Actualización en marcadores inmunológicos en el estudio de la infección por HIV: aportes desde el laboratorio clínico

Immunological markers in the study of HIV infection: contributions from the clinical laboratory. An update

Atualização em marcadores imunológicos no estudo da infecção pelo HIV: contribuições do laboratório clínico

La respuesta mundial a la pandemia del virus de la inmunodeficiencia humana (HIV) sufrió un drástico retroceso en los últimos dos años, a raíz de las consecuencias en el sistema sanitario producto de otra pandemia, conocida como COVID-19 o enfermedad por coronavirus, causada por el virus SARS-CoV-2. Según las estadísticas del último informe de ONUSIDA (1), si bien el número de nuevas infecciones de HIV continúa en descenso, en 2021 se documentó la reducción anual más baja registrada desde 2016. Lo mismo sucedió con el número de nuevas personas que accedieron al tratamiento antirretroviral (TARV), número significativamente menor al de los años anteriores, que resultó ser el menor avance desde 2009.

Actualmente, se estima que un promedio de 38 millones de personas vive con HIV en el mundo, de las cuales 1,7 millones son menores de 15 años. Respecto al acceso a la medicación, 28 millones de personas reciben TARV (2). En 2021, aproximadamente 650 mil personas fallecieron por causas relacionadas a la infección por HIV. Las mismas son muertes prevenibles en un contexto de tratamientos eficaces y herramientas diagnósticas adecuadas (1) (2). Respecto a los datos regionales, el número estimado de personas que viven con HIV en Latinoamérica era de 3,7 millones en 2019, con una cobertura de TARV del 60% (3). En la Argentina, según el boletín epidemiológico N° 38 del Ministerio de Salud (4), en el año 2020 se encontraron alrededor de 140 mil personas que vivían con HIV y 65 mil habían recibido tratamiento desde el sistema público.

Estos datos marcan el impacto de la pandemia de HIV y la necesidad de afianzar los compromisos por parte de los gobiernos para saldar las brechas de desigualdad y favorecer la prevención de la infección. De este desafío también formamos parte los y las profesionales de la salud, con roles fundamentales, no sólo desde la asistencia sino también desde la docencia, brindando información de calidad a la población general. En el marco actual tan complejo para el área de la salud, es fundamental implementar nuevas estrategias para el diagnóstico y seguimiento de la infección por HIV. Es por este motivo que se plantea la realización de la presente revisión bibliográfica, cuyos objetivos son realizar una breve reseña de los métodos tradicionales para el diagnóstico y seguimiento de HIV y describir nuevas herramientas adicionales, propuestas como posibles biomarcadores diagnósticos y pronósticos de la infección por HIV y patologías asociadas. De esta forma, se plantea ampliar el estudio del perfil inmunológico de las personas que viven con dicho virus.

El laboratorio clínico tiene el rol principal en el diagnóstico y seguimiento de la infección por HIV. Existen distintas técnicas en uso, según las guías y recomendaciones de cada país, si bien a nivel global responden a la misma línea.

Actualmente existen diversos ensayos recomendados para el diagnóstico de la infección por HIV (5). Suelen clasificarse en ensayos de tamizaje y suplementarios o confirmatorios. La muestra utilizada es plasma o suero, si bien algunos pueden utilizar sangre entera o saliva. Se detectan anticuerpos específicos contra HIV o material viral.

Respecto a los métodos considerados de tamizaje, se encuentran, por un lado, los conocidos como enzimoinmunoensayos (EIE) de tercera y cuarta generación, los cuales han permitido una considerable reducción del período ventana con altos niveles de especificidad y sensibilidad. En el caso de los primeros, esto pudo lograrse al extender la detección de inmunoglobulinas (Igs) a los isotipos IgA e IgM (además de los clásicos IgG) y, en los últimos, por incluir, además, la detección del antígeno viral p24. Otro método es el de aglutinación de partículas por gelatina, el cual permite la detección de anticuerpos de tipo IgM e IgG. Los métodos conocidos como de testeo rápido también están ampliamente difundidos, por su versatilidad y posibilidad de tener un resultado en pocos minutos. Son técnicas basadas en métodos inmunocromatográficos o de inmunofiltración. Los de segunda y tercera generación permiten la detección de anticuerpos de tipo IgG o totales, mientras que los de cuarta generación suman la detección del antígeno p24.

