimos la importancia de las relaciones profesionales con nuestros maestros, las instituciones científicas y académicas.

El Dr. Castagnino fue un luchador incansable, preocupado por el reconocimiento profesional de quienes egresamos de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales en esa especialidad. A esa actividad dedicó muchos años, realizando innumerables gestiones con autoridades y responsables políticos para lograr el reconocimiento.

Siguió el curso de nuestros avances científicos y profesionales y siempre se interesó por nuestras actividades y los resultados de nuestros trabajos. Con su mente inquieta, muchas veces nos solicitó que diésemos alguna charla, en distintas instituciones académicas, cuando consideraba que nuestra experiencia y conocimiento eran de utilidad e importancia en el campo de la Bioquímica Clínica.

Fue un ejemplo de trabajo y perseverancia durante muchos años. Infatigable. En constante búsqueda de novedades que pudiesen aportar nuevos temas de interés para el docente, para el profesional y para los pacientes.

Nos dejó un ejemplo que siempre nos guiará.

La epigenética es una rama de la biología molecular que estudia los cambios en la expresión génica, dependiente de eventos que modifican transitoriamente el patrimonio genómico individual. Interviene en la regulación de muchos procesos celulares como la inactivación del cromosoma X, la diferenciación celular y el silenciamiento de transposones en mamíferos (1) (2). Los mecanismos epigenéticos responsables de la regulación de la expresión génica son la metilación del ADN, la metilación y acetilación en las histonas y los ARN no codificantes (ncRNA). Es interesante notar cómo los fenómenos epigenéticos pueden activarse en respuesta a estímulos ambientales, nutricionales o cronológicos, como los ritmos circadianos y el envejecimiento. El papel crucial de los cambios epigenéticos en el control de la expresión génica se ha demostrado en varias enfermedades, como la aterosclerosis, el cáncer y los trastornos inflamatorios. Finalmente, los mecanismos epigenéticos también pueden provocar la aparición de enfermedades genéticas como el síndrome de Prader-Willi o el síndrome de Angelman (3) (4).

La epigenética permite adaptar la respuesta celular a eventos fisiológicos de forma dinámica y reversible, abriendo la posibilidad de identificar fármacos o tratamientos para modificarlos. Los procesos epigenéticos, en particular la modificación del ADN y las histonas, se llevan a cabo por un conjunto de enzimas que introducen las modificaciones epigenéticas, pero también existe otro conjunto de enzimas que las eliminan, dando a la célula la capacidad de modular la expresión génica en forma temporaria. Dado que los procesos epigenéticos son dinámicos y reversibles, representan una nueva perspectiva de targets terapéuticos en numerosas patologías.

El ADN y su complejo con las histonas (H2A, H2B, H3 y H4) forman la cromatina, que es la unidad básica fundamental para la transcripción o el silenciamiento de genes, la transducción de señales, la reparación y replicación del ADN. La cromatina puede sufrir un proceso de remodelación, pasando de un estado de condensación muy compacto (heterocromatina) a un estado de conformación abierta (eucromatina), lo que permite que factores de transcripción nuclear o proteínas accedan al ADN dando por resultado una alteración en la expresión génica (3). En mamíferos, las modificaciones en la cromatina, como la metilación del ADN y las modificaciones en las histonas, son eventos comunes en las células. La metilación del ADN es un proceso epigenético que transfiere de forma covalente un grupo metilo (-CH3) a las citosinas, principalmente en el sitio del dinucleótido CpG, lo que provoca la represión transcripcional. Por el contrario, la hipometilación del ADN se observa comúnmente en la región codificante de los genes y en las regiones de iniciación de la transcripción en los genes activos. Una situación similar se encuentra en la modificación de las histonas (siempre reversible) que también contribuye a la regulación génica (4).

La metilación del ADN es un sistema de represión transcripcional, conservado evolutivamente, presente en casi todos los organismos estudiados (5) (6).

La reacción de metilación (Fig. 1) está catalizada por ADN metiltransferasas (DNMT), enzimas que transfieren un grupo metilo de la S-adenosil-L-metionina (SAM) al C5 de un residuo de citosina, creando 5-metilcitosina (5mC).

