1. Introdução

A Doença de Alzheimer (DA) é um transtorno neurocognitivo, caracterizado por manifestar-se majoritariamente em idades superiores a 60 anos (DA de início tardio); ou em pessoas com mutações e/ou predisposições genéticas, com idades inferiores a 60 anos (DA de início precoce) (American Psychiatric Association [APA], 2014; Munoz & Feldman, 2000). Os sintomas da patologia são progressivos, sendo as disfunções na memória e na aprendizagem representantes da fase leve; e os prejuízos na linguagem, no desempenho percepto-motor e visuoconstrutor, sintomas da fase maior da DA (APA, 2014).

Dados publicados na World Alzheimer Report indicam que em 2015, ocorreram cerca de 46,8 milhões de casos de DA em todo o mundo (Alzheimer Disease International [ADI], 2015). Os dados sugerem ainda que o número de casos aumente, em aproximadamente 20 anos, para 74,7 milhões; e em 2050, prevê-se que 131,5 milhões de pessoas sejam acometidas pela patologia. A progressão do número de casos da doença pode estar relacionada ao constante envelhecimento da população, pois o envelhecimento é um dos principais fatores de risco para a DA. A população de idosos (maiores de 60 anos) em 2017 era de 962 milhões; e até 2050, estima-se que esta população duplique para 2,1 bilhões (United Nations [UN], Department of Economic and Social Affairs [DESA], Population Division, 2017).

Os sintomas da DA são provocados pela formação de placas neuríticas (PN), compostas pelo peptídeo beta-amiloide (Aβ), nos tecidos cerebrais; e a presença de emaranhados neurofibrilares (ENF), devido a hiperfosforilação da proteína Tau (Korolev, 2014; Munoz & Feldman, 2000). Ocorre uma progressiva neurodegeneração. Dentre diversas implicações, as PN geram neurotoxicidade, neuroinflamação, e promovem disfunções sinápticas; enquanto os ENF desestabilizam a estrutura dos neurônios, acarretando na morte neuronal (Kocahan & Doğan, 2017; Torres et al., 2012). A cognição é danificada, prejudicando diversas funções como memória e linguagem (Zidan et al., 2012).

A etiologia da DA de início tardio permanece desconhecida, bem como a cura da patologia em geral, sendo possível somente o controle dos sintomas (Cazarim, Moriguti, Ogunjimi & Pereira, 2016; Vale et al., 2011). Diversos estudos sobre a origem e o progresso da DA têm sido realizados em modelos animais não-humanos, como determinadas espécies de ratos, na tentativa de estudar seu início, desenvolvimento, retardação e/ou reversão (Alawdi et al., 2016; Petrasek et al., 2016; Walton, 2012). Estes estudos administram substâncias tais como alumínio, colchicina, e estreptozocina, a fim de reproduzir efetivamente as características da DA do ser humano em outro modelo animal (More, Kumar, Cho, Yun, & Choi, 2016).

O presente estudo teve como objetivo identificar e relatar as substâncias usadas em laboratório para simular a DA em ratos. Essa investigação permitirá obtermos mais conhecimento sobre como a DA tem sido estudada em um modelo animal e fornecer informações para possíveis estudos que simulem a DA em ratos. Descrever e investigar a DA é de grande relevância, visto que uma quantidade cada vez maior de pessoas é afetada por essa patologia, sendo necessária ampla divulgação de pesquisas sobre esse tema.

2. Metodologia

Realizamos uma busca nas bases de dados Scielo, PubMed, e Google Academics, sempre com as três palavras-chave juntas “Alzheimer Disease”, “rats” e “induction”. Os termos “Alzheimer Disease” e “rats” constam como Descritores em Ciências da Saúde (DeCS). A partir dessa busca, selecionamos 111 artigos publicados num intervalo de até 5 anos que haviam induzido DA em ratos. Dos 111 artigos, excluímos os estudos que não utilizaram substâncias químicas para induzir a DA em ratos, restando 44 artigos. Desses, em 04 artigos os autores relataram o uso do alumínio, 21 aplicaram injeções de beta-amilóide, 02 usaram a colchicina, 02 a d-galactose, 03 artigos usaram a escopolamina, 10 a estreptozocina e 02 artigos administraram a homocisteína para simular a DA em ratos.

