INTRODUÇÃO

O desenvolvimento e a propagação da resistência aos antibióticos entre bactérias são considerados uma ameaça para a saúde humana e ambiental. Muitos estudos têm demonstrado a importância de cenários ambientais, como por exemplo, água e solo, no ciclo da resistência aos antibióticos na natureza^1,2.

As águas residuais provenientes de hospitais e encaminhadas para a estação de tratamento de efluente hospitalar (ETEH) contêm em sua composição altas concentrações de bactérias, nutrientes, oxigênio, produtos químicos, metais pesados, agentes antimicrobianos e outras drogas não metabolizadas³. Esse ambiente proporciona o aumento da pressão seletiva e, com isso, a transferência horizontal e a disseminação de genes de resistência e de organismos resistentes para o meio ambiente^4,5,6.

Dentre as bactérias encontradas em efluentes hospitalares, a Pseudomonas aeruginosa se destaca como um patógeno nosocomial oportunista geralmente envolvido em infecções hospitalares⁷. É conhecido não só por seu metabolismo versátil, mas também por sua excepcional capacidade de se adaptar e colonizar uma ampla variedade de ambientes (águas, solo, rizosfera, animais). Além disso, sua resistência natural (intrínseca) e adquirida a uma ampla gama de agentes antimicrobianos resulta no surgimento de cepas resistentes a múltiplos fármacos^8,9. Essa multirresistência tem sido extensivamente descrita e envolve diferentes mecanismos, tais como sistemas bombas de efluxo, baixa permeabilidade da membrana, alteração do alvo do agente antimicrobiano, alteração de proteínas da membrana externa, produção de β-lactamases e outras enzimas^6,10.

No Brasil, estudos referentes à avaliação de perfis de suscetibilidade aos antimicrobianos em isolados bacterianos de efluentes hospitalares revelaram a presença de linhagens multidroga resistentes em todas as etapas do sistema e até mesmo após o tratamento^1,6,11,12. Além disso, outro estudo revelou a presença de cepas produtoras de enzimas β-lactamases de espectro estendido (ESBL), Klebsiella pneumoniae carbapenemases (KPC) e metalo β-lactamases (MBL)¹³. Miranda et al.¹¹ detectaram os genes blaSHV, blaCTX-M-1, blaCTX-M-2 e blaTEM, blaVIM, blaSPM e blaKPC em isolados clínicos e na ETEH de um mesmo hospital. O gene blaSPM-1 é o mais prevalente no Brasil, sua disseminação epidemiológica em amostras ambientais no sul do Brasil foi confirmada em isolados de P. aeruginosa de um efluente hospitalar e em água superficial do rio receptor¹⁴.

Problemas associados à baixa suscetibilidade microbiana aos antibióticos datam de longo tempo. A resistência às sulfonamidas surgiu logo após sua introdução na prática clínica (1930) e pode ter sido resultado de mutações no sitio-alvo ou por aquisição de genes de resistência à antissintetase (sul)^15,16. Essa resistência é primariamente mediada pelos genes sul1, sul2 e sul3 que codificam a dihydropteroate synthetase (DHPS) e que apresenta baixa afinidade às sulfonamidas^17,18. Diversas espécies bacterianas abrigam esses genes, localizados em transposons ou em plasmídeos autotransfetíveis ou mobilizáveis com ampla gama de hospedeiros; eles apresentam resistência antibiótica múltipla, que é cosselecionada por sulfonamidas^19,20.

O gene sul1 faz parte do segmento 3´ conservado do integron de classe 1, enquanto o gene sul2 aparece associado com genes que conferem resistência à estreptomicina. Em alguns estudos, 70% da resistência à sulfonamida poderiam ser conferidas a esses genes²¹. Posteriormente, a disseminação de sul3, detectado em uma cepa de Escherichia coli na Suíça, parece estar relacionado com transposons²². O sistema integron/cassete é tido como um dos melhores exemplos de captura e expressão de novos genes^23,24, ocupando lugar de destaque na pesquisa de resistência aos antibióticos e biocidas^25,26.

A resistência bacteriana aos antibióticos é um problema global e vem progressivamente aumentando com o uso indiscriminado e crescente de substâncias com ação antimicrobiana. Em contrapartida, a resistência aos biocidas é uma questão emergente, uma vez que essas substâncias são amplamente utilizadas na descontaminação, desinfecção e esterilização visando o controle da disseminação de microrganismos^27,28.