La adición del grupo metilo a las citosinas dentro de los dinucleótidos CpG evita que los factores de transcripción o la maquinaria transcripcional reconozcan sus secuencias distintivas. De hecho, la mayoría de los factores de transcripción de mamíferos tienen elementos de reconocimiento de ADN que contienen motivos ricos en CpG. La metilación del ADN actúa como una obstrucción estérica que impide la unión de estos factores. Además, la adición de un grupo metilo también puede alterar la estabilidad o la posición del nucleosoma, excluyendo directamente el acceso de la maquinaria transcripcional (7). Dicha metilación puede alcanzar proteínas que poseen un dominio de unión al grupo metilo, “methyl binding domain” (MBD), las cuales están también involucradas en el silenciamiento de genes formando complejos que bloquean el acceso al ADN (8).

Fig. 1

La metilación del ADN. Las ADN metiltransferasas (DNMT) catalizan la transferencia del grupo metilode una molécula de S-adenosil-L-metionina (SAM) al C5 de una citosina generando un silenciamiento génico.

El nucleosoma es la unidad básica de la cromatina y consiste en ADN enrollado alrededor de un octámero de histonas (H2A, H2B, H3 y H4) (9). Las “colas” de las histonas sobresalen del núcleo del nucleosoma y están sujetas a diferentes modificaciones postraduccionales que incluyen la fosforilación de serina y treonina, la acetilación de lisina, la metilación de lisina y arginina, la sumoilación y ubiquitinación de lisina y la isomerización de prolina (10). Las modificaciones de histonas (Figura 2) se convirtieron así en un objetivo para una variedad de factores de remodelación y/o asociación de la cromatina, mejorando o restringiendo el acceso de las proteínas reguladoras al ADN (11).

Las histonas acetiltransferasas (HAT) y las histonas desacetilasas (HDAC) promueven la adición o eliminación, respectivamente, del grupo acetilo en los residuos lisina de las histonas. Las lisinas acetiladas son plataformas de unión a proteínas que contienen un dominio específico (bromodomain) presente en algunos factores de transcripción, así como en subunidades de complejos remodeladores de cromatina (12). En general, la acetilación de los residuos de lisina en las histonas conduce a la activación transcripcional (13). Por el contrario, la eliminación del grupo acetilo de las colas de las histonas está asociada con la condensación de la cromatina y su pasaje a heterocromatina, bloqueando la maquinaria transcripcional al impedir su acceso al ADN, lo que resulta en el silenciamiento de la transcripción.

Por otro lado, las histonas metiltransferasas (HMT) catalizan la transferencia del grupo metilo a los residuos de lisina o arginina en las histonas H3 y H4. El efecto de la metilación de histonas, dependiendo de los residuos que se modifican, podría resultar en la represión (la metilación de H3K9, H3K27 y H4K20) o activación (la metilación de H3K4, H3K36 y H3K79) de la transcripción (14).

Figura 2

Representación esquemática de la cromatina en sus dos estados, activa e inactiva. La interconversión es modulada por efectores epigenéticos, modificadores de la metilación del ADN y/o metilación o acetilación en las colas de las histonas.

Los ARN no codificantes (ncRNA) son los actores más recientemente identificados en el campo de la epigenética. Los ncRNA mejor caracterizados son los microRNA (miRNA). Son pequeños ncRNAs que actúan a nivel postranscripcional, modulando la expresión génica. Si bien no alteran la estructura de la cromatina, se consideran mediadores de los mecanismos epigenéticos de regulación, ya que permiten cambios en la expresión génica sin alteraciones en la secuencia del ADN. Los ncRNA largos son una clase adicional de ARN no codificantes que desempeñan un papel importante en la regulación de la transcripción, a través de su interacción con la cromatina o los factores asociados a la cromatina. Este tema no será desarrollado en este artículo y se refiere al lector a la bibliografía (15) (16).

