Introducción

Las amebas de vida libre (AVL) son un grupo de protozoos anfizoicos con capacidad de provocar enfermedades en el ser humano que afectan al sistema nervioso central, la piel y/o la córnea (1) (2) (3). El ciclo de vida de estos protozoos está compuesto por dos estadios diferentes: los trofozoítos, formas tróficas y reproductivas, metabólicamente activas, que se alimentan, se mueven y multiplican, y los quistes o estadios de resistencia, capaces de permanecer viables durante años en el ambiente. Existen cuatro géneros de AVL potencialmente patogénicos para el ser humano: Acanthamoeba, Naegleria, Balamuthia y Sappinia y, si bien las patologías que producen son poco frecuentes, resultan graves y con elevada morbimortalidad. Acanthamoeba spp. se encuentra entre las AVL ambientales más prevalentes con distribución cosmopolita. Es agente etiológico de queratitis, encefalitis granulomatosa amebiana (EGA) e infecciones de la piel. La mayor parte de los casos humanos tienen en común el uso de agua con escasa calidad sanitaria (1) (2).

Desde la mitad del siglo XX se ha vinculado a las AVL con la transmisión y perpetuación en el ambiente de diferentes microorganismos potencialmente patógenos (4). Investigaciones recientes confirman la capacidad de Acanthamoeba spp. para actuar como vehículo de transmisión de microorganismos productores de diversas patologías de interés en salud pública (verdaderos vectores biológicos) (5) (6) (7). Acanthamoeba fagocita estos organismos presentes en el medio ambiente y algunos de ellos pueden escapar de sus sistemas líticos multiplicándose en su interior. Esta multiplicación puede provocar la lisis de los trofozoitos o bien la perpetuación y la permanencia en su interior, aún en los quistes. Los microorganismos que sobreviven a la fagocitosis, se denominan microorganismos resistentes a las amebas (MRA o ARM por sus siglas en inglés). Bacterias, hongos, protozoos y virus patógenos se han descripto como ARM (3) (5). Ambas condiciones, reservorio o capacidad endosimbiótica, resultan de vital importancia para la perpetuación de la cadena epidemiológica de muchas enfermedades infecciosas con impacto en la salud pública y han convertido a las AVL en verdaderos bioindicadores ambientales.

En la Argentina no existen publicaciones que hayan mencionado la presencia de Acanthamoeba spp., y otras AVL, en el ambiente hospitalario. Su detección podría ser de utilidad en el momento de investigar posibles reservorios de microorganismos patógenos de circulación intrahospitalaria. Su vigilancia y control podrían ser herramientas fundamentales para reducir el impacto negativo de las infecciones asociadas al cuidado de la salud. Por otro lado, el aislamiento de Acanthamoeba spp. y otras AVL dentro del ambiente hospitalario interpelarían el concepto de efectividad de las medidas de desinfección utilizadas dentro de los establecimientos de salud. La resistencia intrínseca a los desinfectantes que poseen estos protistas impulsaría acciones a encontrar nuevos agentes biocidas útiles y efectivos frente a estos verdaderos “caballos de Troya” biológicos (3) (6).

En este contexto el objetivo del presente estudio fue investigar la presencia de Acanthamoeba spp. y Naegleria spp., en salas cerradas de un hospital pediátrico de la provincia de Buenos Aires, Argentina, por su potencial rol como reservorios de endosimbiontes de importancia sanitaria.

Materiales y Métodos

La investigación se llevó a cabo en salas cerradas de un hospital de la provincia de Buenos Aires, Argentina. El estudio fue avalado por el Comité de Docencia e Investigación de la Institución.

Desde enero a octubre de 2021 se colectaron 22 muestras correspondientes a lavamanos utilizados por personal sanitario, y equipamientos con reservorios de agua (incubadoras con microclima y humidificadores respiratorios) en salas cerradas un hospital de la provincia de Buenos Aires. Un total de 16 muestras correspondieron a la sala de Neonatología (4 lavamanos y 12 incubadoras con sistema de microclima marca Atom y Medics) y 6 muestras a Terapia Intensiva (4 lavamanos y 2 incubadoras marca Funovert). Debido a la infraestructura y disponibilidad del lugar, el número de incubadoras en la sala de Neonatología fue mayor que el de la sala de Terapia Intensiva (12 vs. 2).

Las muestras de lavamanos fueron obtenidas mediante hisopados del interior de las canillas y sus respectivos desagües. En el caso de los equipamientos con reservorio de agua (incubadoras y humidificadores), se tomaron hisopados de las áreas de condensación del microclima (marca Medic) o los últimos 5-10 mL del reservorio de agua (marca Atom y Funovert).

Se incorporaron 2 mL de solución de Page (7) a cada tubo que contenía el hisopo remitido. A dichos tubos se los dejó en contacto durante 24 h luego de homogeneizar la muestra (vórtex), con el fin de que, si la muestra contenía AVL, se desprendieran del hisopo y pasaran a la solución. En el caso de las colecciones de agua, éstas se centrifugaron a 1500 r.p.m. durante 10 minutos y el sedimento se resuspendió en 2 mL de solución de Page. Estas muestras se conservaron a temperatura ambiente. A partir de estas soluciones, posteriormente se realizaron los cultivos.

