Resumen: Se evaluó el rendimiento del cultivo bacteriológico, BinaxNOW™ S. pneumoniae y la PCR del gen lytA para el diagnóstico de neumonía causada por Streptococcus pneumoniae en 67 pacientes pediátricos con derrame o empiema pleural. La PCR fue tomada como método de referencia e identificó a S. pneumoniae en 13 de las muestras. BinaxNOW™ detectó 12 de esos 13 casos positivos (sensibilidad: 92%). El cultivo bacteriológico tuvo un rendimiento significativamente menor: identificó solo 2 de los 13 casos positivos. BinaxNOW™ ofrece una alternativa rápida y accesible, sin necesidad de recursos especializados, aunque se recomienda su uso junto con el cultivo para un diagnóstico más preciso y para poder realizar pruebas complementarias. Los hallazgos subrayan la importancia de estrategias diagnósticas integradas para mejorar el manejo de la enfermedad neumocócica invasiva en la población pediátrica.
Palabras clave: Streptococcus pneumoniae, Diagnóstico microbiológico, Neumonía, PCR, BinaxNOW™, Cultivo.
Abstract: The performance of bacteriological culture, BinaxNOW™ S. pneumoniae, and lytA gene PCR for the diagnosis of pneumonia caused by S. pneumoniae was evaluated in 67 pediatric patients with pleural effusion or empyema. PCR was used as the reference method and through this method S. pneumoniae was identified in 13 of the samples. BinaxNOW™ detected 12 of these 13 positive cases (sensitivity: 92%). Bacteriological culture had a significantly lower performance, identifying only 2 of the 13 positive cases. BinaxNOW™ offers a rapid and accessible alternative, without the need for specialised resources, although its complementary use with culture is recommended for a more accurate diagnosis and to be able to perform complementary tests. The findings underline the importance of integrated diagnostic strategies to improve the management of invasive pneumococcal disease in the pediatric population.
Keywords: Streptococcus pneumoniae, Microbiological diagnosis, Pneumonia, PCR, BinaxNOW™, Culture.
Resumo: O desempenho da cultura bacteriológica, BinaxNOW™ S. pneumoniae e PCR do gene lytA para o diagnóstico de pneumonia causada por Streptococcus pneumoniae foi avaliado em 67 pacientes pediátricos com derrame pleural ou empiema. A PCR foi tomada como método de referência e identificou S. pneumoniae em 13 das amostras. BinaxNOW™ detectou 12 desses 13 casos positivos (sensibilidade: 92%). A cultura bacteriológica teve rendimento significativamente menor: identificou apenas 2 dos 13 casos positivos. BinaxNOW™ oferece uma alternativa rápida e acessível, sem necessidade de recursos especializados, embora seja recomendado seu uso com a cultura para um diagnóstico mais exato e para poder realizar exames complementares. Os achados destacam a importância de estratégias diagnósticas integradas para melhorar o tratamento da doença pneumocócica invasiva na população pediátrica.
Palavras-chave: Streptococcus pneumoniae, Diagnóstico microbiológico, Pneumonia, PCR, BinaxNOW™, Cultura.
MICROBIOLOGÍA
Streptococcus pneumoniae en líquido pleural: análisis comparativo de métodos microbiológicos
Streptococcus pneumoniae in pleural fluid: comparative analysis of microbiological methods
Streptococcus pneumoniae em líquido pleural: análise comparativa de métodos microbiológicos
Federación Bioquímica de la Provincia de Buenos Aires
Recepción: 01 Julio 2024
Aprobación: 10 Septiembre 2024
La enfermedad neumocócica invasiva por Streptococcus pneumoniae afecta a niños y adultos mayores, especialmente con comorbilidades previas. La neumonía y su complicación más frecuente, el derrame pleural, constituye una causa importante de morbilidad y mortalidad a nivel mundial, a pesar de la disponibilidad de vacunas neumocócicas conjugadas (1). El diagnóstico oportuno y preciso es crucial para conocer la etiología y así determinar la elección del tratamiento más efectivo.