La aterosclerosis es una enfermedad inflamatoria crónica que conduce a eventos cardiovasculares agudos. A pesar de los esfuerzos por caracterizar los mecanismos subyacentes y comprender su compleja patogenia sigue siendo un punto crucial para la prevención de las enfermedades cardiovasculares (ECV), que son la principal causa de mortalidad en todo el mundo. Durante la última década, una información abrumadora respalda la participación de procesos epigenéticos en el desarrollo, la progresión y la vulnerabilidad de la placa ateromatosa. Las evidencias publicadas destacan la aplicación potencial de los fármacos epigenéticos para el tratamiento de esta patología. Estudios recientes sugieren que la metilación del ADN y las modificaciones de las histonas (en particular, la metilación y la acetilación) también juegan un papel importante en el desarrollo de otras enfermedades cardiovasculares (17).

Se ha establecido que los estímulos patológicos y múltiples factores de riesgo contribuyen a la complejidad de la aterosclerosis. Estos factores incluyen los clásicos de riesgo cardiovascular (hiperlipidemia, hiperglucemia, hiperhomocisteinemia y estrés psicológico), alteraciones hemodinámicas y factores ambientales como el tabaquismo, la nutrición y la microbiota intestinal (18) (19) (20). Entre éstos, por ejemplo, fumar tiene un fuerte efecto sobre la metilación del ADN a escala genómica, incluso después de dejar de fumar (21) (22) (23). La metilación del ADN es catalizada por ADN metiltransferasas 1 (DNMT1), 3a (DNMT3a) y 3b (DNMT3b) y es contrarrestada por las metilcitosina dioxigenasas pertenecientes a la familia Translocación Diez-Once 2 (TET1, 2 y 3) (Figura 2). El papel de la metilación del ADN mediada por DNMT1 y DNMT3a en la patogénesis de la aterosclerosis ha sido ampliamente confirmado (24) (25) (26). Estudios in vitro sugieren que la metilación del ADN está regulada por vías de señalización activadas por el proceso inflamatorio. Por ejemplo, en las células endoteliales vasculares, el flujo sanguíneo laminar deteriorado y las lipoproteínas de baja densidad oxidadas (oxLDL) regulan las DNMT y HDAC, que luego reprimen la expresión de los factores de transcripción KLF4 y KLF2. El lipopolisacárido (LPS) induce la expresión del gen KDM6B en los macrófagos, que luego estimula la producción de varias citoquinas. Además, las HDAC tienen múltiples funciones en el control de la inflamación por los macrófagos. También intervienen controlando la regulación de la proliferación vascular de las células del músculo liso.

Experimentalmente, la exposición de las células endoteliales human umbilical vein endotelial cells (HUVEC) a estímulos proinflamatorios, como LDL oxidada (oxLDL), provoca un aumento de los niveles de la proteína DNMT1, que se asocia con la metilación del promotor del gen del factor 2 similar a Krüppel (KLF2) (27) (28) (29). Este gen pertenece a una familia de factores de transcripción antiinflamatorios, y su represión favorece la inflamación endotelial proaterogénica. El efecto de la oxLDL sobre la metilación de KLF2 podría revertirse mediante el tratamiento de las células endoteliales con 5-azacitidina (5-AZA), un análogo químico de la citosina que bloquea la actividad de las DNMT. Se ha demostrado que la alteración del flujo laminar puede modificar la metilación del ADN, dando lugar a un posible efecto proaterogénico. De hecho, al reproducir las alteraciones del flujo laminar sobre células endoteliales en cultivo, se observó un aumento en los niveles de DNMT1 y DNMT3A y, en consecuencia, la hipermetilación de su genoma (30) (31). En modelos murinos knockout para el receptor de LDL (Ldlr -/-), la administración intraperitoneal de 5-AZA redujo considerablemente el número de lesiones ateroscleróticas (33). Esto conlleva considerar a la vía de metilación del ADN como un blanco promisorio para la tratamiento de la aterosclerosis, al igual que se ha verificado el uso de agentes hipometilantes para el tratamiento de algunos tipos de leucemias (34) (35).

