La secuencia aminoacídica del CIGB-370 se extiende desde la serina 230 (S ₂₃₀) a la valina 487 (V ₄₈₇) del dominio carboxilo terminal de la metaloproteasa serralisina p50 (PRZN-SERMA, EC 3.4.24.20, de 50 kDa) de la bacteria Serratia marcescens según la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica de Estados Unidos de América (EE.UU.). En esa base de datos también se realizó el estudio de similitud estructural con proteínas no redundantes endógenas humanas y de animales de experimentación con los programas: BLAST (siglas en inglés de herramientas de investigación de alineamiento local básico) y CD-search (siglas en inglés de investigación de dominios conservados) donde se consideraron los parámetros predeterminados (16). La identificación de epítopos lineales de células B y epítopos de células T se realizó mediante la Base de Datos de Epítopos Inmunes (17), con las herramientas de predicción de antígenos de Kolaskar & Tongaonkar, de accesibilidad de superficie de Emini y de eliminación de la inmunogenicidad (Deimmunization). En esta última herramienta se predice la eliminación de epítopos de células T mediante reingeniería de proteínas terapéuticas. En las dos primeras herramientas de predicción para epítopos lineales de células B se consideró el valor umbral de corte predeterminado igual a 1,000. El estudio combinado de los epítopos lineales y conformacionales de células B del CIGB-370 se realizó en el programa Ellipro (18) a partir de su estructura tridimensional predicha en el programa SWISS MODEL (19) que usó como molde la estructura tridimensional más actual de la proteína serralisina p50 (20). A través del programa Algpred 2.0 se hizo la predicción de proteínas alergénicas a través de una aproximación híbrida de tres métodos: el algoritmo de aprendizaje de máquina, la identificación emergente y con clases de motivos en secuencias biológicas y la investigación basada en BLAST y el reconocimiento de epítopos IgE (21).

Reactivos

Muestras de plasma de donantes de sangre y de pacientes con cáncer

Las muestras de plasma en citrato fosfato dextrosa de ocho donantes del banco de sangre del Hemocentro de CIMEQ (La Habana, Cuba) se unieron en partes iguales, se mezclaron y se filtraron por papel de filtro (Whatman 3M, EE.UU.) y fueron los controles negativos (CN) de anticuerpos anti-CIGB-370. Se recogieron muestras de sangre venosa con un tubo Vacutainer con ácido etilendiamintetracético (BD Vacutainer, Plymouth, Reino Unido) en diferentes tiempos: antes del tratamiento, y a las 2, 3, 4, 5 y 8 semanas de 18 pacientes enfermos de cáncer que participaron en el ensayo clínico dosis-respuesta multicéntrico fase I de tratamiento con el candidato terapéutico CIGB-370 desde 2016 hasta 2017. Esos pacientes recibieron una infusión de tres dosis de CIGB-370: 1,85 mg/mm²; 3,7 mg/mm² y 6,1 mg/mm² endovenoso durante una hora, dos veces a la semana durante cuatro semanas. Se tuvieron en cuenta los principios enunciados en la Declaración de Helsinki para la evaluación de seres humanos como sujetos de investigación y la aprobación por los Comités de Ética de las instituciones participantes (22). Los procedimientos realizados fueron posteriores a la obtención del consentimiento informado de los pacientes y se preservó debidamente la privacidad de ellos. Todas las muestras se alicuotaron y se conservaron a -20 ºC. Se usaron con 4 ciclos de congelación y descongelación como máximo. Después de cada descongelación las muestras fueron homogeneizadas y centrifugadas a 4000 x g durante 10 min antes de usar en el inmunoensayo.