Los ensayos suplementarios confirmatorios son EIE en fase sólida, dentro de los que se encuentran el Western blot y el LIA (ensayos lineales). Se diferencian entre ellos en la matriz antigénica utilizada. Mientras que para el Western blot se utiliza un lisado viral, en el LIA se utilizan péptidos sintéticos y proteínas recombinantes. Ambos detectan anticuerpos de tipo IgG.

La medición de la carga viral de HIV, si bien era utilizada como un método principalmente de seguimiento, actualmente se ha convertido, además, en un método suplementario/confirmatorio, desplazando al Western blot en algunos algoritmos diagnósticos (6). Los métodos se basan en plataformas de biología molecular cuantitativa con sondas tradicionales, PCR en tiempo real, e incluso métodos de amplificación isotérmica con tecnología NASBA (amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos).

Otros métodos de biología molecular que también se recomiendan (7), en especial antes del inicio del TARV, son el ensayo de resistencia o genotipificación y el estudio de HLA-B*5701 (hipersensibilidad a abacavir).

Por último, dentro del seguimiento también se incluye el recuento de linfocitos T CD4+ (LT CD4+). El método utilizado es la citometría de flujo, con plataformas que permiten el recuento absoluto, tanto de los linfocitos totales (CD3+) como de las poblaciones CD4+ y CD8+.

La correcta adherencia al TARV favorece la restitución del pool de células LT CD4+ y el descenso de la carga viral hasta valores indetectables; incluso, luego de los 6 meses de mantenida esta condición, la transmisión del virus por vía sexual es nula (36). Si bien se trata de un importantísimo avance en el tratamiento, aún no se estudia desde la práctica bioquímica diaria el estado inmunológico de las personas de forma más detallada. El concepto de “reconstitución inmune” viene desarrollándose desde hace décadas, con el fin de abordar este punto.

Los linfocitos T atraviesan distintos estados desde su generación, proceso conocido como ontogenia. A grandes rasgos, desde los precursores de médula ósea, los linfocitos van atravesando distintos estadios, donde en el timo finalmente logran diferenciarse en linfocitos CD4+ o CD8+ (inclusive dobles positivos o negativos para ambos marcadores, aunque estas poblaciones están en menor porcentaje en sangre periférica). Una vez en circulación, dependiendo de la exposición a diferentes antígenos, los linfocitos se van adecuando para ganar especificidad y mayor eficacia frente a los mismos, concepto que define a la inmunidad adaptativa y que se conoce como la memoria inmunológica. Los linfocitos B productores de anticuerpos, también atraviesan procesos similares, como ocurre con otras células del sistema inmune. Así, pueden definirse distintas subpoblaciones de LT CD4+ y LT CD8+. Por un lado, se encuentran las células naive, aquellas que no han tenido una exposición antigénica previa, y las células de memoria, las cuales se diferenciaron luego de la activación producto de la exposición antigénica. Durante la vida de un individuo, la exposición a distintos antígenos permite la diferenciación de los linfocitos y así el envejecimiento del sistema inmune. Es fisiológicamente esperable encontrar una mayor cantidad de linfocitos naive en la infancia, los cuales se irán desarrollando a linfocitos de memoria a medida que la persona se desarrolla a la vida adulta (25).

Existen distintas moléculas de membrana por cuyo rol en la ontogenia de los linfocitos son utilizadas como marcadores de subpoblaciones celulares (37) (38) (39). A partir del estudio exhaustivo de dichos marcadores, se ha comprobado un desarrollo continuo de las células durante su diferenciación, dando lugar a un gran número de subpoblaciones celulares con distinto rol en la inmunidad. La determinación de los marcadores define el fenotipo celular; la citometría de flujo es una herramienta clave para este proceso. Debe entenderse que la expresión de los marcadores en la membrana de los linfocitos no es de “a todo o nada”, sino que es un proceso continuo donde la expresión de los marcadores va ganando o perdiendo su intensidad hasta máximos o mínimos indetectables. En la Figura 2 se grafican algunos de los marcadores propuestos para definir las distintas subpoblaciones celulares.