Con respecto a las proteínas que contrarrestan la metilación, un estudio reciente en ratones deficientes en apoliproteína E (ApoE-/-) demostró que la sobreexpresión de TET2 evita el desarrollo de la aterosclerosis (mientras el silenciamiento la favorece), mediante la modulación de la autofagocitosis dependiente de Beclin1 (36). Estos resultados sugieren que TET2 también podría considerarse un blanco interesante para el tratamiento de la aterosclerosis. Un segundo mecanismo epigenético importante está representado por modificaciones de histonas (metilación y acetilación), que se ven afectadas, entre otras cosas, por el tipo celular. La dimetilación de la histona H3 sobre la lisina 9 (H3K9me2) y la trimetilación sobre la lisina 27 (H3K27me3) son signos epigenéticos de silenciamiento que provocan la formación de heterocromatina. Por el contrario, la acetilación de la histona H4 sobre la lisina 16 (H4K16ac) y la trimetilación de la histona H3 sobre la lisina 4 (H3K4me3) favorecen la formación de eucromatina y activan la transcripción génica (32). El papel de las HATs y las HDACs, incluida la sirtuina, en la aterosclerosis, ha sido objeto de estudios recientes (33). Se propone que el gen EZH2, implicado en la patogenia de la mielodisplasia, también juega un papel importante en la aterosclerosis. De hecho, la sobreexpresión de este gen en ratones ApoE -/- favorece el desarrollo de la patología. El mecanismo estaría asociado a la promoción de la metilación del gen transportador ATP-binding cassette A1 (ABCA1) dependiente de DNMT1, que favorece la acumulación de colesterol en los macrófagos y la formación de células espumosas (34).

Fig. 3

(A) Estructura de la zona promotora TARDBP, representación esquemática del fragmento del promotor de TARDBP proveniente de un modelo animal murino: El análisis informático de la secuencia indica las “islas CpG” distribuidas dentro del promotor divididas en cuatro regiones distintas (CpG1, CpG2, CpG3 y CpG4). (B) Medición del nivel de TDP-43 en distintos tejidos a distintas edades. Se observa que los nivelesde proteína tienen un comportamiento diverso en los tres tejidos: no se observa variación entre 10 y 90 días en el hígado, hay una moderada disminución en el cerebro y una marcada disminución en el músculo. Esquema de los resultados del análisis de secuenciación con bisulfito, del promotor TARDBP que alberga 108 sitios CpG (representados en número en el eje x) en músculo esquelético, cerebro e hígado a los 10 (C) y 90 días (D). El porcentaje de metilación de cada uno de los 108 sitios CpG se muestra con picos de distinta tonalidad según el tejido. Los niveles de metilación del promotor TARDBP también muestran especificidad de tejido y etapa de desarrollo consistente con los niveles de proteína (35).

La enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno en el cual se encuentran elevados los niveles del péptido amiloide-β (Aβ) debido, entre otras razones, a la hipometilación específica de la región promotora del gen APP147. Además, los pacientes con EA presentan una disminución de los niveles cefalorraquídeos de folato y SAM. Concomitantemente se ha observado un estado de hipometilación en genes nucleares de las neuronas presentes en la neocorteza temporal (39) (40). Simultáneamente, la expresión del gen tau también se vio afectada por hipermetilación en el sitio de unión del activador transcripcional SP1 en la región promotora. Dicha alteración pudo observarse en pacientes con EA y otras “taupatías” relacionadas con la edad. Estos hallazgos fueron confirmados en autopsias de la corteza frontal y del hipocampo humano (41).

La enfermedad de Parkinson es una enfermedad progresiva del sistema nervioso que altera la coordinación del movimiento. Su diagnóstico histológico se caracteriza por la presencia de masas esféricas de a-sinucleína agregada, llamadas cuerpos de Lewy. Desde el punto de vista epigenético, el incremento en la expresión de dicha proteína surge de la hipometilación de la isla CpG 2 del promotor del gen que la codifica (SCNA). Por otro lado, variantes de duplicación o triplicación en este gen también resultan en la acumulación de la proteína, y posteriormente una mayor agregación y un fenotipo más severo (42).