Los antígenos serralisina p50 (14), el CIGB-370 (23), las proteínas contaminantes de la cepa W3110 de Escherichia coli y los anticuerpos policlonales antiserralisina p50 en conejo fueron suministrados por el departamento de Desarrollo (CIGB de La Habana, Cuba). Brevemente, el CIGB-370 se obtuvo como ingrediente farmacéutico activo (CIGB-370i) a partir de la solubilización de los cuerpos de inclusión en el citoplasma de las células hospedadoras, su renaturalización con detergentes y calcio y la ulterior purificación por cromatografías de intercambio aniónico y catiónico (24). Ese CIGB-370i se obtuvo con una pureza de 96% en electroforesis en gel de poliacrilamida. Al CIGB-370i se le añadieron algunos aditivos (un hidrato de carbono simple y un aminoácido) para la liofilización en su formulación final y se conservó a 4 °C. Para la realización de este trabajo el CIGB-370 liofilizado se reconstituyó en agua destilada para una concentración de 1 mg/mL (CIGB-370f). El excipiente, formado por el tampón y los aditivos empleados en la liofilización de la formulación final sin CIGB-370, se reconstituyó en igual volumen que el CIGB-370f. Las proteínas contaminantes del hospedador (Escherichia coli cepa W3110) se obtuvieron a partir de bacterias transformadas con el plásmido que no contenía el gen que codifica para la BTP: pTrcHisA (CIGB, La Habana, Cuba) y se purificaron de manera similar al CIGB-370i, pero sin realizar los pasos cromatográficos de intercambios iónicos. La serralisina p50 fue utilizada para la obtención del control positivo de anticuerpos policlonales antiserralisina p50 en conejo (CP) mediante la inmunización con adyuvante completo e incompleto de Freund (Sigma, St Louis, EE.UU.) (25). La purificación de los anticuerpos del suero de uno de los conejos mediante cromatografía de afinidad con proteína A presentó una pureza de 97,5% en electroforesis de gel de poliacrilamida y dodecil sulfato de sodio (26). Se cumplieron los principios éticos universales para la experimentación en animales de laboratorio y se contó con la aprobación del protocolo de investigación por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Experimentación del CIGB (27). Todos los reactivos anteriores se alicuotaron para evitar los ciclos de congelación- descongelación y se conservaron a -45 °C.

El EIA de pesquisaje fue indirecto, heterogéneo y no competitivo. Brevemente, las placas de microtitulación de 96 pozos de fondo plano PolySorp y MaxiSorp (Nunc, Thermo Scientific, Nueva York, EE.UU.) se recubrieron con 10 µg (100 µL/pozo) del polipéptido recombinante CIGB-370i y CIGB-370f diluido en el tampón fosfato salino (TFS) 0,15 M pH 7,2 y se incubaron por 16 h a 4 ºC. Después se les realizaron tres lavados con una solución de Tween-20 al 0,05% (v/v). Posteriormente, a las placas se les aplicaron 200 µL/pozo del tampón de bloqueo de TFS con leche descremada (Pronadisa, Madrid, España) 3% (m/v), Tween-20 0,05% (v/v) durante 1 h a 37 ºC y se lavaron cuatro veces con la solución de lavado. El CP se añadió a diferentes concentraciones diluido en el tampón de bloqueo y en la mezcla de plasma de donantes de sangre al 2,5% (v/v) concentración final. Las muestras de los pacientes, de los donantes de sangre y el CN se diluyeron 1/40, que es la mínima dilución que requiere el plasma para disminuir su interferencia. Al final se aplicaron 100 μL/pozo por duplicado de esas muestras a la placa de microtitulación. Las placas se incubaron durante 1 h a 37 ºC y posteriormente se lavaron cuatro veces con la solución de lavado. A continuación se añadieron 100 µL/pozo de la solución de proteína A conjugada con peroxidasa (CIGB de Sancti Spiritus, Cuba) diluida 1/64 000 en el tampón de bloqueo y las placas se incubaron 1 h a 37 ºC. Después de lavar las placas cuatro veces con la solución de lavado, la reacción enzimática fue desarrollada con 1,2 mg de tetrametilbencidina (Sigma-Aldrich, Saint Louis, EE.UU.) disuelta en 100 µL de dimetilsulfóxido, que se añadió a 12 mL de tampón citrato fosfato 0,29 M pH 5,5 y 12 μL de peróxido de hidrógeno al 30% v/v (Sigma-Aldrich, Saint Louis, EE.UU.) y se aplicaron 100 µL por pozo. A los 10 minutos de esa reacción en la placa de microtitulación protegida de la luz, se aplicaron 50 µL de ácido sulfúrico 2 M para detener la reacción. Finalmente, se leyó la absorbancia a 450 nm en el lector de placas de microtitulación SUMA PR0621 (TecnoSuma SA, La Habana, Cuba). Se calculó la razón de absorbancias del CP/CN y las absorbancias del CN como los dos parámetros a estudiar en la validación de este inmunoensayo. Los reactivos no especificados eran de calidad analítica (Merck, Darmstadt, Alemania).

Este EIA es igual al descripto anteriormente, excepto que las muestras de los pacientes y de los donantes de sangre y los CN y los CP se preincubaron con una concentración en exceso de CIGB-370 en el diluyente en solución a 37 ºC durante 1 h. Luego, las muestras con y sin CIGB-370 añadido se aplicaron 100 µL/pozo por duplicado en la placa de microtitulación recubierta y bloqueada y se incubaron durante 1 h a 37 ºC. El resto del protocolo se siguió igual tal como fuera descripto anteriormente. Se calculó el porcentaje de inhibición=inhibición= 100x [1-(absorbancia de la muestra con la BTP añadida/absorbancia de la muestra sin la BTP añadida)].