3. Referencial Teórico

3.1. Alumínio

A hipótese acerca do alumínio como fator etiológico na DA é controversa, pois a similaridade entre os sintomas da patologia e a neurodegeneração provocada pelo elemento é questionada (Lidsky, 2014). Contudo, estudos demonstram que o alumínio danifica estruturas como o córtex e o hipocampo, provocando o estresse oxidativo, induzindo a aglomeração da Aβ e a formação de emaranhados neurofibrilares, afetando as atividades sinápticas e promovendo a morte neuronal (Ohyagi & Miyoshi, 2013).

Implicações no desempenho da memória e aprendizado podem ser observadas em modelos de DA produzidos por alumínio em ratos. Um estudo analisou as consequências das alterações hemodinâmicas, e a associação entre estas e as modificações neuropatológicas na DA induzida por alumínio (Chen et al., 2013). Dois grupos de 10 ratos foram usados no estudo, sendo categorizados como controle, que não receberam a administração do cloreto de alumínio, e o grupo que recebeu a administração do cloreto de alumínio de um a cinco meses. As alterações cognitivas foram mensuradas utilizando o Labirinto Aquático de Morris. Os resultados mostraram que os sujeitos administrados com cloreto de alumínio levaram mais tempo para chegar até a plataforma de escape, e menos tempo de permanência no quadrante com a plataforma de escape do que o grupo controle, indicando danos na memória e aprendizagem espacial dos animais (Chen et al., 2013). Outros estudos apresentam conclusões semelhantes, confirmando os efeitos do alumínio sobre alterações na capacidade cognitiva nos sujeitos acometidos pela DA (Alawdi et al., 2016; Singh et al., 2018).

3.2. Beta-Amilóide

Devido à relação concreta entre o peptídeo Aβ e a DA, estudos utilizam a substância na reprodução da patologia em modelos animais não-humanos. Nestes, as disfunções de memória e aprendizagem provocados pela injeção das PN podem ser analisadas com base em testes de memória espacial e/ou visual. Por exemplo, o efeito das flavonas de Vitis vinifera L. sobre a DA induzida por Aβ foi investigado em um estudo que estabeleceu 6 grupos de 15 ratos machos (Sprague Dawley), que durante 14 dias receberam administração de diferentes substâncias (Ma et al., 2018). O grupo modelo para a patologia recebeu injeções de salina e injeções de Aβ, que foi previamente incubada em água deionizada a 37°C por 7 dias até agregar-se; enquanto o grupo controle recebeu a mesma dose de salina injetada no grupo modelo; o grupo administrado com donepezila (substância utilizada no tratamento da DA) e o grupo administrado com baixa, média e alta dose das flavonas, receberam injeções de agregados Aβ antes da administração destas substâncias.

Para mensurar os danos e/ou melhorias na performance cognitiva dos sujeitos, Ma et al. (2018) efetuou o teste de memória e aprendizado no Labirinto Aquático de Morris. Nesse tipo de teste, os animais são inicialmente colocados em uma piscina com água (labirinto aquático) e deixados livres para explorar o ambiente. Posteriormente, posiciona-se uma plataforma de escape em um dos quatro quadrantes (sudoeste, noroeste, nordeste ou sudeste) da piscina. Os sujeitos são reposicionados no labirinto, com o objetivo de treiná-los para tentarem escapar da água ao subirem na plataforma de escape. Por último, a plataforma é removida, e a capacidade de memorizar e aprender a localização da plataforma é mensurada pela quantidade de tempo que permanecem no quadrante em que estava localizada a plataforma e a quantidade de vezes que o mesmo quadrante foi atravessado (Morris et al., 1982).