Dentre essas substâncias, os compostos quaternários de amônio (QAC) são utilizados rotineiramente como antissépticos e desinfetantes em ambientes domésticos, veterinários, industriais e hospitalares^29,30. Esses compostos são biodegradáveis em condições aeróbicas e, assim, suas concentrações nos diversos ambientes podem flutuar continuamente. No esgoto, efluentes de estação de tratamento de esgoto, águas superficiais e sedimentos geralmente encontram-se em concentrações subinibitórias, tornando esses ambientes seletivos, o que pode resultar na emergência e disseminação de microrganismos com suscetibilidade diminuída a esses compostos entre diferentes gêneros microbianos, incluindo patógenos de interesse médico³¹.

Dentre os mecanismos de resistência aos QAC, a expressão de bombas de efluxo por P. aeruginosa pode abranger sistemas de efluxo multidroga, incluindo as proteínas QacE e QacEΔ1. O gene qacEΔ1 está incluído no segmento conservado 3’ do integron de classe I, inicialmente descrito como uma variante do gene qacE³².

Até o momento, diversos genes qac foram descritos, como qacA, qacB, smr (antigos qacC e qacD), qacE, qacF, qacG, qacH, qacJ e qacZ. Em bactérias Gram-negativas, como enterobactérias e P. aeruginosa, o gene qacE (incluindo a variante atenuada qacEΔ1) é amplamente difundido. Esses genes também podem ser encontrados em outras espécies, como Aeromonas spp., Vibrio spp. e Acinetobacter spp³³. Isto se deve à alta prevalência de integrons de classe I, que em bactérias Gram-negativas geralmente incluem o gene qacEΔ1³⁴. Desta forma, existe a preocupação de que a exposição de microrganismos a compostos quaternários de amônio pode selecionar isolados resistentes a diversos antimicrobianos, favorecendo o surgimento de cepas multirresistentes^27,35. Publicações recentes descrevem o aumento nos níveis de resistência associados aos genes qac, demonstrando a diminuição do poder de eficácia de compostos como cloreto de benzalcônio e clorhexidina^36,37. Além disto, os genes qacEΔ1 e qacE têm sido detectados em águas superficiais³⁸ e em ambientes poluídos com QAC³⁹.

Este estudo teve como objetivo avaliar os perfis de resistência aos antibióticos em P. aeruginosa isoladas de uma ETEH e investigar a presença de genes de resistência aos compostos quaternários de amônio e sulfonamidas (qacE, qacEΔ1 e qacE∆1-sul1) associados ao cassete de genes do integron de classe I.

MÉTODO

Local de estudo e obtenção de amostras

O estudo foi realizado na ETEH que atende um complexo hospitalar localizado na Barra da Tijuca, no Rio de Janeiro, Brasil (22°59’42.36’’S 43°21’49.62’’O). Este complexo é formado por duas unidades de saúde que possuem um total de 322 leitos e realizam 30 mil atendimentos mensais. A estação de tratamento deste complexo tem capacidade para tratar 220 m³ de esgoto por dia. A coleta foi realizada em dezembro de 2010, quando foram retiradas alíquotas (500 mL de cada ponto) dos cinco pontos correspondentes às etapas do tratamento do efluente (Figura 1). As alíquotas foram coletadas em frascos estéreis de polietileno, refrigeradas a 4°C e transportadas para o laboratório.

Dosagens dos parâmetros físicos e químicos

Os parâmetros físicos e químicos, temperatura, pH, condutividade, oxigênio dissolvido (OD), turbidez, salinidade e cloro das amostras foram analisados utilizando os equipamentos portáteis Water Quality Checker U-10 (Horiba) e medidor de cloro (Homis), respectivamente.