La concentración del CP a partir de la cual se produce una meseta en la curva dosis-respuesta de las concentraciones del analito vs. la absorbancia en el inmunoensayo constituye el CP alto. El EIA de titulación fue similar al inmunoensayo de pesquisaje antes descripto, pero en este caso se realizaron diluciones del CP alto 1/40, 1/120, 1/360, 1/1080, 1/3240 y 1/9720 y se aplicaron por duplicado en el diluyente de la muestra. Los títulos de interpolación son la recíproca de la mayor dilución de las muestras o de los CP que producen una absorbancia igual al umbral de corte. Los títulos fueron calculados a partir de la interpolación de la recta de mejor ajuste de un modelo de regresión lineal calculado por el método de cuadrados mínimos entre las absorbancias y el logaritmo decimal de la recíproca de las diluciones en serie del CP alto a nivel del umbral de corte de pesquisaje.

En la confirmación del funcionamiento confiable y preciso de esa metodología de determinación de anticuerpos anti-BTP se tuvieron en cuenta las recomendaciones internacionales de inmunoensayos cuasi cuantitativos como son: la determinación del umbral de corte fluctuante de pesquisaje y confirmatorio, la sensibilidad analítica y el efecto gancho, la especificidad analítica y la selectividad analítica, la precisión de los inmunoensayos de pesquisaje, de confirmación y titulación y los criterios de aceptación de los controles de aprovechamiento del sistema (4) (5) (6) (7).

El umbral de corte de pesquisaje y confirmatorio fue calculado en los siguientes pasos: a) se realizaron de 3 a 6 inmunoensayos de pesquisajes y de confirmación en una misma corrida en días diferentes; b) se investigó si la distribución de frecuencias de las absorbancias (inmunoensayo de pesquisaje) o porcentajes de inhibición (inmunonensayo de confirmación) de las muestras de individuos sin recibir tratamiento con la BTP en cada uno de los inmunoensayos fue normal; c) se realizó la evaluación de los valores extremos por el método estadístico de Grubbs de las absorbancias o los porcentajes de inhibición de las muestras de individuos sin recibir tratamiento con la BTP en cada uno de los inmunoensayos; si se detectaban esos valores se descartaban y se verificaba nuevamente que la distribución de frecuencias de los datos fuera normal; d) se calculó el umbral de corte de cada uno de los ensayos con la fórmula: media + t _{n-1, α} x desviación estándar (DE) de las absorbancias o de los porcentajes de inhibición de las muestras de individuos sin recibir tratamiento con la BTP en cada uno de los inmunoensayos. La media corresponde al promedio aritmético. La letra t corresponde al parámetro de la distribución t de Student con un nivel de significación (α) de 0,05 (inmunoensayo de pesquisaje) y 0,01 (inmunoensayo de confirmación); n-1, grados de libertad para un número de observaciones (n); e) se comparó la media y la DE de las absorbancias y de los porcentajes de inhibición de las muestras de individuos sin recibir tratamiento con la BTP en cada uno de los inmunoensayos por las pruebas estadísticas ANOVA de una sola vía y la prueba de Bartlett, respectivamente. En este estudio las medias de las absorbancias y los porcentajes de inhibición de los inmunoensayos de pesquisajes y confirmatorios fueron diferentes y las DE iguales, por lo que se determinó un umbral de corte fluctuante; f) se demostró una alta correlación entre la media de las absorbancias de las muestras negativas para anticuerpos anti-CIGB-370 de individuos sin recibir tratamiento con la BTP y el promedio de las absorbancias del CN en varias corridas de los inmunoensayos; g) se calculó un factor de normalización aditivo a partir de la sustracción al umbral de corte promedio ponderado, la media ponderada de las absorbancias o de los porcentajes de inhibición del CN de cada uno de esos inmunoensayos; h) al promedio del CN de cada inmunoensayo se le adicionó el factor de normalización aditivo de pesquisaje o confirmatorio y se obtuvo el umbral de corte fluctuante de cada tipo de inmunoensayo.

La sensibilidad analítica se obtuvo construyendo una curva de calibración de CP (desde 4000 ng/mL a 3,5 ng/mL) con diluciones seriadas al medio hasta que bordeara el umbral de corte de pesquisaje en al menos tres corridas independientes realizadas por un analista y leída en un equipo. Luego, se extrapoló la recta de mejor ajuste de un modelo de regresión lineal calculado por el método de cuadrados mínimos entre las absorbancias y el logaritmo decimal de las concentraciones de esa curva patrón a nivel del umbral de corte de pesquisaje. La sensibilidad, con un 95% de certeza, se estimó a partir de la media de la sensibilidad analítica de cada ensayo + t (_{0,05; n-1}) x DE.