No estudo de Ma et al. (2018), os animais dos diferentes grupos realizaram um treinamento duplo-cego no labirinto no décimo terceiro dia de administração das substâncias. No sexto dia, os sujeitos foram submetidos à exploração espacial durante 90 segundos no labirinto aquático, cuja plataforma de escape foi removida. Mensurou-se, durante os 90 segundos, o tempo de permanência do rato no terceiro quadrante, bem como o número de vezes que o quadrante foi atravessado durante a exploração. Os resultados evidenciaram que a latência de escape do grupo modelo foi maior em comparação ao grupo controle, enquanto o grupo de média e alta dose de flavonas teve a latência reduzida. Os dados obtidos na exploração espacial mostraram que o número de vezes que o grupo modelo cruzou o terceiro quadrante foi menor em relação ao grupo controle. Enquanto o grupo que recebeu a administração de donepezila e o grupo com alta dose de flavonas cruzaram mais vezes o mesmo quadrante do que o grupo modelo. Esses resultados sugerem que o donepezila e as flavonas melhoraram significativamente o aprendizado e memória em ratos com DA induzidos pela AB.

3.3. Colchicina

A colchicina é uma substância citotóxica que danifica as tubulinas presentes nos microtúbulos, os quais compõem e estabilizam a estrutura celular dos neurônios (Nazem, Sankowski, Bacher, & Al-Abed, 2015). A colchicina causa estresse oxidativo nos neurônios e a degeneração neurofibrilar, prejudicando o transporte realizado nos axônios e dendritos, reduzindo atividades colinérgicas e ocasionando à morte neuronal (More, Kumar, Cho, Yun, & Choi, 2016).

Tais prejuízos implicam em declínios na capacidade de memória e aprendizagem, como evidenciado em um estudo que avaliou os efeitos do antioxidante N-acetilcisteína sobre a DA induzida por colchicina em ratos (Joy, Rao, & Madhyastha, 2018). Os animais foram divididos aleatoriamente em 5 grupos de 12 sujeitos. Os ratos receberam administração de diferentes substâncias durante 2 semanas conforme grupo definido: o grupo controle foi administrado com salina; o grupo que passou por uma cirurgia placebo (sham-rats) foi tratado com salina e submetido à um procedimento cirúrgico, no qual foi injetado líquido cefalorraquidiano artificial esterilizado no ventrículo lateral dos sujeitos; o grupo modelo da DA recebeu injeções de colchicina no ventrículo lateral, e foi tratado com salina; enquanto dois grupos tiveram a DA induzida por colchicina, e posteriormente, um grupo foi tratado com uma dose menor, e o outro com uma dose maior de N-acetilcisteína.

Para avaliar as funções cognitivas foi utilizado o teste de Esquiva Passiva. Este teste é realizado numa caixa dividida em dois compartimentos: um claro feito de madeira, e um escuro feito de metal conectado à um estimulador de choque elétrico. Efetuou-se o teste durante 2 dias, sendo realizados 5 testes ao total; 4 testes no primeiro dia, e um teste no último dia. No primeiro dia, os ratos ficaram livres para explorar os compartimentos por 5 minutos. Após esse tempo, os animais passaram por 3 testes de 5 minutos, nos quais mensura-se o tempo que o sujeito permanece em cada compartimento. No quarto teste, quando o rato pisa no compartimento escuro, um choque elétrico é liberado sob as patas do animal. Em seguida o rato é colocado novamente em sua caixa de convivência. Após 24h da ocorrência do choque elétrico, os ratos são inseridos no compartimento claro. É mensurado quanto tempo leva para o rato entrar no compartimento escuro (latência de entrada) e a permanência em cada compartimento (Joy, Rao, & Madhyastha, 2018). No estudo, observou-se que os ratos acometidos pela DA induzida por colchicina tiveram uma menor latência de entrada e passaram mais tempo no compartimento escuro em comparação aos demais grupos. Esses resultados evidenciam que ocorreram falhas na retenção da memória nos modelos de DA induzida pela injeção de colchicina.

