535Acta Bioquímica Clínica LatinoamericanaActa bioquím. clín. latinoam.0325-29571851-6114Federación Bioquímica de la Provincia de Buenos AiresArgentinaactabioq@fbpba.org.ar53579359004INMUNOLOGÍAAnticuerpos antifosfolípidos determinados mediante ensayos de inmunoabsorción ligada a enzimas en pacientes con síndrome antifosfolipídico, artritis reumatoidea y lupus eritematoso sistémicoAntiphospholipid antibodies determined by enzyme-linked immunosorbent assays in patients with antiphospholipid syndrome, rheumatoid arthritis, and systemic lupus erythematosusAnticorpos antifosfolípides determinados através de ensaios de imunoabsorção ligada a enzimas em pacientes com síndrome antifosfolípide, artrite reumatoide e lúpus eritematoso sistêmicohttps://orcid.org/0000-0003-1276-4238Martínez TéllezGoitybell1goity@infomed.sld.cuhttps://orcid.org/0000-0001-9729-5172Torres RivesBárbara2https://orcid.org/0000-0002-0117-4665Martiatu HendrichMaité3https://orcid.org/0000-0002-5332-6413Sánchez RodríguezVicky4https://orcid.org/0000-0001-9483-9971Zúñiga RosalesYaima5Licenciada en Ciencias Farmacéuticas. Máster en Ciencias Farmacéuticas. Doctora en Ciencias Farmacéuticas. Investigadora titular.Laboratorio de Inmunología. Centro Nacional de Genética Médica. Cubanacán. Playa. La Habana, CP: 11 600CubaDoctora Especialista en Inmunología. Máster en Genética Médica. Profesora Auxiliar. Investigadora auxiliarLaboratorio de Inmunología. Centro Nacional de Genética Médica. Cubanacán. Playa. La Habana, CP: 11 600CubaLicenciada en Ciencias Farmacéuticas. Máster en Ciencias FarmacéuticasLaboratorio de Inmunología. Centro Nacional de Genética Médica. Cubanacán. Playa. La Habana, CP: 11 600CubaLicenciada en Educación. BiologíaLaboratorio de Inmunología. Centro Nacional de Genética Médica. Cubanacán. Playa. La Habana, CP: 11 600CubaDoctora Especialista en Inmunología. Máster en Genética Médica. Profesora AuxiliarLaboratorio de Inmunología. Centro Nacional de Genética Médica. Cubanacán. Playa. La Habana, CP: 11 600Cuba
Licenciada en Ciencias Farmacéuticas. Máster en Ciencias Farmacéuticas. Doctora en Ciencias Farmacéuticas. Investigadora titular
Doctora Especialista en Inmunología. Máster en Genética Médica. Profesora Auxiliar. Investigadora auxiliar
Licenciada en Ciencias Farmacéuticas. Máster en Ciencias Farmacéuticas
Licenciada en Educación. Biología
Doctora Especialista en Inmunología. Máster en Genética Médica. Profesora Auxiliar
El síndrome antifosfolipídico puede ser primario o secundario a enfermedades autoinmunes. Los anticuerpos antifosfolípidos anticardiolipina y anti-β2 glicoproteína I forman parte de los criterios de clasificación de esta enfermedad. El objetivo del trabajo fue comparar el valor diagnóstico del inmunoensayo para la determinación de anticuerpos anticardiolipina/ β2-glicoproteína I con el inmunoensayo de determinación de anticuerpos antifosfolípidos (anticardiolipina/β2-glicoproteína I/fosfatidilserina/ fosfatidilinositol/fosfatidiletanolamina/fosfatidilcolina y esfingomielina), en pacientes cubanos con síndrome antifosfolipídico. Además, se estimó la frecuencia de estos anticuerpos en pacientes con lupus eritematoso sistémico y artritis reumatoidea que tuvieron manifestaciones vasculares u obstétricas. La muestra fue de 34 pacientes con síndrome antifosfolipídico, 38 con lupus eritematoso sistémico, 33 con artritis reumatoidea y 89 controles con otras enfermedades. Los anticuerpos se determinaron mediante ensayos de inmunoabsorción ligada a enzimas. La frecuencia de anticuerpos fue superior en pacientes con síndrome antifosfolipídico en comparación con todos los grupos, para el ensayo anticardiolipina/ β2-glicoproteína I con títulos moderados o elevados (>40 U/mL) y para el ensayo de anticuerpos antifosfolípidos. No se observaron diferencias en el balance sensibilidad/especificidad entre ambos inmunoensayos, determinado por el área bajo la curva ROC (p=0,9906). Los inmunoensayos estudiados en pacientes cubanos con síndrome antifosfolipídico tienen un valor diagnóstico semejante. La presencia de los anticuerpos anticardiolipina/ β2-glicoproteína I en títulos moderados o elevados podría influir en la diferenciación de pacientes con síndrome antifosfolipídico primario y pacientes con otras enfermedades autoinmunes y con manifestaciones vasculares u obstétricas.