Lo anteriormente expuesto permite entender el concepto de “reconstitución inmune” en la infección por HIV donde, si bien la buena adherencia al TARV permite controlar la carga viral y los niveles de LT CD4+, actualmente no forma parte del seguimiento el estudio de las subpoblaciones naive y memoria tanto de los LT CD4+ como LT CD8+. Dado que el TARV no logra la cura de la infección, ya que no erradica el virus del organismo, la activación crónica del sistema inmune genera la diferenciación de las subpoblaciones de linfocitos, ya sea por antígenos del HIV como los correspondientes a infecciones oportunistas o, principalmente, por la translocación de antígenos bacterianos, como se mencionó en apartados anteriores. Por lo tanto, si bien frente a la correcta adherencia al TARV el número de LT CD4+ totales se recupera, actualmente se intenta evaluar si en la distribución de las subpoblaciones celulares luego del tratamiento se condiciona respecto a la distribución fisiológica acorde con la edad de las personas, concepto que comprende la idea de “reconstitución inmune” en la infección por HIV. Esto sería clave en población pediátrica, especialmente en personas que adquirieron la infección por transmisión vertical, donde el sistema inmune se desarrolló en presencia del HIV (40). En la Argentina, en el Hospital General de Niños “Pedro de Elizalde”, se vienen desarrollando extensas líneas de investigación en esta temática. Uno de los trabajos publicados por este grupo de investigación estudió la relación entre el nivel de adherencia al TARV y las subpoblaciones de LT CD4+ y CD8+ (41). Luego de un seguimiento promedio de nueve meses, los niños con HIV con buena adherencia al TARV lograron un aumento significativo de los LT CD4+ totales y de la subpoblación naive de los mismos, con un descenso de la subpoblación de memoria central. A pesar de ello, los valores no alcanzaron los observados en un grupo de niños sin patología inmune o infecciosa. Esto podría deberse al período de seguimiento, ya que se ha observado que niños que viven con HIV con respuesta virológica podrían alcanzar valores fisiológicos luego de 2 años de TARV (40). En base a estos resultados, se estudió si el incremento de la subpoblación de LT CD4+ naive se debía a células recién emigradas del timo (RET), dado que en la población pediátrica la timopoyesis es más eficaz. Se ha descripto que el compartimento de linfocitos naive comprende un variado espectro de células con distinto nivel de diferenciación y, dada la involución del timo con la edad, la población de células naive difiere en la expresión de marcadores de membrana en adultos y niños (42). Uno de los marcadores de células naive RET es el CD31, también denominado PECAM-1 o glicoproteína IIA, cuya función es mediar la adhesión endotelial de los linfocitos (42) (43). Al utilizarlo junto con marcadores de células naive como CD45RA (isoforma de CD45, marcador panleucocitario) (44) o CD28 (receptor co-activador de los linfocitos T) (45), ayuda a definir la subpoblación de LT CD4+ naive RTE, ya que además correlaciona con la expresión de los fragmentos circulares de escisión de receptor de linfocitos T (TREC) (46). Continuando con el estudio de la cohorte de niños que viven con HIV en la Argentina, se observó un mayor número de LT CD4+ RET en niños con buena adherencia al TARV, respecto a aquellos con mala adherencia, aunque estos valores no alcanzaron el nivel del grupo control, incluso luego de un año de seguimiento. Cabe destacar que del grupo de niños con mala adherencia, aquellos que lograron mejorar la adherencia al tratamiento incrementaron significativamente el número de LT CD4+ RET. Esto demostraría la importancia de la adherencia al tratamiento en la reconstitución inmune luego del TARV, donde la timopoyesis en los niños no se ve interrumpida a pesar de la inflamación crónica producto del HIV (47). La línea de investigación también incluyó el estudio de las subpoblaciones linfocitarias de memoria, definidas por la expresión del ya citado receptor CD28 y de CD95 (receptor involucrado en la apoptosis celular, conocido como Fas) (48). En niños con correcta adherencia al TARV, las subpoblaciones de células de memoria central (CD28+CD95+) tanto para LT CD4+ y CD8+ son significativamente menores que en niños con mala adherencia, como así también la subpoblación de memoria, pero sólo en el caso de los LT CD8+. Más aún, dado el rol de los LT CD8+ citotóxicos frente a las infecciones virales como HIV, se estudió el marcador de senescencia inmunológica CD57 (glicoproteína que media adhesión celular) (49) (50). Se observó una correlación positiva entre los LT CD8+ de memoria efectora y los LT CD8+ senescentes. En resumen de la investigación, la adherencia al TARV estaría asociada a un aumento de los LT CD4+ a expensas de las células naive, puntualmente la subpoblación RET, posiblemente debido a una timopoyesis eficaz en los niños, a pesar del desarrollo del sistema inmune en presencia del HIV. Además, la activación crónica del sistema inmune podría generar la diferenciación de LT CD8+ a células de memoria efectora senescentes, particularmente cuando la adherencia al TARV no es la correcta, cuyo fenotipo de envejecimiento celular podría favorecer el desarrollo de patologías asociadas a la infección por HIV (51).