Cultivos

Las muestras obtenidas por hisopado fueron sembradas en placas de Petri con agar no nutritivo (Britania) suplementado con Escherichia coli ATCC 25922 en solución de Page (7) e incubadas en estufas de cultivo a 37 °C y a 42 °C, para garantizar la recuperación de especies termófilas.

Las placas fueron monitoreadas durante 15 días. Para determinar la existencia de crecimiento parasitario, se realizaron observaciones con un microscopio óptico (entre cubre y portaobjetos) en 100 y 400 aumentos cada 24 horas. El cultivo fue considerado positivo cuando se observaron trofozoítos y/o quistes morfológicamente compatibles con AVL. Las placas con ausencia de crecimiento fueron consideradas negativas luego de 15 días de incubación.

En los cultivos positivos se estudiaron las características morfológicas y morfométricas de trofozoítos y quistes. Para esto, se colocaron 500 µL de solución de Page, se dejó 30 segundos en contacto y se tomó un volumen equivalente para realizar la observación microscópica de las estructuras. La identificación genérica se realizó según Page (7) y para identificar Naegleria sp., se procedió a la prueba de transformación ameboflagelar (8) (9).

La observación microscópica se realizó mediante un microscopio Leica DM500 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemania) con software Leica LAS EZ (v3.2.1) y las imágenes se registraron mediante una cámara Leica ICC50 HD (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Alemania).

Posteriormente se realizó la identificación molecular del total de los aislados.

Extracción de ADN e identificación molecular de Acanthamoeba spp. y Naegleria spp. utilizando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)

Se extrajo ADN genómico de las muestras positivas utilizando el kit de extracción Quick-gDNATM Mini- Prep de ZYMO Research- Epigenetics Company.

Las muestras fueron sometidas a una PCR con cebadores específicos (Invitrogen - Massachusetts, EE.UU.) para amplificar un fragmento del gen 18S rDNA. Para el género Acanthamoeba se utilizó el par de cebadores específicos JDP1 (5´-GGC CCA GAT CGT TTA CCG TGA A-3´) y JDP2 (5´-TCT CAC AAG CTG CTA GGG GAG TCA-3´).

Para el género Naegleria se usaron ITSTF (AACCTGCGTAGGGATCATTT) e ITSTR (TTTCCTCC CCT TATTAATAT).

Se realizó la mezcla de reacción con 2,5 µL de buffer (Promega), 0,5 μL de una mezcla de DNTP (10 mM de cada uno, Promega), 1,5 µL (20 µM) de cada cebador, 1,25 UTaq (Promega) y 5,0 µL de ADN. Se llevó a 25 µL de volumen final con agua libre de nucleasas (Biodynamics). Se utilizó un termociclador IVEMA T18 para la amplificación. Las condiciones de reacción fueron: 95 °C durante 7 min, 45 ciclos (95 °C durante 1 min, 60 °C durante 1 min, 72 °C durante 2 min), y una extensión final de 72 °C durante 10 min, siguiendo protocolos publicados por Schroeder et al. y Regoudis et al. (10) (11). Los productos de amplificación se visualizaron mediante electroforesis, utilizando una cuba ENDURO LabNet (LabNet International Inc., EE.UU.), en gel de agarosa (Biodynamics) al 1,5% durante 30 min y a 80 mA con tinción de bromuro de etidio durante 15 min. Por cada calle se cargaron 10 µL del producto de la amplificación. El tamaño de los amplicones se estimó por comparación con una escalera (ladder) de 100 pb (PB-L, Productos Bio-Lógicos, Argentina). El resultado de la electroforesis fue visualizado bajo luz UV con un transiluminador Maestro-Gen.

Resultados

Las observaciones microscópicas y el análisis morfológico y morfométrico de los cultivos (Fig. 1) y los resultados de la PCR (Fig. 2) permitieron detectar formas compatibles con AVL, tanto en las muestras correspondientes a Neonatología como a Terapia Intensiva del hospital. En ambos casos se observaron trofozoítos y quistes ornamentados y lisos, de pequeño tamaño (≤5 µm) compatibles con el género Acanthamoeba.

En la sala de Neonatología, el 50% (2/4) de los aislamientos correspondientes a lavamanos (canillas y desagües) y el 66,67% (8/12) de los correspondientes a las incubadoras, fueron confirmados molecularmente como Acanthamoeba spp., mientras que, en los aislados de la sala de Terapia Intensiva, se confirmó la presencia de Acanthamoeba spp. en el 50% (2/4) de los lavamanos y en el 100% (2/2) de las incubadoras (Tabla I).