Abstract
Antiphospholipid syndrome can be primary or secondary to autoimmune diseases. Anti-cardiolipin and anti-β2-glycoprotein I antiphospholipid antibodies are part of the classification criteria of the disease. The objective was to compare the diagnostic value of the immunoassay for the determination of antibodies against cardiolipin/β2-glycoprotein I with the immunoassay for the determination of antiphospholipid antibodies against cardiolipin, β2-glycoprotein I, phosphatidylserine, phosphatidylinositol, phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine and sphingomyelin in Cuban patients with antiphospholipid syndrome. Also, the frequency of antibodies in systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis patients with vascular or obstetric manifestations was estimated. The sample was of 34 patients with antiphospholipid syndrome, 38 with systemic lupus erythematosus, 33 with rheumatoid arthritis and 89 controls with other diseases. Antiphospholipid antibodies were determined by enzyme-linked solid-phase immunoassays. The frequency of antibodies was higher in patients with antiphospholipid syndrome compared to other groups, for anti-cardiolipin/b2-glycoprotein I assay with moderate or high titers (>40 U/mL). There was no difference between the sensitivity/specificity balance determined by the area of the ROC curve between both immunoassays (p=0.9906). The immunoassays studied in Cuban patients with antiphospholipid syndrome have similar diagnostic value. The presence of anti-cardiolipin/ β2-glycoprotein I antibodies in moderate or high titers could influence the differentiation of patients with primary antiphospholipid syndrome and patients with other autoimmune diseases and vascular or obstetric manifestations.
Resumo
A síndrome antifosfolípide pode ser primária ou secundária a doenças autoimunes. Anticorpos antifosfolípides, anticardiolipina e anti-β2-glicoproteína fazem parte dos critérios de classificação desta doença. O objetivo do trabalho foi comparar o valor diagnóstico do imunoensaio para determinação de anticorpos anti-cardiolipina/β2-glicoproteína I com o imunoensaio de determinação de anticorpos anti-fosfolipídeos (anti-cardiolipina/β2-glicoproteína I/fosfatidilserina/fosfatidilinositol/ fosfatidiletanolamina/fosfatidilcolina e esfingomielina) em pacientes cubanos com síndrome antifosfolípide. Além disso, a frequência desses anticorpos foi estimada em pacientes com lúpus eritematoso sistêmico e artrite reumatoide que apresentavam manifestações vasculares ou obstétricas. A amostra foi composta por 34 pacientes com síndrome antifosfolípide, 38 com lúpus eritematoso sistêmico, 33 com artrite reumatoide e 89 controles com outras doenças. Os anticorpos foram determinados através de ensaios de imunoabsorção ligada a enzimas. A frequência de anticorpos foi maior em pacientes com síndrome antifosfolípide em comparação com todos os grupos, para o ensaio anticardiolipina/b2-glicoproteína I em títulos moderados ou elevados (>40 U/mL) e para o ensaio de anticorpos antifosfolípides. Não foram observadas diferenças no equilíbrio sensibilidade/ especificidade entre os dois imunoensaios, determinado pela área sob a curva ROC (p=0,9906). Os imunoensaios estudados em pacientes cubanos com síndrome antifosfolípide têm valor diagnóstico semelhante. A presença dos anticorpos anticardiolipina/β2-glicoproteína I em títulos moderados ou elevados poderia influenciar a diferenciação de pacientes com síndrome antifosfolípide primária e pacientes com outras doenças autoimunes e com manifestações vasculares ou obstétricas.