Recientemente se ha observado en seres humanos, que variantes en DNMT1 causan una forma de neurodegeneración y neuropatía sensorial acompañada de demencia. Dichas variaciones inducen una reducción de la actividad de la metiltransferasa, que trae aparejada una hipometilación global del genoma (43). Estudios llevados a cabo en la última década, han aportado grandes cambios al panorama epigenético relacionado con el envejecimiento y los trastornos neurodegenerativos, de los cuales podrían surgir biomarcadores y blancos terapéuticos promisorios para el diagnóstico y tratamiento de estas enfermedades. El hecho de que los cambios involucrados sean reversibles, los constituye en objetivo tentador para la intervención terapéutica.

El rol de los mecanismos epigenéticos en enfermedades como ELA, degeneración lobular frontotemporal (DLFT), aterosclerosis y otras, sugiere la posibilidad de utilizar los fármacos epigenéticos, actualmente disponibles, para el tratamiento de estas enfermedades. Algunos de estos medicamentos epigenéticos ya se usan ampliamente en la terapia antineoplásica o en ensayos clínicos relacionados con el cáncer, como los inhibidores de HDAC, los compuestos activadores de las histone deacetylases (como el resveratrol), los inhibidores de la metilación del ADN (como la azacitidina y sus análogos de nucleósidos) y los inhibidores de la metilación de histonas (como los inhibidores de EZH2) (Tabla I). Es importante tener en cuenta para el uso de algunos de estos fármacos, la toxicidad que presentan a largo plazo, que conlleva evaluar cuidadosamente la posología en el caso de enfermedades crónicas.

El uso de un determinado fármaco depende de las modificaciones epigenéticas halladas en la patología. Por esta razón, la bioquímica clínica jugará un papel cada vez más importante en el análisis del epigenoma. Muchos laboratorios, equipados con técnicas avanzadas como la PCR y la secuenciación de ADN, se utilizan para hallar dichas modificaciones. Efectivamente el papel central de 5mC ha resultado en una serie de avances centrados en técnicas de perfilado de todo el genoma. Históricamente, los métodos utilizados fueron: a) El uso de enzimas de restricción MspI y HpaII que reconocen la secuencia CCGG, respectivamente pero HpaII no digiere los CCGG metilados. En consecuencia, según el estado de metilación del ADN, la digestión producirá diferentes fragmentos con cada enzima. b) El tratamiento del ADN genómico con bisulfito de sodio, que desamina las citosinas (C) no metiladas a uracilo (U), mientras que los residuos de C metilados no se ven afectados. Este tratamiento es seguido de la amplificación y secuenciación del área objetivo (44). c) A los pasos mencionados en el punto anterior, se unió la matriz de metilación. Esta técnica consiste en el tratamiento con bisulfito y amplificación por PCR, seguida de la hibridación del ADN en matrices que contienen sondas prediseñadas para distinguir entre C metiladas y no metiladas. Una variación más laboriosa de este análisis es cuando se aplica la secuenciación del genoma completo. Hoy también se cuenta con la capacidad para secuenciar el ADN y analizar el estado de metilación en su estado nativo sin ningún tratamiento enzimático o químico previo y sin necesidad de amplificación por PCR (45). Qué tecnología es la mejor para usar debe determinarse por el costo y el estudio específico en cuestión.

Tabla I
Fármacos modificadores epigenéticos en uso clinico o experimental

Abreviaturas: f, aprobado por la FDA; I, Ensayo clínico Fase I; II, Fase II; III, Fase III; IV, Fase IV; AML, leucemia mieloide aguda; MDS, síndromes mielodisplásicos;CMML, leucemia mielomonocítica crónica; CTCL, linfoma cutáneo de células T; CLL, leucemia linfocítica crónica; MLL, leucemia de linaje mixto.

Conflictos de intereses: Los autores declaran no tener conflictos de intereses respecto del presente trabajo.

Los autores agradecen profundamente a la Dra.Lubna Abou Assali por su contribución a la preparación y edición del manuscrito y al Dr. Marco Baralle por su ayuda en la preparación de las figuras.