Ainda que os efeitos da colchicina impliquem em perda de memória e problemas no aprendizado, estudos demonstram que a colchicina diferencia-se da DA pela degeneração neurofibrilar causada não pela hiperfosforilação da proteína Tau observada na patologia, mas sim, pela desfosforilação da proteína Tau (para uma revisão, ver Nazem, Sankowski, Bacher, & Al-Abed, 2015).

3.4. D-Galactose

A D-Galactose é um nutriente categorizado quimicamente como açúcar reduzido, administrado na reprodução de modelos da DA em razão da reação de envelhecimento e degeneração cerebral provocados pelo estresse oxidativo gerado pela D-Galactose (Parameshwaran, Irwin, Steliou, & Pinkert, 2010). A injeção de D-Galactose em ratos promove a formação dos agregados Aβ e dos emaranhados neurofibrilares, característicos da patologia (Gok et al., 2015).

Declínios no desempenho da memória e aprendizado podem ser observados na administração da D-Galactose em ratos. Por exemplo, um estudo analisou os efeitos do extrato de Hericium erinaceus (cogumelo comestível e medicinal, conhecido como Juba de Leão) sobre a DA (Diling et al., 2017). No estudo utilizou-se 32 Ratos machos (Sprague Dawley) os quais foram divididos igualmente em 4 grupos: grupo controle, o qual foi tratado oralmente com água destilada; grupo modelo da DA, o qual recebeu injeção intraperitoneal de D-Galactose; grupo baixa dose, em que foi inicialmente induzido a DA por injeção de D-Galactose, e em período subsequente a indução de DA, foi tratado com baixa dose do extrato de Hericium erinaceus; e o grupo de alta dose, em que foi induzido a DA por D-Galactose, porém subsequentemente tratado com maior dose do extrato de Hericium erinaceus. A administração das substâncias ocorreu durante 8 semanas.

O desempenho cognitivo foi avaliado com o teste do Labirinto Aquático de Morris. Os resultados mostraram que o grupo modelo da DA gastou mais tempo durante o treinamento da tarefa em relação aos demais grupos. Além disso, o tempo de permanência do grupo modelo no quadrante alvo e o número de vezes em que a plataforma de escape foi cruzada, apresentou-se menor entre todos os grupos. Portanto, os dados evidenciam déficits no desempenho da memória e aprendizado nos modelos de DA induzidos por D-Galactose, verificados pela incapacidade dos animais de recordarem a localização da plataforma de escape (Diling et al., 2017).

3.5. Escopolamina

A disfunção colinérgica apresenta-se como um dos fatores relacionados aos danos no desempenho da memória e aprendizado na DA. Isto ocorre devido a diminuição da enzima acetiltransferase, responsável pela síntese da acetilcolina (ACH), tal como o bloqueio das atividades dos receptores da ACH (Falco, Cukierman, Hauser-Davis, & Rey, 2016). A escopolamina é uma substância anticolinérgica bloqueadora dos receptores muscarínicos da ACH, utilizada na mimetização das disfunções colinérgicas e cognitivas na DA (More, Kumar, Cho, Yun, & Choi, 2016).

Lu et al. (2018) examinaram os efeitos neuroprotetores da isoflavona de soja sobre os prejuízos da memória na DA induzida por escopolamina em ratos. No experimento, foram utilizados 60 ratos machos, divididos igualmente entre 6 grupos: grupo controle, administrado oralmente com carboximetilcelulose de sódio (CMC-Na); grupo escopolamina, pré-tratado com CMC-Na; grupo donepezila, pré-tratado com donepezila; e os grupos de baixa, média e alta dose da isoflavona de soja, pré-tratados com as isoflavonas. Após 13 dias de tratamento, os grupos da isoflavona de soja, o grupo escopolamina, e o grupo donepezila receberam, durante 7 dias seguidos, doses de escopolamina. Os grupos foram submetidos a testes cognitivos durante 10 dias depois do período de pré-tratamento.