El síndrome antifosfolipídico (SAF) es una enfermedad autoinmune multisistémica que se caracteriza por un amplio rango de manifestaciones vasculares y obstétricas, así como por la presencia de anticuerpos antifosfolípidos (1) (2). Puede ser primario o secundario según se asocie o no a otras enfermedades autoinmunes, aunque el comportamiento clínico es similar (1) (2).
Se estima que afecta del 0,3 al 1% de la población, fundamentalmente individuos jóvenes. Las gestantes con anticuerpos antifosfolípidos tienen un mayor riesgo de presentar abortos o nacimientos prematuros (2).
Los nuevos criterios de clasificación de la enfermedad incluyen criterios clínicos y de laboratorio. Entre los criterios de laboratorio se encuentran los anticuerpos antifosfolípidos, que pueden ser determinados mediante anticoagulante lúpico y mediante la determinación de anticuerpos anticardiolipina (anti-Card) o anti β2- glicoproteína I (anti-β2GPI) IgG/IgM, con ensayos de inmunoabsorción ligada a enzimas (ELISA) (3).
No obstante, se reconoce que un grupo de pacientes cumplen los criterios clínicos y no los criterios de laboratorio establecidos (3). Por esta razón se propone considerar otras plataformas como las automatizadas de determinación de anticuerpos anti-Card y anti-β2GPI, así como otros inmunoensayos enzimáticos de determinación de anticuerpos antifosfolípidos, para actualizaciones futuras de estas guías de clasificación (3).
En este sentido, estudios recientes han demostrado que pacientes seronegativos de anticuerpos anti-Card y anti-β2GPI pueden tener anticuerpos antifosfolípidos que reconocen otras especificidades antigénicas como la fosfatidiletanolamina, el ácido fosfatídico, la fosfatidilserina, el fosfatidilinositol, la vimentina/cardiolipina, la anexina 1 y la protrombina, entre otros (4) (5).
Por otra parte, la asociación más frecuente del SAF con enfermedades autoinmunes se da con el lupus eritematoso sistémico (LES) (6), enfermedad en la que se produce una lesión tisular por depósito de autoanticuerpos e inmunocomplejos de carácter patógeno (7). En los pacientes con LES los anticuerpos antifosfolípidos se pueden detectar hasta diez años antes del diagnóstico (8) (9).
Además del LES, otras enfermedades autoinmunes se han asociado al SAF como la artritis reumatoidea (AR) (2), la cual se caracteriza por inflamación crónica y presencia de autoanticuerpos (10) (11). Los anticuerpos antifosfolípidos también preceden al diagnóstico del SAF en la AR por varios años y algunos autores han encontrado una prevalencia similar de anticuerpos antifosfolípidos en pacientes con AR y con LES (12).
Por lo antes expuesto el objetivo de este trabajo fue comparar el valor diagnóstico del inmunoensayo para la determinación de anticuerpos anti-Card/β2GPI con el inmunoensayo de determinación de anticuerpos anti-Card/β2GPI/fosfatidilserina/fosfatidilinositol/fosfatidiletanolamina/fosfatidilcolina y esfingomielina, en pacientes cubanos con diagnóstico de SAF. Además, se estimó la frecuencia de estos anticuerpos en pacientes con LES y AR que tuvieron manifestaciones vasculares u obstétricas.
<bold>Materiales y Métodos</bold>
<italic>Diseño del estudio y pacientes</italic>
En esta investigación se realizó un estudio transversal de casos y controles con pacientes provenientes de las consultas de inmunología del Centro Nacional de Genética Médica (CNGM) en el período comprendido entre enero de 2015 y diciembre de 2023.
La muestra fue de 34 pacientes con SAF primario que cumplieron los criterios para la clasificación de la enfermedad establecidos por el Colegio Americano de Reumatología y la Liga Europea contra el Reumatismo (CAR/EULAR) (3), 38 con LES que cumplieron los criterios de clasificación CAR/EULAR para el LES (13), 33 con AR que cumplieron los criterios de clasificación CAR/EULAR para la AR (14) y 89 controles con otras enfermedades infecciosas e inmunodeficiencias.