Detecção de antimicrobianos por cromatografia

A metodologia de extração das sulfonamidas foi baseada no método oficial da United States - Environmental Protection Agency (U.S. EPA) - Método 1694⁴⁰ e no método descrito por Monteiro et al.⁴¹. Uma alíquota de 25 mL de amostra filtrada foi acidificada com HCl concentrado para ajuste do pH a 2,5. Em seguida foram adicionados 25 mg de Na₂EDTA e prosseguiu-se para a etapa de extração por fase sólida, empregando-se cartuchos Oasis HLB 500 mg/6 mL (Waters, Millford, MA), previamente condicionados com 5 mL de metanol, 5 mL de água ultrapura e 5 mL de água acidificada com HCl concentrado a pH 2,5. Após uma lavagem com duas porções de 2,5 mL de água ultrapura para eliminação de interferentes, aplicou-se vácuo por 2 minutos para secar o cartucho na pressão de aproximadamente 35 kPa e, em seguida, os analitos foram eluídos com duas porções de 3 mL de metanol e em seguida com duas porções de 2 mL de solução de metanol:acetona (1:1, v/v). Cinco mL do eluato foram separados para análise das sulfonamidas e evaporados à secura com N₂ à temperatura de, no máximo, 47,5°C. O extrato seco contido no tubo de centrífuga foi reconstituído com 1 mL do solvente de reconstituição (80:20 [v/v] de 0,1% v/v de ácido fórmico em água e metanol). Em seguida, foi agitado em vórtex, filtrado em filtro de fibra de vidro/nylon 0,2 µm e transferido para vial, para injeção no sistema de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Acoplado à Espectrometria de Massas Sequencial (LC-MS/MS)⁴¹. O sistema de LC-MS/MS é composto de cromatógrafo a líquido de alta eficiência Shimadzu Prominence (com os seguintes módulos: bomba quaternária LC-20AD, desgaseificador de membrana DGU-20A5, autoamostrador SIL-20AC, forno de coluna CTO-20AC e controladora CBM-20A) e detector API5000 Applied Biosystems/MDS Sciex com fonte Turbo V® e sonda TurbolonSpray®, controlado pelo software Analyst versão 1.4.2 do mesmo fabricante. Os antimicrobianos foram separados a 25°C em coluna C18 (Pursuit™ RS, 2,0 mm x 100 mm x 3 µm – Agilent), com coluna de guarda do mesmo tipo (2,0 mm x 3 µm). As fases móveis utilizadas no programa de eluição gradiente foram 0,1% v/v de ácido fórmico em água (fase móvel A), 0,1% v/v de ácido fórmico em acetonitrila (fase móvel B) e 0,1% v/v de ácido fórmico em metanol (fase móvel C). A programação de eluição gradiente, bem como os parâmetros do espectrômetro de massas encontram-se descritos em Monteiro et al.⁴¹.

Isolamento e identificação bioquímica de P. aeruginosa

Após homogeneização, alíquotas de 2 mL, de cada ponto da ETEH foram inoculadas em 5 mL de caldo nutriente e incubadas por 24 h a 37°C. A alíquota da etapa ETEH 1 também foi inoculada em meio de cultura líquido Letheen (DIFCO™) e incubada por 72 h a 37°C. Em seguida, as culturas bacterianas foram semeadas por esgotamento em ágar nutriente e ágar cetrimide (DIFCO™), e incubadas nas mesmas condições. A coloração de Gram e provas bioquímicas convencionais foram realizadas para identificação das cepas, de acordo com o Manual Bergey’s⁴². Bastonetes Gram-negativos (BGN) foram submetidos às seguintes provas bioquímicas: Sulfureto, Indol e Motilidade (SIM), catalase, oxidase, OF-glicose, xilose, manitol, lactose, lisina, arginina, ornitina descarboxilase, gelatina e incubação a 42°C.

Extração de DNA e identificação molecular

Os isolados, previamente identificados fenotipicamente foram certificados por metodologia molecular. A extração do DNA genômico foi realizada utilizando o kit Dnaeasy® Blood&Tissue (Qiagen GmgH, Hilden, Germany), de acordo com as instruções do fabricante. A identificação de isolados foi confirmada pela amplificação do gene que codifica a subunidade 16S do rRNA específico de P. aeruginosa. As reações foram realizadas com 50 µL de mistura de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) nas seguintes condições: 50 ng de DNA molde, 50 pmol de cada iniciador (PA-SS-F e PA-SS-R) descritos por Spilker et al.⁴³, 0,2 mmol.l^-1 de cada desoxinucleotídeo trifosfatado (dNTPs), 1X PCR buffer (pH 9,0), 2,5 mmol.l^-1 MgCl₂ e 2U de Taq Platinum DNA Polymerase (Invitrogen) (Tabela 1). Foram utilizadas como controle das PCR as cepas de referência P. aeruginosa INCQS 0024 (ATCC 29336) e E. coli INCQS 0033 (ATCC 25922). Os produtos da PCR foram analisados após eletroforese por 1 h a 50 V em gel de agarose 1% no tampão Tris-Borato-EDTA (TBE) 0,5X, que foi corado com brometo de etídio (3 mg/mL). Utilizou-se o 100 bp DNA ladder (Invitrogen) como padrão de peso molecular. Após a eletroforese, a imagem do gel foi visualizada pelo software de vídeo documentação ImageQuant 300 (GE Healthcare). A especificidade dos iniciadores e da PCR foi estabelecida anteriormente com cepas de referência. O fragmento foi purificado com o kit QIAquick PCR Purification (Qiagen) e sequenciado com o kit BigDye® Terminator Cycle Sequencing Standard Version 3.1 (Applied Biosystems^TM), por eletroforese capilar em aparelho ABI 3730 DNA Analyzer (Applied Biosystems^TM), na Plataforma do Programa de Desenvolvimento Tecnológico em Insumos para Saúde da Fundação Oswaldo Cruz (PDTIS/Fiocruz). A análise de similaridade das sequências foi realizada pelo programa BLASTn (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), no GenBank.