La concentración del analito del CP bajo correspondió al promedio de la sensibilidad analítica de tres ensayos + t (0,01; n-1) x DE. Este CP bajo y el CP alto se diluyeron en la mezcla de plasma de donantes de sangre, se alicuotaron y se conservaron a -20 °C. Para analizar el efecto gancho se evaluaron concentraciones de anticuerpos superiores al CP alto diluido 1/40 (16, 32 y 128 µg/mL) que pudieran producir un resultado falsamente negativo.

La especificidad analítica se estudió en un inmunoensayo de inhibición donde en el paso de las muestras, al CP alto y al CN diluido 1/40 en el tampón diluyente se le añadieron diferentes concentraciones (100; 10; 1; 0,1; 0,01; y 0,001 μg/mL) del CIGB-370i y CIGB- 370f y del excipiente o albúmina sérica humana (Sigma- Aldrich, EE.UU.) y sin ninguna molécula añadida; se preincubaron durante 1 h a 37 °C y luego se aplicaron a la placa de microtitulación. Se siguió el resto de los pasos como se describiera anteriormente. En otro experimento, a concentraciones de anticuerpos anti-BTP superiores al CP alto exploradas en el efecto gancho, se le añadieron las concentraciones del CIGB-370 que pudieran inhibir su absorbancia.

En la selectividad analítica se midió la interferencia debida a la BTP en estudio y a los componentes del plasma mediante un EIA de inhibición, donde al CP bajo y al CN se les añadieron diferentes concentraciones de CIGB-370f: 3200; 800; 200; 50; 12,5; 3,1 y 0 ng/mL y de las proteínas contaminantes del hospedador, en las mismas concentraciones ya mencionadas, para explorar la interferencia de la BTP. Se preincubaron 1 h a 37 °C y luego se aplicaron a la placa de microtitulación recubierta con el CIGB-370 y se continuó con el resto de los pasos como se describiera. La selectividad analítica relacionada con la interferencia de la matriz biológica se estudió en el inmunoensayo de inhibición cuando a la concentración del CP alto se le añadió el plasma de un paciente enfermo de cáncer, el plasma de siete donantes de sangre, la mezcla de plasma de donantes de sangre (CN) y el diluyente de las muestras.

Para la precisión de los inmunoensayos de pesquisaje y de confirmación, los CN, CP alto y CP bajo fueron probados en tres días diferentes por un analista en un solo instrumento de lectura. Cada placa incluía tres lotes independientes de los controles. Se calculó la media, la DE y el coeficiente de variación de la razón de absorbancias del CP alto/CN y del CP bajo/CN y las absorbancias del CN para el EIA de pesquisaje y de los porcentajes de inhibición del CP alto, CP bajo y CN para el EIA de confirmación de la especificidad. A los resultados de precisión intra e interanálisis de cada uno de los controles se le fijó un índice de falla de 1% para determinar los criterios de aceptación de los controles: de una cola para el CN (promedio de las absorbancias o de los porcentajes de inhibición + t(_{0,01; n-1}) x DE) y de dos colas para la razón de absorbancias o porcentaje de inhibición del CP alto/CN y del CP bajo/CN (promedio de las razones de absorbancias o de los porcentajes de inhibición de los controles ± t(_{0,005; n-1}) x DE). Se calculó el coeficiente de ventana factor Z´= 1-[(3 x DE_CPalto+3 x DE_CN)/(media _CPalto - media _CN)], a partir de las DE y las medias de las absorbancias o de los porcentajes de inhibición del CP alto y del CN (28).

La precisión de la titulación del CP alto en el EIA de pesquisaje se realizó en tres lotes diferentes en tres ensayos diferentes (con un total de ocho determinaciones). Se calculó la media, la DE y el coeficiente de variación de los títulos del CP alto. A partir de esas determinaciones se calculó la razón mínima significativa (RMS) de un aumento estadísticamente suficiente de los títulos, después con respecto a antes de recibir el tratamiento con la BTP, mediante la fórmula RMS= 10 _{t(n-1; 0,05) x√DEg}, donde DEg es la desviación estándar global que incluye la variación intra e interanálisis (29).