O desempenho da memória de curto prazo e da memória espacial foi mensurada a partir do teste de Reconhecimento de Localização de Objetos (Lu et al., 2018). Na primeira etapa do teste, os ratos passaram por uma fase de habituação por 10 minutos, durante 3 dias consecutivos, na qual exploraram livremente o interior de uma caixa preta retangular de medidas 40cm x 50cm x 50cm. Na segunda etapa, durante o quarto dia, ocorreu a fase de familiarização, onde os ratos exploraram o interior da caixa, onde foram posicionados dois objetos identificados como A1 e A2. Nesta etapa, foi mensurado o tempo que os animais exploraram cada objeto, e o tempo total em que exploram os dois objetos. Após a familiarização, os sujeitos foram colocados novamente na caixa de convivência. A fase de teste foi realizada após 30 minutos do término da segunda etapa. Os ratos foram colocados na caixa, onde um dos objetos manteve sua posição inicial (antigo), enquanto a localização do outro objeto foi alterada (novo). Na fase de teste, a memória de curto prazo e a memória espacial foram mensuradas com base no Índice de Discriminação, representado pela fórmula: (TN – TF)/(TN + TF), sendo TN o tempo explorando o objeto novo, e TF o tempo explorando o objeto antigo. Os resultados mostraram que na fase de familiarização, os grupos não apresentaram diferenças significantes no tempo de exploração dos objetos A1 e A2, bem como no tempo total de exploração. Na fase de teste, o grupo escopolamina apresentou um Índice de Discriminação menor em comparação ao grupo controle e aos demais grupos, demonstrando prejuízo na memória espacial e na memória de curto prazo, causadas pela DA induzida por escopolamina.

3.6. Estreptozocina

A estreptozocina tem ação inibidora na secreção e recepção de insulina, sendo ministrada na indução de diabetes em modelos animais não-humanos, devido a sua reação hiperglicêmica no organismo (Nazem, Sankowski, Bacher, & Al-Abed, 2015). A injeção intracerebroventricular dessa substância resulta na resistência à insulina e na deficiência no metabolismo da glicose no cérebro; estresse oxidativo, a hiperfosforilação da proteína Tau e a formação dos agregados Aβ, ocasionando as disfunções sinápticas e a morte neuronal (Nazem, Sankowski, Bacher, & Al-Abed, 2015).

Disfunções cognitivas podem ser evidenciadas em experimentos utilizando ratos com DA induzida por estreptozocina (Guo et al., 2017; Moreira-Silva et al., 2018). Por exemplo, Cevik et al. (2017) realizou um experimento com ratos modelos da DA induzidos por estreptozocina, a fim de investigar os efeitos neuroprotetores da eritropoietina na DA. Os animais foram divididos inicialmente em 3 grupos: grupo estreptozocina, possuindo 12 sujeitos administrados com estreptozocina; grupo de cirurgia placebo, o qual recebeu injeção intracerebroventricular de salina; e o grupo controle, que não foi submetido a tratamentos, nem procedimentos cirúrgicos. Após 5 dias, o grupo estreptozocina foi dividido em 2 grupos, no qual um deles recebeu injeção de salina, e o outro, foi tratado com eritropoietina, durante 2 semanas. Ao término do período de tratamento, foi realizado o teste de Esquiva Passiva com os sujeitos. O desempenho da capacidade de memória e aprendizado foi mensurado com base na duração do tempo de permanência dos animais até saírem do compartimento claro para o escuro (tempo de latência). Os resultados mostraram que o grupo administrado com estreptozocina e salina obteve danos em suas funções cognitivas, apresentando menor tempo de latência em comparação aos demais grupos.