Según datos de la Organización Mundial de la Salud, en 2019 la neumonía fue responsable de la muerte de 740 180 niños menores de cinco años, lo que representa el 14% de las muertes en este grupo etario y el 22% de todas las muertes de niños de uno a cinco años (2). Uno de los principales retos en el manejo de la neumonía es determinar su etiología, ya que las pruebas de diagnóstico disponibles tienen importantes limitaciones. La radiografía tiene una sensibilidad limitada para distinguir entre las diversas causas etiológicas de la neumonía, lo que complica aún más el diagnóstico cuando coexisten infecciones virales y bacterianas, en donde se observa superposición de patrones radiológicos (3). Se recomienda la obtención de hemocultivos, que aunque son positivos para S. pneumoniae en solo el 20% de los pacientes, permiten la identificación definitiva del agente etiológico (4). La falta de estandarización en los métodos de diagnóstico rápido también dificulta la identificación precisa del agente etiológico.
Estas limitaciones en la identificación hacen que la enfermedad invasiva por S. pneumoniae no sea correctamente diagnosticada y se dificulte su vigilancia epidemiológica. No se encontraron datos locales que consideren tanto casos positivos como negativos, por lo que se desconoce la carga real de la enfermedad y se subestima su impacto en la salud pública.
El objetivo de este trabajo fue evaluar el rendimiento del cultivo bacteriológico y de una prueba de inmunocromatografía (IC) BinaxNOW™ S. pneumoniae (Abbot, Argentina) empleando una técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) como método de referencia para el diagnóstico de neumonía causada por S. pneumoniae.
Se realizó un estudio prospectivo y descriptivo transversal que incluyó a 67 pacientes con derrame pleural o empiema, ya sea como diagnóstico principal o secundario de causa infecciosa, atendidos en un hospital pediátrico de alta complejidad entre noviembre de 2021 y diciembre de 2023. Se remitieron al servicio de Microbiología muestras de líquido pleural (LP) obtenidas por toracocentesis (una muestra por paciente). A las muestras de LP se les realizó tinción de Gram y cultivo bacteriológico en agar sangre, agar chocolate y agar MacConkey como medio selectivo para bacilos gram negativos. La identificación microbiológica de S. pneumoniae se efectuó mediante espectrometría de masas [MALDI-TOF (Matrix- Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight) Vitek® MS, Knowledge Base KB versión 3.2], siguiendo las recomendaciones del fabricante. Para la confirmación de género y especie se utilizaron las pruebas de sensibilidad a la optoquina y la solubilidad en sales biliares.
La detección del antígeno neumocócico en muestras de líquido pleural se llevó a cabo utilizando una prueba de inmunocromatografía (IC) BinaxNOW™ S. pneumoniae (Abbot, Argentina) siguiendo las instrucciones del fabricante, originalmente diseñadas y validadas para muestras de orina.
Se realizó además una técnica de PCR “in house” en tiempo real, con iniciadores específicos para el gen lytA que codifica para la autolisina de S. pneumoniae, de acuerdo al trabajo publicado por Carvalho et al. (5) quienes, por su elevada especificidad, recomiendan su uso especialmente en muestras del tracto respiratorio superior, donde podrían coexistir microorganismos relacionados. La reacción se realiza en formato dúplex, junto con el gen constitutivo RNasa P como control interno endógeno, con una sensibilidad analítica de 60 copias/tubo. En la Tabla I se detallan las secuencias de iniciadores y sondas fluorescentes empleados. La obtención de ADN a partir de LP se llevó a cabo mediante un método de extracción comercial QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) según las instrucciones del fabricante. El ensayo se realizó por duplicado para cada una de las muestras utilizando un equipo de detección ABI PRISM™ 7500 de Applied Biosystems, con detección simultánea de dos fluoróforos diferentes (FAM para la secuencia blanco y VIC para el gen constitutivo) con sondas específicas TaqMan o de hidrólisis como química fluorescente en condiciones de ciclado universal. En la interpretación de resultados se consideró que una muestra era negativa cuando no se observaba un incremento en el signo de fluorescencia específica dentro de los 45 ciclos de la reacción y para validarla como tal, el ciclo umbral (Ct) de RNasa P debía ser menor o igual a 35, mientras que se consideró positiva toda muestra que arrojara un Ct menor o igual a 40.