Las muestras de los pacientes se evaluaron primero en el EIA de pesquisaje como reactivas y negativas y luego, las muestras reactivas como positivas y negativas en el EIA de confirmación de la especificidad. En ambos inmunoanálisis las razones de absorbancias del CP alto/CN y CP bajo/CN y los porcentajes de inhibición de los CP alto y CP bajo cayeron en el intervalo de aceptabilidad de cada uno de esos controles (Tabla I). Las muestras con resultados negativos antes y después del tratamiento fueron consideradas de pacientes con una respuesta inmune negativa. Si esas muestras negativas dieron positivas después de tratamiento, fueron de pacientes con una respuesta inmune inducida. Las muestras que dieron positivas antes del tratamiento y luego dieron negativas fueron de pacientes con una respuesta inmune reducida. Un último caso fue: si las muestras dieron positivas antes y después del tratamiento fueron de pacientes con una respuesta inmune preexistente no modificada. Las muestras se diluyeron 1/40, 1/120, 1/360 y 1/1080. A las muestras no se les realizó la determinación de los títulos de anticuerpos por no disponerse del volumen suficiente.

Tabla I

En la comparación de dos muestras independientes se aplicó una prueba t de Student si se cumplía con una distribución normal. De lo contratrio, se realizó una prueba U de Mann Whitney. En la comparación de dos muestras dependientes se aplicó una prueba t de Student pareada si se cumplía con una distribución normal. De lo contrario, se realizó una prueba de los rangos con signo de Wilcoxon. En la comparación de varias muestras se aplicó una ANOVA de una sola vía como prueba paramétrica y un análisis de Kruskal-Wallis como prueba no paramétrica con sus pruebas de comparación múltiple de Tukey y de Dunn, respectivamente. Las pruebas de homogeneidad de varianzas de Fisher y de Bartlett se realizaron para la comparación de dos grupos y varios grupos de muestras, respectivamente. Para determinar si la distribución de la frecuencia de los datos era normal se realizó la prueba de Shapiro-Wilk. Se buscó la existencia de valores extremos en los datos por la prueba de Grubbs. En la asociación de datos paramétricos de variables continuas se empleó el coeficiente de correlación de momento-producto de Pearson (r) y el coeficiente de determinación (R²). Todos esos análisis estadísticos se realizaron con el paquete estadístico GraphPad Prism versión 6.0 para Windows (GraphPad Software Inc., La Jolla California, EE.UU.). Se consideró como significativa en las pruebas de hipótesis de dos colas una p<0,05. La recolección y organización de los datos se realizó en el programa Microsoft Excel (Windows 2007, EE.UU.). En ese programa se preparó una hoja de cálculo que permitió la determinación de la recta de mejor ajuste de dos variables continuas (Aseguramiento de la Calidad del CIGB, Habana, Cuba). El promedio ponderado se calculó mediante la suma de los productos de cada promedio parcial por el número correspondiente de observaciones dividido por el número total de las observaciones en varios grupos. La comparación de varios grupos de muestras sobre una variable nominal se realizó con una prueba de Chi cuadrado (χ ²) para una tabla de contingencia múltiple. Se determinó la potencia estadística (1-β) mediante el paquete estadístico G*Power versión 3.1.9.4 (Universidad Kiel, Alemania). La prevalencia de esos anticuerpos se determinó con la división del número de sujetos positivos para esos anticuerpos entre el número de sujetos evaluables en ese período, multiplicado por 100 (%).

Se identificaron 17 regiones probables de ser epítopos de células B por los métodos basados en la secuencia aminoacídica del CIGB-370: 10 epítopos por el método de predicción de antígeno (Y₁₇-A₃₅, Q₆₄-A₇₀, F₉₇-G₁₀₂, G₁₀₅-V₁₁₃, D₁₂₅-N₁₃₀, N₁₄₂-G₁₄₇, D₁₆₁-D₁₇₀, F₂₀₃-F₂₁₀, E₂₁₆-N₂₂₂ y V₂₂₇-G₂₃₅) y epítopos por el método de accesibilidad superficial (Y₃-G₁₁, A₃₅-D₄₃, F₄₈-G₅₃, T₅₉-Q₆₄, Y₈₄-F₉₇, W₁₇₈-G₁₈₅ y F₁₉₄-S₂₀₀). En el método ElliPro para la predicción de epítopos conformacionales y lineales de células B basado en la estructura tridimensional del CIGB-370 se identificaron 9 regiones epitópicas lineales (M₁-L₂₂, D₂₄-T₄₄, F₄₈-D₅₅, S₅₈- V₆₆, W₇₁-N₇₆, F₁₈₂-D₁₈₇, N₁₉₅-V₂₂₇, N₂₃₃-D₂₄₁ y G₂₄₈-D₂₅₅). Solamente dos regiones probables de ser epítopos lineales de células B fueron solapados por los tres métodos de predicción: M₁-T₄₄ y S₅₈-A₇₀ y cuatro regiones fueron solapadas por dos métodos de predicción: F₄₈-D₅₅, F₉₇- G₁₀₂, W₁₇₈- D₁₈₇ y F₁₉₄- D₂₄₁ (Fig. 1). Por el método ElliPro se predijeron 4 regiones epitópicas discontinuas de células B: una de 4 residuos aminoacídicos (con un índice epitópico: 0,938); la segunda con 36 residuos (0,744); la tercera con 76 (0,655); y la cuarta con 28 (0,625). El sitio activo antiproliferativo y antiangiogénico del CIGB-370 (G42-S61; Fig. 1) fue reconocido por el análisis de epítopos lineales de células B (M₁-T₄₄, F₄₈-D₅₅ y S₅₈-A₇₀) y por el análisis de epítopos conformacionales de células B de la tercera región epitópica donde se reconocen aminoácidos que forman parte de la región central primaria (4 aminoacidos en N₅₁-L₅₇), y de los bordes de las regiones secundarias extendidas aminoterminal (6 aminoácidos en G₄₂-S₅₀;) y carboxiloterminal (4 aminoácidos, S58-S61) de ese sitio activo (30). Se identificó una región en la secuencia primaria del CIGB-370 probable de ser un epítopo de células T: A₁₅₈-A₁₇₂ (Fig. 1). No se encontró reconocimiento significativo con proteínas endógenas de seres humanos (Homo sapiens), de ratón (Mus musculus) y de conejo (Oryctolagus cuniculus). El dominio C terminal de la proteína serralisina de la bacteria Serratia marcescens (CIGB-370) tuvo similitud en el patrón aminoacídico con la toxina enterohemolisina de la bacteria Escherichia coli. Ambas presentaron motivos estructurales de unión de calcio y pueden provenir de un ancestro común en la evolución molecular. El CIGB-370 presentó una probabilidad muy baja de ser una proteína alergénica y de poseer epítopos de IgE.