Suscetibilidade aos antibióticos

O perfil de suscetibilidade aos antibióticos foi determinado pela técnica de disco-difusão (método de Kirby-Bauer), segundo os critérios estabelecidos pelo Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI)⁴⁴. A turvação das suspensões utilizadas para testes de sensibilidade foi ajustada em solução salina estéril (NaCl 0,85%) para a obtenção do padrão de turbidez 0,5 na escala de McFarland e foram inoculadas em meio ágar Mueller-Hinton (DIFCO). Os isolados obtidos foram testados quanto à resistência frente a 13 antimicrobianos (CEFAR®). Os antibióticos empregados foram os seguintes: Piperacilina/tazobactam (PPT-110 µg), ticarcilina/ácido clavulânico (TIC-85 µg), ceftazidima (CAZ-30 µg), cefepime (CPM-30 µg), imipenem (IPM-10 µg), meropem (MER-10 µg), aztreonam (ATM-30 µg), gentamicina (GEN-10 µg), tobramicina (TOB-10 µg), sulfonamida (SUL-300 µg), ciprofloxacina (CIP-5 µg), norfloxacina (NOR-10 µg) e polimixina B (POL-300 UI). O controle de qualidade dos discos de antibióticos foi realizado usando-se as cepas de referência P. aeruginosa INCQS 00099 (ATCC 853), Staphylococcus aureus INCQS 00015 (ATCC 25923) e E. coli INCQS 00033 (ATCC 25922). Foram estabelecidos três padrões de resistência (Sensível – S, Resistente – R e Multidroga resistente - MDR) para os isolados analisados⁴⁵.

Detecção dos genes qacE, qacE∆1 e qacE∆1-sul1

A mistura da PCR teve o volume final de 50 µL contendo os seguintes reagentes: 50 ng de DNA molde, 50 pmol de cada iniciador (Tabela 1), 0,2 mmol.l^-1 de cada dNTP, 1X PCR buffer (pH 9,0), 1,5 mmol.l^-1 MgCl₂ e 1U de Taq Platinum DNA Polymerase (Invitrogen). Os programas utilizados para cada iniciador estão descritos na Tabela 1. Foi utilizada como controle positivo do gene qacE∆1, P. aeruginosa 531-95²⁷(Genbank GU182337). O produto da PCR foi analisado em gel de eletroforese por 1 h a 50 V em gel de agarose 1% no tampão Tris-Borato-EDTA (TBE) 0,5X, que foi corado com brometo de etídio (3 mg/mL). Utilizou-se o 100 bp DNA ladder (Invitrogen) como padrão de peso molecular. Após a eletroforese, a imagem do gel foi realizada usando-se o software de vídeo documentação ImageQuant 300 (GE Healthcare).

RESULTADOS

Dosagem dos parâmetros físico-químicos

O pH das amostras apresentou variação entre 7,6 e 8,4. A condutividade variou entre 0,82 mS/cm e 0,35 mS/cm. O índice de turbidez apresentou maior índice no ponto 2 (99 UNT) em face da injeção de O₂ e o índice de oxigênio dissolvido (DO) iniciou em 4,5 mg/L, posteriormente manteve índices entre 9,2–9,3 mg/L e reduziu para 3,7 mg/L no efluente tratado. A concentração de cloro ativo iniciou em 1,0 ppm, e teve um aumento significativo no ponto onde houve a adição do composto químico. A temperatura e o nível de salinidade permaneceram iguais em todos os pontos (Tabela 2).