Aunque el cultivo es considerado la prueba estándar, su sensibilidad se puede ver afectada por el uso previo de antibióticos, lo que puede llevar a resultados falsamente negativos. Por este motivo, se empleó la técnica de PCR como método de referencia. Se calcularon sensibilidad (S), especificidad (E), valor predictivo positivo (VPP) y valor predictivo negativo (VPN) de las técnicas.
Todos los datos fueron registrados en el sistema de gestión de microbiología (Kern Mic® v.9.0.194).
Los aislamientos bacterianos analizados provinieron de muestras clínicas utilizadas para el diagnóstico microbiológico habitual de estas infecciones. Fueron manipulados en forma anónima, asegurando la absoluta confidencialidad de la información obtenida y a los únicos fines de la presente investigación, cumpliendo con las normas éticas de la institución y de acuerdo a recomendaciones nacionales e internacionales.
La mediana de edad de los pacientes estudiados fue de 91 meses, con un rango intercuartílico (RIQ) de 35,5 a 159 meses. Los pacientes en los que se detectó el agente etiológico tuvieron una mediana de 39 meses, con un rango intercuartílico de 29 a 67 meses.
Se detectó S. pneumoniae como agente etiológico en 13 de las 67 muestras analizadas (19,4%) utilizando el método de referencia. Los valores de Ct de estas PCR positivas oscilaron entre 19 y 37,2, con un Ct medio de 29. El ensayo rápido de antígeno detectó 12 de las 13 muestras positivas por PCR, lo que corresponde a una S del 92%. Se encontraron además 3 resultados no concordantes entre la PCR y BinaxNOW™ S. pneumoniae, de los cuales dos fueron negativos mediante PCR y positivos mediante la prueba de antígeno y por lo tanto fueron considerados como resultados falsamente positivos. Por otro lado, se observó que sólo en 2 pacientes ambos métodos coincidieron con la recuperación del cultivo para S. pneumoniae, lo que evidencia un rendimiento del 15% en la detección del total de 13 LP para este último método. En la Tabla II se detallan indicadores inflamatorios, como la proteína C reactiva en sangre y el recuento de leucocitos, junto con los resultados del examen citoquímico de los líquidos pleurales disponibles. Además, se presentan las características microbiológicas y los tratamientos administrados a pacientes pediátricos con sospecha de enfermedad invasiva por S. pneumoniae.
En la Tabla III se describe el rendimiento de las pruebas diagnósticas microbiológicas para S. pneumoniae utilizando la técnica de PCR como método de referencia, en términos de S, E, VPP y VPN. Para evaluar la concordancia entre los métodos diagnósticos utilizados, se calculó el índice Kappa (κ). El análisis mostró que la concordancia entre la PCR y BinaxNOW™ fue alta (κ=0,85), lo que respalda su uso como una herramienta diagnóstica complementaria o alternativa. Por otro lado, la concordancia entre PCR y el cultivo fue aceptable (κ=0,23), lo que destaca la necesidad de considerar otros factores al interpretar los resultados entre PCR y cultivo.
Tabla I
Tabla II
Tabla III
En este estudio se evaluó la eficiencia de diferentes métodos microbiológicos para el diagnóstico de S. pneumoniae en LP en pacientes pediátricos con empiema. Los hallazgos revelaron que el cultivo bacteriológico tuvo una sensibilidad muy baja, con un rendimiento inferior al ser comparado con otros estudios (6). Esta baja sensibilidad del cultivo bacteriológico puede atribuirse a varias limitaciones: las muestras deben ser procesadas rápidamente, ya que la viabilidad de las bacterias disminuye con el tiempo y por otro lado, el tratamiento antibiótico previo frecuente en estas situaciones (7). Además, aunque el cultivo sigue siendo un método necesario, su tiempo de respuesta prolongado (48 a 72 horas) lo hace poco conveniente para las decisiones iniciales en el tratamiento de los pacientes, tanto para la adecuación del antibiótico como para la determinación de la necesidad de drenaje (8).
