1. Introdução

A bovinocultura apresenta grande destaque na economia brasileira, de forma que o Brasil possui o segundo maior rebanho bovino do mundo, sendo responsável por 15,4% da produção global de carne bovina e 35 bilhões de litros de leite ao ano (IBGE, 2016).

As hemoparasitoses são enfermidades que representam aspectos limitantes ao crescimento da bovinocultura mundial, sendo a tristeza parasitária bovina (TPB), doença infecciosa e parasitária que mais gera prejuízos ao rebanho mundial. A mesma é transmitida pelo carrapato Rhipicephalus microplus, que tem como agentes etiológicos a Babesia spp. e Anaplasma spp. (Uribe, 2017).

Almeida et al. (2006) em um estudo realizado na região sul do Brasil, abrangendo aproximadamente 2.630.000 cabeças de gado, observaram que as perdas econômicas causadas pela TPB foram cerca de 6.220 cabeças por ano, totalizando um prejuízo de R$ 3.732.000,00. Já, Grisi, Massard, Moya-Borba & Pereira (2002) descreveram que os prejuízos causados pela TPB podem chegar a 500 milhões de dólares ao ano.

Guglielmone et al. (1999) observaram que a maior parte das perdas econômicas (62%) decorrentes da babesiose ocorreu pela morte e tratamento dos bovinos doentes, seguido de gastos com controle de ectoparasitas, medicamentos, testes para diagnóstico e contratação de médicos veterinários. Dessa forma, o diagnóstico e tratamento precoce seriam fundamentais para minimizar os prejuízos.

O diagnóstico da babesiose e anaplasmose bovina pode ser realizado por técnicas de biologia molecular como a Reação em cadeia da polimerase (PCR), testes sorológicos como o Imunofluorescência Indireta (Romero et al., 2016) e Imunoensaio Enzimático (ELISA) (Eichenberger et al., 2017).

Entretanto, os métodos citados acima, são de alto custo, demandando grande aparato laboratorial, sendo muitas vezes inviáveis para a realização em pequenas propriedades rurais. Dessa forma, métodos diretos como a observação dos protozoários em esfregaço sanguíneo, capa leucoplaquetária e esfregaço de ponta de orelha, seriam técnicas de suma importância, pois além de apresentarem baixo custo, podem ser realizados pelo veterinário a campo, otimizando o diagnóstico de hemoparasitoses em bovinos (Stobbe, Chaplin, Paiva, Araújo & Silva, 1988).

De acordo com Osaki et al. (2002) e Santos (2013) as hemácias parasitadas se tornam pouco flexíveis e são retidas por mais tempo na luz dos vasos de menor calibre, dessa forma, os eritrócitos parasitados são direcionados ao endotélio capilar, tornando o esfregaço de sangue de ponta de orelha o método padrão ouro para o diagnóstico. Bock, Jackson, De vos e Jorgensen (2004) e Kocan, De la fuente, Blouin, Coetzee & Ewing (2010) também apontam a observação direta em lâmina confeccionada com sangue da ponta de orelha de animais em fase aguda da infecção, como o melhor método direto para o diagnóstico de TPB.

Farias (1995) aponta que na fase aguda da doença ocorre a presença em grande quantidade de parasitas vivos no sangue, sendo os mesmos facilmente visualizados nos eritrócitos bovinos, por meio do esfregaço sanguíneo obtido de coletas da veia jugular.

A capa leucoplaquetária é obtida após a centrifugação do sangue com (ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA). Esta camada se localiza entre o compactado de hemácias e plasma, sendo composta por células nucleadas, plaquetas e até mesmo eritrócitos (Thrall, Weiser, Allison, & Campbell, 2015). Por conter as células alvo de hemoparasitas, a confecção e análise do esfregaço da capa leucoplaquetária, é bastante utilizada pelos médicos veterinários na visualização de hemoparasitas (Harrus & Waner, 2011).

Devido a grande incidência de TPB no rebanho bovino mundial, levando a inúmeros prejuízos econômicos que poderiam ser evitados com o diagnóstico precoce da enfermidade, o objetivo do presente estudo, foi comparar três métodos de observação direta: esfregaço sanguíneo, esfregaço de ponta de orelha e capa leucoplaquetária, buscando o melhor método para o diagnóstico de Babesia spp. em bovinos .