Por todo lo expuesto, el CD31 podría ser un marcador útil para evaluar la reconstitución inmune en personas que viven con HIV y que reciben TARV, particularmente en niños, donde la muestra puede ser escasa para realizar estudios más específicos de biología molecular (TREC), dado que la técnica de citometría de flujo es mucho más accesible y factible de estandarización (52). Incluso, se ha propuesto su uso no sólo en la infección por HIV sino también para evaluar la reconstitución inmune luego del trasplante de células hematopoyéticas, la respuesta a vacunas (42) (52) o en estados nutricionales, particularmente junto con otro marcador de linfocitos RET, la proteintirosin quinasa 7 (PTK7) (42) (53). Por último, cabe destacar que CD31 también ha sido utilizado para evaluar la reconstitución inmune en adultos que viven con HIV, si bien las células naive CD31- son más frecuentes en estos individuos (54).

La proteína PD-1 (proteína de muerte celular programada), correceptor inhibitorio definido como checkpoint inmunológico, es otro biomarcador propuesto para la evaluación del perfil inmunológico de las personas que viven con HIV, particularmente frente al contexto de activación crónica y al agotamiento de la respuesta inmune. Como se mencionó en párrafos anteriores, la inflamación crónica está relacionada a la senescencia o envejecimiento del sistema inmune (55) (56). Sin embargo, no fueron los marcadores de senescencia, sino los marcadores de agotamiento inmunológico como PD-1, los que fueron estudiados en otras patologías como diversos tipos de cáncer, donde han sido blancos moleculares para terapia. Se ha propuesto que PD-1 podría ser útil como biomarcador de agotamiento en la infección por HIV, como así también para el seguimiento de la terapia con bloqueantes de dicha molécula (57). La expresión de PD-1 en LT CD4+ podría asociarse a una parte del reservorio viral de HIV y predecir una respuesta inmunológica pobre al TARV (58). Incluso, en un estudio realizado en la Argentina, se observó una correlación entre la expresión de PD-1 en los LT CD8+ y el biomarcador propuesto en plasma, IP-10 (59). De todas formas, no está claro el impacto de los bloqueantes de PD-1 sobre el reservorio viral de HIV y el beneficio de sumar los mismos al TARV (60) (61).

La implementación del TARV ha mejorado sustancialmente la vida de las personas que viven con HIV ya que reduce la morbilidad y la mortalidad asociadas al mismo. Los métodos estandarizados para el diagnóstico y seguimiento de la infección por HIV se centran en el punto de vista virológico, dejando de lado un estudio exhaustivo del perfil inmunológico de los individuos. Un análisis que incluya biomarcadores inmunes solubles asociados a la inflamación sistémica, como biomarcadores de membrana celular que permitan describir las subpoblaciones de linfocitos, podría resultar de utilidad para predecir patologías asociadas al HIV o evaluar la reconstitución inmune luego del TARV. Probablemente no sea suficiente la evaluación de un único biomarcador, sino una combinación de varios, lo que podría tener un impacto clínico beneficioso en las personas que viven con HIV.

Dra. ALEJANDRA URIOSTE

Correos electrónicos: aurioste@som.umaryland.edu; uriostealejandra@gmail.com

El presente trabajo fue realizado sin haberse recibido una financiación específica.

Conflictos de intereses: La autora declara no tener conflictos de intereses respecto del presente trabajo.

La autora agradece, tanto a las personas que viven con HIV como a sus familiares, quienes permitieron realizar las investigaciones gracias a su invaluable aporte. Un muy especial agradecimiento a quienes fueron sus mentores en la Inmunología, los doctores Eduardo Gaddi y Jorge Geffner. También agradece al Prof. Sergio Mazzini por revisar la traducción del resumen al inglés, a la Dra. María Cruz Mollo y al médico Bruno Pereira da Silva, por revisar la traducción del resumen en portugués.