El BTP CIGB-370i, cuando se recubre en placa Maxi- Sorp, produce una menor razón de absorbancias del CP/CN que cuando se recubre en la placa PolySorp (Fig. 2A). La biomolécula de CIGB-370i, cuando se recubre en placa MaxiSorp, produce mayores absorbancias del CN que cuando se recubre en la placa PolySorp (Fig. 2B). Esos resultados se repitieron con el recubrimiento con CIGB-370f en este inmunoensayo. La placa PolySorp se utilizó en los restantes experimentos de optimización y validación de estos inmunoensayos de evaluación de anticuerpos anti-CIGB-370. En la comparación de los recubrimientos con esas dos preparaciones del CIGB-370 en la placa PolySorp; el recubrimiento del CIGB-370i presentó iguales absorbancias del CN que el CIGB-370f (Mann-Whitney U=6; n=4; p=0,657). El recubrimiento de CIGB-370i presentó menores razones de absorbancias del CP/CN que el CIGB-370f (U=21, n=6, p=0,03), por lo que se decidió realizar el recubrimiento con el CIGB-370f en el resto de los experimentos de validación del ensayo.

Figura 1

Figura 2

Para determinar ese umbral de corte en los EIA de pesquisaje y de confirmación se evaluaron 8 muestras de donantes de sangre y 18 muestras de pacientes con cáncer sin recibir tratamiento con CIGB-370. Las muestras que dieron por encima o igual al promedio de las absorbancias del CN +2xDE en el EIA de pesquisaje fueron consideradas reactivas y, por debajo de esa absorbancia, negativas. Las muestras reactivas fueron evaluadas en el EIA de confirmación de la especificidad. Aquellas que tuvieron un valor mayor o igual que el promedio de los porcentajes de inhibición del CN +2xDE fueron consideradas positivas y las que tuvieron un menor porcentaje de inhibición fueron consideradas negativas. Las muestras negativas por los inmunoensayos de pesquisaje y de confirmación fueron 7 de 8 donantes de sangre y 14 de 18 de pacientes de cáncer sin recibir tratamiento con CIGB-370. Luego se demostró que no había diferencias significativas entre la medias (t=0,906; n₁=14; n₂=22; p=0,371) y las varianzas (F=1,58, n₁=14; n₂=22; p=0,4) de las absorbancias de las muestras de donantes de sangre con respecto a las muestras de pacientes con cáncer negativas para anticuerpos anti-CIGB-370 en el inmunoensayo de pesquisaje. Por lo que las muestras de enfermos de cáncer y de donantes de sangre presentaron un umbral de corte similar (29) y, por otro lado, no fue posible calcular el umbral de corte a partir de las muestras antes del tratamiento de cada paciente por tener algunos de ellos anticuerpos anti-CIGB-370 preexistentes (29) (31). Finalmente, debido a la disponibilidad de un volumen suficiente de plasma de muestras de 7 donantes de sangre y de un paciente enfermo de cáncer, esas muestras se emplearon para determinar el umbral de corte de ambos EIA.