En contraste, las técnicas moleculares y la detección de antígenos demostraron una mayor eficiencia, en línea con estudios previos (9).
La PCR identificó S. pneumoniae en 13/67 muestras de LP, lo que resalta su utilidad clínica ya que permite la documentación del agente etiológico, incluso en pacientes que han recibido tratamiento antibiótico previo (9). Sin embargo, estas técnicas requieren laboratorios equipados y personal especializado, lo cual puede limitar su disponibilidad en algunos centros. La detección rápida del antígeno neumocócico en LP mostró una S del 92% con respecto al método de referencia. Su empleo mejoró el diagnóstico etiológico y coincidió con los hallazgos de otros autores que observaron un mayor rendimiento de la prueba de antígenos en empiemas (9) (10). Sin embargo, estudios realizados en muestras de orina indicaron que esta prueba tenía una baja especificidad, ya que no distinguía entre pacientes con neumonía y portadores nasofaríngeos (11); además, podría generar resultados falsamente positivos debidos a una vacunación previa. Es así que un resultado positivo en el test de antígeno en una muestra de orina por sí solo no es suficiente para diagnosticar neumonía neumocócica (12).
La diferencia en la sensibilidad en las muestras clínicas podría deberse a las mayores concentraciones de antígeno en los espacios pleurales en el caso del empiema, en comparación con las muestras de orina. Además, los resultados falsamente positivos obtenidos por BinaxNOW™ no están completamente claros. Estos resultados podrían ser verdaderos positivos no detectados por otros métodos debido al uso previo de antibióticos y/o a la degradación del ADN (9). También es posible que los resultados falsamente positivos del test se deban a la reacción cruzada con el polisacárido C, presente en otras bacterias, como los estreptococos del grupo viridans (10) (13) o Parvimonas spp. (14), aunque estos agentes son excepcionales en casos de empiema.
Este estudio presenta ciertas limitaciones. La prueba BinaxNOW™ S. pneumoniae no se realizó en muestras de orina, lo que impidió comparar la sensibilidad del ensayo entre los diferentes tipos de muestras. El tamaño muestral fue reducido, por lo que es necesario realizar estudios con una población más amplia para obtener resultados más concluyentes.
La PCR se destaca como la técnica más sensible y específica para detectar S. pneumoniae. Sin embargo, su implementación puede verse limitada por la falta de disponibilidad de técnicas moleculares en los laboratorios. En este escenario, el ensayo BinaxNOW™ S. pneumoniae emerge como una alternativa práctica y accesible con resultados confiables de forma rápida. La implementación de nuevas estrategias de diagnóstico microbiológico permite además disminuir la brecha de neumonías no diagnosticadas. Se recomienda usarlas en conjunto con el cultivo, ya que este último posibilita el aislamiento del agente, indispensable para la identificación de los serotipos implicados, relacionados o no con las vacunas, y la determinación de la sensibilidad a los antibióticos.
Fuentes de financiación
Los autores declaran que no recibieron fondos específicos de ninguna agencia de financiación en los sectores público, comercial o sin fines de lucro para la realización de este estudio.
Conflictos de intereses
Los autores declaran no tener conflictos de interés respecto del presente trabajo.
Correspondencia
Bioq. MARÍA JOSÉ ROMERO
Servicio de Microbiología del Hospital de Pediatría “Prof. Dr. Juan P. Garrahan”. Combate de los Pozos 1881. Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina. CP 1248.
Correo electrónico: mariajoseromero.c19@gmail.com
mariajoseromero.c19@gmail.com
Tabla I
Tabla II
Tabla III