2. Materiais e métodos

Com a aprovação do Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade Federal do Espírito Santo, (CEUA – nº 25/2018), foram utilizados 77 bovinos, com raça, idade e sexo distintos, provenientes de propriedades localizadas nos municípios de Vargem Alegre em Minas Gerais, Alegre e Itapemirim no Espírito Santo, com suspeita de TPB.

As coletas foram realizadas em diferentes horários do dia. Para a confecção do esfregaço de ponta de orelha, foi realizado a perfuração do local, longe dos vasos sanguíneos mais calibrosos, sendo adicionada uma gota em lâmina de microscopia e realizado o esfregaço. Foi realizada higienização do local e tricotomia previa.

Para confecção do esfregaço de sangue da jugular, capa leucoplaquetária e hemograma, as amostras sanguíneas foram obtidas por punção da veia jugular em sistema de coleta a vácuo utilizando tubos com EDTA. Os tubos com EDTA foram acondicionados em caixa de isopor com gelo, e encaminhados ao Laboratório de Patologia Clínica do Hospital Veterinário. Todas as análises hematológicas foram realizadas de acordo com o preconizado por Thrall et al. (2015).

As amostras de sangue ao chegarem no laboratório, foram colocadas no homogeneizador Modelo MC II (DELLTA^®) durante aproximadamente cinco minutos. Após este tempo as mesmas foram destinadas ao contador hematológico automatizado (Mindray^® BC – 2800 Vet^®) e posteriormente eram confeccionados os esfregaços sanguíneos.

Para a obtenção da capa leucoplaquetária, a separação dos constituintes sólidos do sangue foi realizada a centrifugação do sangue a 2000 gpm (giros por minuto) por cinco minutos em centrífuga de tubos (CELM^®). Com o auxílio de pipetas, parte da capa leucoplaquetária foi coletada e depositada em lâmina para realização do squash.

As lâminas de esfregaço sanguíneo de ponta de orelha e jugular, assim como as lâminas confeccionadas com a capa leucocitária, foram fixadas em metanol e coradas por corante tipo panótico (Laborclin^®). As leituras foram realizadas em microscópio óptico (Olympus CX41^®), no aumento de 1000x, buscando por inclusões em hemácias sugestivas de Babesia spp. As avaliações foram realizadas sempre por um observador experiente e conferidas por um segundo avaliador, ambos médicos veterinários residentes.

Os dados foram tabulados, submetidos a análise de estatística descritiva, e posteriormente analisados pelo teste de Fisher. Posteriormente, foi calculada a sensibilidade, especificidade e coeficiente de concordância kappa. Todas as análises foram realizadas no programa estatístico GraphPad Prism 5.0^®, a 5% de significância, considerando o teste de ponta de orelha como padrão ouro.

3.

A análise das 77 amostras de sangue dos bovinos apontou 14,30% dos animais (n=11) como positivos para babesiose. Assim, como demostrado na imagem (Figura 1), foram observadas inclusões sugestivas de Babesia sp. em eritrócitos, na avaliação por microscopia de lâminas com esfregaço sanguíneo.

O diagrama foi utilizado com intuito de organizar as informações e dados obtidos na pesquisa,facilitando o entendimento dos resultados (Figura 2), sendo que dos animais positivos(n=11), 36,37%(n=4)foram positivos apenas no esfregaço sanguíneo obtido de amostra sanguínea da jugular,9,09%(n=1)foi positivo apenas na capa leucoplaquetária e 54,54% (n=6),foram diagnosticados por associação entre as técnicas.

No entanto, o esfregaço de ponta de orelha sozinho não foi capaz de diagnosticar a enfermidade em nenhum dos animais. Resultado próximo ocorreu com Vasconcelos (2010) em pesquisa realizada com cães, em que se diagnosticou apenas 1,6% dos animais por meio do método direto em esfregaço de sangue periférico retirados da ponta de orelha ou coxins, entretanto, foram visualizados os piroplasmas nos esfregaços de sangue total desses cães.

Valente (2014) diagnosticou uma pequena parcela dos animais através dos métodos diretos. Dos 93 cães utilizados, apenas 12,9%, foram tidos como positivos na pesquisa parasitológica direta em franja de esfregaço sanguíneo, capa leucoplaquetária e esfregaço de sangue obtido da ponta de orelha, além de outras técnicas. Ocorreu positividade maior em esfregaço sanguíneo periférico (ponta de orelha) (5,1%), seguido da capa leucoplaquetária (2,2 %) e apenas 1,1% em franja de sangue obtido de punção da veia jugular, resultado diferente do obtido neste trabalho, onde maior positividade ocorreu no esfregaço sanguíneo obtidos da veia jugular.