En seis ensayos de pesquisaje realizados con las absorbancias de esas muestras todas tuvieron una distribución normal de frecuencias por la prueba de Shapiro Wilk; un valor extremo en tres muestras negativas de tres ensayos y un valor residual se descartaron del resto del análisis. Sin embargo, los porcentajes de inhibición de las muestras negativas para anticuerpos anti-CIGB-370 en seis ensayos confirmatorios independientes cumplieron con una distribución normal en escala lineal y sin valores extremos. Existieron diferencias significativas en la medias de las absorbancias de esas muestras en cuatro ensayos de pesquisaje por la ANOVA de una vía (F(3, 49)=47,0; p<0,0001). La prueba de homogeneidad de varianza de Bartlett no tuvo diferencias significativas entre las DE [estadígrafo Bartlett (corregido)=4,21; p=0,24]. Las medias de los porcentajes de inhibición de las muestras negativas tuvieron diferencias significativas entre los diferentes ensayos de confirmación [F(5,81)=3,11; p=0,012]. Sin embargo, las DE no variaron entre los ensayos [estadígrafo de Bartlett (corregido)=8,05; p=0,15], por lo que en ambos ensayos se decidió calcular un umbral de corte fluctuante. Existió una asociación alta entre el promedio de las muestras negativas de anticuerpos de individuos sin recibir tratamiento con el CIGB-370 y el promedio de las absorbancias del CN preparado con una mezcla de ocho muestras de donantes de sangre (R²=0,93; r=0,96; n=4; p=0,03) y entre esas muestras negativas y el CN preparado con tres muestras (DS4, DS5 y DS8) de donantes de sangre (R²=0,99; r=0,99; n=4; p=0,006). Esta última correlación fue más alta; a tal punto que ese nuevo CN explica el 99% de la variación del promedio de las absorbancias de las muestras negativas de donantes de sangre y un enfermo de cáncer. También ese nuevo CN preparado se utilizó en la evaluación de las muestras de los pacientes con cáncer en el ensayo de confirmación donde existió una asociación alta entre el promedio de los porcentajes de inhibición del nuevo CN preparado con esas tres muestras de donantes de sangre y el promedio de los porcentajes de inhibición de las muestras negativas para anticuerpos anti-CIGB-370 (R²=0,992; r=0,996; n=6; p<0,0001). A partir del umbral de corte ponderado y el promedio ponderado de las absorbancias del CN se calculó el factor de normalización aditivo de los inmunoensayos de pesquisaje y confirmatorio (Tabla I).

La sensibilidad de los inmunoensayos de pesquisajes y confirmatorios con un 95% de consistencia (Tabla I) no tuvieron diferencias significativas (Mann Whitney U=8; n=4; p>0,99). El efecto gancho se exploró a concentraciones 30 veces mayores que el CP alto y no se obtuvo una disminución o desaparición de la señal de absorbancia que pudiera generar un falso negativo en el inmunoensayo de pesquisaje de esos anticuerpos. También, a esa concentración de anticuerpos (128 µg/ mL) se demostró que una concentración de CIGB-370f mayor o igual a 35 µg/mL en solución, era suficiente para inhibir las absorbancias de muestras de pacientes que tuvieran esas altas concentraciones de anticuerpos en el EIA de confirmación de la especificidad de los anticuerpos anti-BTP. La concentración de anticuerpos antiserralisina p50 del CP alto fue 160 µ/mL y la del CP bajo, 4,7 µg/mL en plasma humano.

El CIGB-370i, el CIGB-370f y el excipiente se compararon en sus características de inhibir la absorbancia del CP alto y el CN en un inmunoensayo de inhibición (Fig. 3). Existió inhibición específica de los anticuerpos anti-CIGB-370 del CP alto por ambas preparaciones del CIGB-370 y no ocurrió así con el excipiente ni con la albúmina sérica humana (en otro experimento) cuando se añadieron al CP alto.

En la selectividad analítica relacionada con la interferencia del BTP se produjo una disminución de la absorbancia del CP bajo por debajo del umbral de corte a partir 50 ng/mL de ClGB-370 en el inmunoensayo. Por esto, la tolerancia de este EIA fue de 12,5 ng/mL de CIGB-370 en el diluyente y de 500 ng/mL en el plasma, donde la concentración del BTP en solución todavía generó un resultado positivo. Sin embargo, las concentraciones aplicadas de proteínas contaminantes del hospedador no disminuyeron las absorbancias del CP bajo por debajo del umbral de corte de pesquisaje. Ambas proteínas, cuando son aplicadas en solución al CN, no aumentan sus absorbancias por encima del umbral de corte de pesquisaje. En la selectividad analítica relacionada con la interferencia de otros componentes de la matriz biológica se demostró que los recobrados de las absorbancias del CP alto en diferentes muestras de plasma, mezcla de plasmas y en el diluyente, se encontraban entre 90,5 y 116,7%. Esto confirmó la adecuada selección de la mínima dilución requerida del plasma y la ausencia de un efecto bloqueante de proteínas de la matriz biológica sobre el fondo de absorbancias del ensayo mayor que el diluyente de las muestras.