Tabla I

Resultados de las muestras positivas

Respecto a Naegleria spp., tanto la ausencia de crecimiento en las muestras incubadas a 42 ºC como el resultado negativo de las pruebas de transformación ameboflagelar (de las muestras cultivadas a 37 °C) permitieron descartar la presencia de este género en las muestras estudiadas.

Figura 1

A. Quiste; B. Dos trofozoítos de Acanthamoeba sp. coloreados con May Grunwald-Giemsa (100X).

C: Trofozoíto y dos quistes; D: Quiste tetrahédrico de Acanthamoeba sp. sin colorear (40X).

Figura 2

PCR correspondiente a dos muestras: L: ladder; CP: control positivo; CN: control negativo; 1 y 2: dos muestras positivas.

Discusión y Conclusiones

La presente investigación constituye el primer estudio y aislamiento realizado en la Argentina de Acanthamoeba spp. en el ambiente hospitalario.

Coincidiendo con otros autores, los resultados evidenciaron la preocupante ubicuidad, versatilidad y adaptación de AVL al ambiente hospitalario (5) (12) (13) (14). Si bien las AVL se encuentran entre los protozoos ambientales más prevalentes y poseen una distribución cosmopolita, la principal preocupación para la salud pública reside en el hecho de que estos protistas han sido aislados en ambientes diversos relacionados con el sistema sanitario, tales como unidades de tratamiento odontológico, unidades de diálisis, duchas de emergencia y sistemas de refrigeración y aire acondicionado de distintos establecimientos de salud, polvo hospitalario y muestras clínicas (14) (15).

En lo referente al presente estudio, el 63,64% (14/22) de los hisopados de lavamanos e incubadoras muestreados, de las salas de Neonatología y Terapia Intensiva del hospital resultaron positivos para Acanthamoeba spp. Si bien existe escasa información acerca del nivel de riesgo para la salud humana y sus asociaciones en el ambiente hospitalario, el aislamiento del protozoario en lavamanos e incubadoras de las Salas Neonatología y Terapia Intensiva del hospital representa una señal de alarma, no solo por el poder patógeno de Acanthamoeba spp. frente a pacientes de alto riesgo, sino además por la capacidad del protista de actuar como reservorio de microorganismos de circulación intrahospitalaria (6) (14). Las bacterias, hongos y virus de circulación intrahospitalaria incluyen una diversidad de microorganismos potencialmente patógenos que conducen a enfermedades infecciosas dentro del ambiente hospitalario, razón por la cual resulta fundamental realizar la vigilancia epidemiológica. En este sentido, diversos autores señalaron la preocupante relación entre Acanthamoeba spp. y bacterias asociadas a infecciones intranosocomiales (12) (15). La presencia de Acanthamoeba spp. en el ambiente hospitalario y su capacidad de actuar como “caballo de Troya” de bacterias multirresistentes y formadoras de biofilms, amplificaría la diseminación de las mismas generando infecciones intrahospitalarias severas (3) (6) (11). Al respecto, De Souza et al. (13) y Huws et al. (15) demostraron mediante cocultivos la interacción endosimbiótica entre cepas de Acanthamoeba y Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA). La endosimbiosis favoreció el enquistamiento del protozoario y la virulencia y diseminación de MRSA (11). También dificultarían el control de las queratitis y otras patologías endosimbiontes del género Fusarium (15).

Por la naturaleza oportunista de Acanthamoeba y su papel como reservorio de patógenos humanos, resulta fundamental que los diferentes comités de infecciones hospitalarias dirijan sus esfuerzos para monitorear la presencia de estos protistas en hospitales y centros de salud, implementando medidas de higiene y desinfección eficientes, ya que son fáciles de eliminar con alcohol etílico en 5 min, con lavandina (60 p.p.m. de cloro), etc. (3) (13). Otros métodos han sido evaluados, como el uso de ozono, rayos ultravioleta, radiación solar, etc., con lo cual la elección de éstos va a depender de la relación costo-beneficio y de no exponer a la población a un riesgo mayor (3) (14).

La detección de Acanthamoeba spp. en salas cerradas del hospital constituye el primer paso para explicar la posible transmisibilidad y la endemicidad intrahospitalaria de diversos microorganismos. En este sentido, los resultados obtenidos en el presente estudio proporcionan una herramienta fundamental para la vigilancia epidemiológica y el control sanitario y contribuyen significativamente a la implementación de estrategias de control en la institución.

Correspondencia

Dr. SIXTO RAÚL COSTAMAGNA

Lezica 4476, piso 5, departamento 20.

1202 CIUDAD AUTÓNOMA DE BUENOS AIRES, Argentina

Correo electrónico: rcostama2001@yahoo.com.ar

Agradecimientos

Los autores agradecen la colaboración en la toma de muestras de los médicos: Alicia Rodríguez (Neonatología) y Paula Medici y Pablo Vattimo (Unidad de Terapia Intensiva) del hospital.

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Notas de autor

rcostama2001@yahoo.com.ar

Información adicional

Conflictos de intereses: Los autores declaran no tener conflictos de intereses respecto del presente trabajo.