<italic>Recolección de los datos y obtención de muestras biológicas</italic>
Se obtuvieron los datos de edad, sexo y criterios diagnósticos mediante entrevistas individuales y la revisión de las historias clínicas fue realizada por el especialista en inmunología. En el momento de la entrevista e inclusión en el estudio se obtuvo una muestra de 5 mL de sangre venosa periférica a partir de punción venosa, manteniendo las medidas de asepsia y antisepsia. Las muestras de sangre se mantuvieron a temperatura ambiente en reposo para facilitar la formación del coágulo y posteriormente se centrifugaron por 10 minutos a 2000 r.p.m. a temperatura ambiente para la obtención del suero. Las muestras de suero fueron almacenadas a -20 °C hasta su utilización.
<italic>Determinación de los autoanticuerpos</italic>
Se utilizaron ensayos tipo ELISA para determinar anticuerpos antifosfolípidos: el inmunoensayo cuantitativo de determinación de anticuerpos anti-Card/β2GPI IgG (AESKU, Alemania) y el inmunoensayo cualitativo de anticuerpos antifosfolípidos (anti-FL) IgG/IgM que determina anticuerpos anti Card/β2GPI/fosfatidilserina/fosfatidilinositol/fosfatidiletanolamina/fosfatidilcolina y esfingomielina (AESKU, Alemania). La determinación de anticuerpos anti-Card/β2GPI se analizó utilizando el valor de corte establecido por el fabricante (15 U/mL) y al valor de corte >40 U/mL.
Los anticuerpos se determinaron solamente cuando los inmunoensayos estuvieron disponibles.
<italic>
<bold>Análisis de la información y procesamiento estadístico</bold>
</italic>
Se utilizaron los programas Statistica 8.0 y Epidat 4.0. La variable cuantitativa edad con distribución diferente a la normal mediante la prueba de Shapiro Wilk se expresó como mediana y rangos intercuartiles. Las variables cualitativas como sexo y positividad de los anticuerpos se expresaron como frecuencia y porcentaje. Se realizó la comparación de proporciones mediante el estadígrafo z. Para estimar el valor diagnóstico se determinaron la sensibilidad, especificidad, valores predictivos positivo y negativo y el área bajo las curvas ROC. El nivel de significación estadística fue 0,05.
<italic>
<bold>Aspectos éticos</bold>
</italic>
Para el desarrollo de la investigación se cumplieron los principios enunciados en la Declaración de Helsinki de la Asociación Médica Mundial (15). Los pacientes brindaron su consentimiento para la participación en la investigación antes de las extracciones de sangre. La investigación fue aprobada por el comité de ética del Centro Nacional de Genética Médica.
<bold>Resultados</bold>
La población estuvo caracterizada por predominio del sexo femenino (Tabla I).
De manera general la presencia de anticuerpos antifosfolípidos se observó en la mayoría de los pacientes con SAF (Tabla I).
Se observaron diferencias entre las frecuencias de anticuerpos anti-Card/β2GPI con títulos moderados o elevados (>40 U/mL) para los pacientes con SAF en comparación con los pacientes con LES, AR y los controles (Tabla I). Estas diferencias también se observaron para la frecuencia de anticuerpos anti-FL (Tabla I).
No existieron diferencias entre las frecuencias observadas en los pacientes con SAF primario mediante el inmunoensayo anti-Card/β2GPI con títulos moderados o elevados y el inmunoensayo anti-FL. Sin embargo, los pacientes con LES y AR tuvieron menor frecuencia de anticuerpos anti-Card/β2GPI con títulos superiores a 40 U/mL (Tabla I).
Los resultados de esta investigación mostraron que los anticuerpos anti-Card/β2GPI con títulos moderados o elevados tuvieron la mayor especificidad y valor predictivo positivo para el diagnóstico del SAF (Tabla II). El valor predictivo negativo y la sensibilidad fueron superiores con el ensayo anti-FL. Sin embargo, no se observaron diferencias en el balance sensibilidad/especificidad entre ambos inmunoensayos determinado por el área bajo la curva ROC (p=0,9906) (Fig. 1).
<bold>Discusión y Conclusiones</bold>
A pesar del conocido efecto trombofílico de los anticuerpos antifosfolípidos, la patogénesis exacta de la enfermedad aún no está completamente aclarada. Se cree que la fisiopatología del SAF trombótico implica la generación de autoanticuerpos que se unen al epítopo principal de las células B en el dominio I de la glicoproteína β2 (2) (16).