Figura 3

Los inmunoensayos de pesquisaje y de confirmación para la determinación de anticuerpos anti-CIGB-370 presentaron coeficientes de variación intra e interanálisis por debajo del 20% (Tabla I), igual que los coeficientes de variación intraanálisis (3,5%) e interanálisis (15,8%) de los títulos de anticuerpos del CP alto (de 2515 a 2743) en los inmunoensayos de titulación (n=3). Los coeficientes de ventana (factor Z´) estuvieron entre 0,5 y 1 en cinco inmunoensayos de pesquisaje [con una media de 0,82 y un intervalo de confianza del 95% (IC95%) de 0,69 a 0,95] y cinco inmunoensayos de confirmación (0,87 con un IC95%: 0,8; 0,94), lo cual indica que son ensayos con un adecuado rango dinámico y una aceptable variabilidad para realizar sus funciones. La RMS entre los títulos posteriores con respecto a antes del tratamiento, para detectar la presencia de anticuerpos inducidos en las muestras con anticuerpos preexistentes en el EIA de titulación, fue 2,9.

Se evaluaron 72 muestras de plasma de 18 pacientes con cáncer tratados con el CIGB-370 en un ensayo clínico en fase I. Hubo dos sujetos a los que se les tomaron muestras en la línea base, pero no hubo una determinación posterior al tratamiento: PC12 y PC15. El resultado de anticuerpos de esos pacientes se tuvo en cuenta en el cálculo de la prevalencia de anticuerpos preexistentes y el resultado positivo del PC15 se incluyó en el estado de los anticuerpos (3). En el inmunoensayo de pesquisaje se detectaron 63 muestras reactivas y 9 muestras negativas. En el inmunoensayo confirmatorio se diagnosticaron 39 muestras positivas para anticuerpos anti-CIGB-370 y 24 negativas. Se detectó un total de 33 muestras negativas para esos anticuerpos entre los dos inmunoensayos. La prevalencia global de pacientes positivos para anticuerpos anti-CIGB-370 [82,3%; IC 95% (56%, 96%); n=17; p<0,00001; 1-beta=1] fue significativamente mayor que la prevalencia de pacientes negativos para esos anticuerpos (17,7%). De las muestras positivas para esos anticuerpos, los pacientes con anticuerpos inducidos [59%; IC95% (33%, 81%); n=17; p=0,0045; 1-beta=0,89] fueron significativamente más frecuentes que los pacientes con anticuerpos preexistentes (23%). Las prevalencia parcial antes del tratamiento fue 22,2%. Las prevalencias parciales después del tratamiento oscilaron entre 46,6% y 77,8% desde la segunda y la octava semana, sin diferencias significativas entre ellas. Todas esas prevalencias parciales postratamiento se diferenciaron significativamente de las determinaciones antes del tratamiento (X²=13,5; grados de libertad=5; p=0,04). Esos dos últimos hallazgos indican que el tratamiento con el CIGB-370 en pacientes cancerosos aumenta la prevalencia de esos anticuerpos anti-BTP. La frecuencia de pacientes con anticuerpos preexistentes anti-CIGB-370 no fue significativamente diferente de la frecuencia de donantes de sangre con esos anticuerpos (12,5%, n=8).

La mediana de tiempo de desarrollo de anticuerpos fue 2,5 semanas con un rango intercuartil entre 2 y 3 semanas de los sujetos con anticuerpos inducidos. La mediana de la cantidad de dosis en la que aparecieron los anticuerpos inducidos fue 3 dosis de la BTP con un rango intercuartil entre 2 y 4 dosis. Esta cinética de anticuerpos anti-CIGB-370 puede ayudar a optimizar el esquema de toma de muestras en estudios posteriores (3).

Los principales eventos adversos informados para las dosis estudiadas del CIGB-370 fueron: vómitos, náuseas, diarrea, epigastralgia, fiebre y cefalea de intensidad leve y resolución espontánea. No se encontró asociación de estos síntomas con la presencia de anticuerpos anti-CIGB-370 en los pacientes. No hubo reacciones adversas agudas como anafilaxia, síndrome de liberación de citoquinas ni reacciones de infusión en ninguno de los pacientes tratados. Los eventos adversos de intensidad grave estuvieron relacionados con la progresión de la enfermedad de base y no con la administración del CIGB-370.