3.7. Homocisteína

A hiper-homocisteinemia apresentou-se possivelmente neurotóxica devido a sua relação com a atrofia cerebral em idosos (Sachdev, 2004). Embora os sintomas de atrofia cerebral sejam independentes da DA, pacientes com altos níveis de Homocisteína (HCY) podem apresentar maiores riscos de desenvolver a patologia, enquanto sujeitos já acometidos pela DA podem ser vulneráveis à progressão da doença, em consequência do aumento de PN e emaranhados neurofibrilares causados pela HCY (Vilaça et al., 2015).

A neurodegeneração gerada pela hiper-homocisteinemia pode resultar em declínios na capacidade de aprendizagem e memória, tal como evidenciado em experimentos utilizando ratos com DA induzida por HCY (Zeng et al., 2018). Um exemplo disso foi um estudo realizado com a finalidade de investigar os efeitos da Moringa oleifera sobre a DA induzida por hiper-homocisteinemia (Mahaman et al., 2018). Foram utilizados 84 ratos machos (Sprague-Dawley), os quais foram divididos igualmente em 7 grupos: grupo controle, grupo controle positivo, grupo HCY, grupo de baixa prevenção, grupo de alta prevenção, grupo de baixo tratamento e grupo de alto tratamento. Os grupos controle e HCY receberam doses de salina; o grupo controle positivo recebeu doses de SCR1693; os grupos de baixo e alto tratamento foram administrados, respectivamente, com baixas e altas doses do extrato de Moringa oleifera; enquanto os grupos de baixa e alta prevenção receberam, respectivamente, baixas e altas doses de Moringa oleifera, simultaneamente com doses de HCY. Durante os primeiros 14 dias, os grupos HCY, controle positivo e os grupos de baixo e alto tratamento receberam injeções de HCY; o grupo controle recebeu uma injeção de salina, enquanto os grupos de baixa e alta prevenção não receberam nenhuma administração. Nos 14 dias finais que se seguiram, o tratamento foi realizado por meio de gavagem.

O desemprenho cognitivo dos animais foi mensurado com base no teste do Labirinto Aquático de Morris. O treinamento foi realizado seis dias antes dos 14 dias finais do tratamento por gavagem, e o teste foi executado um dia antes do último dia de tratamento. Os resultados mostraram que o grupo HCY obteve aumento na latência de escape durante o período de treinamento, em comparação ao grupo controle. Na fase de teste, o grupo HCY permaneceu apresentando a maior latência de escape. Além disso, o grupo HCY obteve o menor número de cruzamentos e menor tempo de permanência no quadrante-alvo, em relação ao grupo controle e aos demais grupos. Esses resultados indicam que os danos na capacidade de memória e aprendizado ocasionados pela DA foram produzidos pela hiper-homocisteinemia.

Todas as substâncias encontradas no levantamento realizado para o presente estudo, assim como as principais implicações neurológicas negativas causadas por cada substância e os testes cognitivos usados para avaliar a funções cognitivas no modelo animal não-humano, são apresentadas na tabela a seguir. Apenas 13 dos 44 artigos pesquisados são citados na tabela.

4. Considerações Finais

Por ser uma potencial ameaça ao envelhecimento saudável da população mundial, a DA tem sido estudada com o objetivo de compreender melhor a sua etiologia e também de buscar a cura ou a inibição de sua progressão. O presente estudo investigou as substâncias ministradas em pesquisas para a simulação da DA em ratos e verificou que, de 44 artigos, a substância mais utilizada na indução da DA foi a beta-amiloide, utilizada em 21 estudos. A preferência por esta substância se deve, provavelmente, pela sua relação direta com as causas da DA. Apesar do possível sucesso na simulação e tratamento da DA em modelos animais não-humanos, não houve progresso na cura da patologia em humanos. Determinados aspectos da DA ainda permanecem incompreendidos, afetando a eficiência do desenvolvimento da reversão ou tratamento dos casos. Portanto, perdura a necessidade de se continuar investigando a DA, tal como na seleção e aperfeiçoamento de métodos de indução da patologia para fins de experimentação.

Gratidão

Os autores agradecem o apoio fornecido ao presente estudo pelas Faculdades Integradas do Vale do Ribeira – FVR.

Referências

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