Los inmunoensayos de determinación de anticuerpos antifosfolípidos estandarizados y validados son esenciales en los criterios de clasificación del SAF. Aunque el anticoagulante lúpico es otro criterio de laboratorio, debe ser objeto de una cuidadosa interpretación debido a su interferencia analítica con reactantes de fase aguda y con la terapia anticoagulante (3) (17).
Se ha planteado que el inmunoensayo ELISA anti- Card/β2GPI es la prueba más sensible para el diagnóstico del SAF (18) y que incluye las especificidades antigénicas establecidas en los criterios de clasificación (3).
Aunque el inmunoensayo anti-FL que reconoce varias especificidades antigénicas de fosfolípidos Card/β2GPI/fosfatidilserina/fosfatidilinositol/fosfatidiletanolamina/fosfatidilcolina y esfingomielina, pudiera contribuir a la identificación de pacientes seronegativos para anti-Card y anti-β2GPI, en esta investigación se observó un valor diagnóstico similar para ambos inmunoensayos.
No obstante, la baja frecuencia observada en esta investigación, de los anticuerpos anti-Card/β2GPI en pacientes con LES y AR a títulos moderados y elevados, aumenta el valor de estos anticuerpos para el diagnóstico del SAF primario y su diferenciación.
El inmunoensayo anti-FL ha mostrado con anterioridad una sensibilidad de 82 a 97% y una especificidad de 61 a 82% (19), similares a las obtenidas en este estudio.
Además, se ha planteado que los inmunoensayos anti-Card y anti-β2GPI tienen sensibilidad y especificidad clínica similares, con una buena correlación (19). Sin embargo, se ha observado también un rango amplio de sensibilidad y especificidad para estos inmunoensayos (20).
La gran heterogeneidad en los inmunoensayos, reactivos y calibradores conduce a una alta variabilidad en la determinación de anticuerpos antifosfolípidos.
También existe un creciente interés en el estudio de estos anticuerpos en pacientes con otras enfermedades autoinmunes (1) (2). Aunque se plantea que del 30 al 50% de los pacientes con LES tienen anticuerpos antifosfolípidos y alrededor del 15% de ellos desarrollan el síndrome completo, en un estudio realizado en Cuba se demostró que el 16% de los pacientes con LES presentaban anticoagulante lúpico (6).
En esta investigación se observó que la presencia de anticuerpos antifosfolípidos relacionados a enfermedades autoinmunes tiene su mayor representación en el LES. No obstante, también se observan pacientes con AR que presentaron estos anticuerpos y aunque pudieran en un futuro desarrollar el SAF, es importante considerar la interferencia con anticuerpos patogénicos de la AR. Se ha demostrado que los anticuerpos reumatoideos son causa de falsos positivos en los inmunoensayos de anticuerpos antifosfolípidos del tipo anti-Card y anti- β2GPI (21).
El diagnóstico de laboratorio para el SAF sigue siendo un desafío, tanto para los médicos como para el personal de laboratorio. Todos los ensayos de anticuerpos antifosfolípidos utilizados actualmente tienen sus limitaciones.
Una limitación de este trabajo fue la no disponibilidad de todos los inmunoensayos para todos los pacientes. Además, se recomiendan estudios con mayor número de pacientes para identificar diferentes especificidades antigénicas de estos anticuerpos, principalmente en pacientes con SAF que no cumplan los criterios de laboratorio establecidos.
Los resultados de esta investigación demuestran que los inmunoensayos estudiados en pacientes cubanos con SAF tienen semejante valor diagnóstico. La presencia de los anticuerpos anti-Card/β2GPI en títulos moderados o elevados podría influir en la diferenciación de pacientes con síndrome antifosfolipídico primario y pacientes con otras enfermedades autoinmunes.
Fuentes de financiación
Ministerio de Salud Pública de Cuba (MINSAP).
Conflictos de intereses
Los autores declaran no tener conflictos de intereses respecto del presente trabajo.
Correspondencia
Dra. GOITYBELL MARTÍNEZ TÉLLEZ
Laboratorio de Inmunología. Centro Nacional de Genética Médica. Dirección: Ave 31, esquina 146, No 3102. Cubanacán, Playa, La Habana. CP: 11 600. Cuba.
Correo electrónico: goity@infomed.sld.cu
<bold>Referencias bibliográficas</bold>
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