Leal, Moraes, Barbosa & Lopes (2015) ao associar a técnica de observação em esfregaço sanguíneo com a realização da capa leucoplaquetária, identificou a presença da Babesia canis vogeli em 6,86% dos cães, indicando que a junção agregou na obtenção dos resultados. Porém, apenas 18,18 % dos animais apresentaram-se positivos tanto capa leucoplaquetária como no esfregaço de sangue total e apenas 9,09 % por associação das técnicas.

Entretanto, como apresentado na Tabela 1:

O coeficiente de concordância obtido no presente trabalho, por meio do teste kappa, mostrou fraca conciliação entre o método de observação pelo esfregaço de sangue obtido na ponta de orelha, considerado nesta pesquisa como padrão ouro, com o esfregaço sanguíneo coletado na veia jugular (k= 0,18) e também com a capa leucoplaquetária (k = -0,12).

O longo intervalo de confiança e o valor de p observado indicam fraca associação entre os métodos, porém, acredita-se que os resultados encontrados foram ao acaso e o mesmo não deve ser generalizado para uma população. Além disso, o fato de o teste padrão ouro ter apresentado resultados inferiores as demais técnicas influenciou nos valores de sensibilidade e especificidade.

Outras intercorrências podem ser responsáveis pelos resultados obtidos, tais como o número de de animais avaliados, o número de animais positivos, assim como a ausência de um grupo controle utilizando a técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) como padrão ouro para o diagnóstico.

Valente (2014) comparou as técnicas de diagnóstico direto com os resultados do PCR e concluiu que todos os positivos na técnica de observação direta, também eram positivos no PCR, o que demostra que quando realizado por profissionais qualificados, o diagnóstico direto obtido é confiável. Entretanto, houve alguns falsos negativos, fato que demostra que o PCR deve ser utilizado, quando houver suspeita clínica específica de babesiose aguda e os resultados das técnicas diretas forem negativos ou em fase de convalescência da doença.

Cassini et al. (2011) por sua vez, diagnosticaram 21,6% dos animais avaliados em seu estudo como positivos no PCR e apenas 6,5% desses, foram considerados parasitados por métodos diretos. Desse modo, os resultados apresentados indicam que o método de observação direta em esfregaço diagnostica uma parcela dos animais, mas subestima a real ocorrência da enfermidade.

Além dos fatores já citados acima, o curso da doença na qual os animais foram avaliados, assim como o grau de infecção, e o momento da coleta do material analisado, podem ter influenciados nos resultados.

Isso ocorre, pois, a sensibilidade dos testes diretos é geralmente maior na fase aguda da doença, além desses animais apresentarem picos febris no final do dia, estando esses fatores estritamente relacionados a parasitemia no sangue e a observação dos protozoários (Bohm, Leisewitz, Thompson, & Schoeman, 2006).

Corroborando a isso, alguns bovinos apresentavam sinais clínicos clássicos da enfermidade e ao analisar os esfregaços não foram observadas inclusões sugestivas de hemoparasitoses, o que pode ser explicado pela coleta do material ter ocorrido em diversos momentos do dia e não nos picos febris ao final do dia.

Além disso, o contato do sangue utilizado para realizar os esfregaços de sangue obtido da jugular e capa leucoplaquetária com o EDTA e o fato das amostras terem sido armazenadas sob refrigeração, também pode ser um fator de considerável interferência nos resultados obtidos. Uma vez que, tais condições contribuem para uma menor visualização dos agentes etiológicos, tento em vista o desprendimento da inclusão devido ao contato com o anticoagulante (Otranto et al., 2011; Leal, Flausino & Lopes, 2012; Thrall et al., 2015).

4. Conclusões

A realização do esfregaço sanguíneo, mostrou-se o método com melhores resultados, quando comparado às demais técnicas, para o diagnóstico de babesiose em bovinos na rotina dos médicos veterinários. Como próximo passo, sugere-se a realização de estudo acrescido de outros métodos de diagnóstico como o PCR, sobretudo em suspeita de infecções subclínicas e crônicas.

Referências

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