Detecção de antimicrobianos por cromatografia

O antimicrobiano sulfametoxazol foi identificado em duas amostras, uma do afluente hospitalar da ETEH e outra do efluente tratado, ambas em concentração inferior a 50 ng∙L¹ (limite de quantificação do método) (Figura 2a). A Figura 2b apresenta a injeção de uma solução padrão contendo o sulfametoxazol que também foi injetada no LC-MS/MS, para fins de comparação.

Isolamento de P. aeruginosa

Foram isoladas 21 cepas de BGN, móveis; H₂S, indol e lactose negativas; xilose variáveis; oxidativas; manitol, lisina, arginina, ornitina, gelatina, catalase e crescimento a 42°C positivas. A PCR das cepas de P. aeruginosa resultou na amplificação de um fragmento de 956 pb em 95% (20/21) das cepas.

Suscetibilidade aos antimicrobianos

A suscetibilidade aos antibióticos apresentou maiores percentuais de resistência às sulfonamidas e às quinolonas, seguido pelas outras três classes analisadas (Figura 3). A análise dos dados do antibiograma revelou 13 perfis de resistência distintos entre os isolados (Tabela 3). Quarenta e cinco por cento apresentaram o fenótipo MDR, destes 44% foram da etapa de cloração da estação (Figura 4).

Detecção dos genes qacE, qacEΔ1 e qacEΔ1-sul1

As 20 cepas de P. aeruginosa foram submetidos à PCR para verificar a presença dos genes qacE, qacEΔ1 e qacEΔ1-sul1. O gene qacE não foi detectado em nenhum dos isolados. No entanto, o gene qacEΔ1 foi verificado em 90% (18/20) dos isolados analisados apresentando um fragmento de 400 pb. Enquanto os genes qacEΔ1-sul1 amplificados em conjunto, apresentaram um fragmento único de aproximadamente 800 pb em 100% (20/20) das cepas. O fragmento da cepa P. aeruginosa P5520, utilizada como controle positivo da PCR, foi sequenciado e demonstrou identidade de 96%–98% com sequências do banco de dados. Esta sequência foi depositada no GenBank sob o número de acesso MF801598.

DISCUSSÃO

Os hospitais são considerados nichos ecológicos para bactérias resistentes aos antibióticos e desempenham um papel importante no surgimento e disseminação de resistência. Essas bactérias deixam hospitais por meio de pacientes colonizados e também através dos sistemas de tratamento de águas residuais⁴⁸.

No presente estudo, foram isoladas cepas de P. aeruginosa em todos os pontos de coleta da estação de tratamento de esgoto hospitalar, inclusive na etapa final na qual o efluente já se encontra tratado e apto a ser liberado para os corpos hídricos. Um fato intrigante foi a ausência de células viáveis de P. aeruginosa, na 1ª etapa da estação (chegada do afluente). Porém, a presença de crescimento bacteriano após cultivo em meio de cultura contendo inibidores de alguns princípios ativos de antissépticos e desinfetantes, nos permitiu constatar que os microrganismos estavam sob ação bacteriostática desses produtos e de outros antimicrobianos. Os QAC são um dos surfactantes mais utilizados na desinfecção do ambiente hospitalar e que quando liberados nos ambientes aquáticos apresentam ação antimicrobiana em concentrações relativamente baixas^49,50. Além da atividade bactericida e/ou bacteriostática, esses produtos podem aumentar a pressão seletiva e a resistência aos antibióticos e biocidas⁵¹.

Nossos resultados revelaram alta diversidade nos perfis de resistência e alta frequência de cepas MDR nas diferentes etapas do tratamento do esgoto hospitalar. O maior índice de cepas com fenótipo MDR no ponto da cloração, provavelmente está relacionado ao favorecimento da transferência de plasmídeos de resistência durante o processo de cloração, etapa crítica do tratamento. Desde a década de 1970, estudos sobre o efeito da cloração em bactérias resistentes aos antibióticos descrevem um aumento considerável de bactérias resistentes a múltiplos antibióticos na água e no esgoto^52,53,54. Além de apresentar o maior número de cepas MDR, no ponto ETEH 4 foi encontrado um isolado resistente a todos os antibióticos testados, inclusive à polimixina B, que é considerada altamente eficaz frente a cepas de P. aeruginosa, segundo o Programa de Vigilância Epidemiológica (SENTRY – 2001 a 2004)⁵⁵.

A presença de cepas MDR na etapa onde o efluente já se encontra tratado demonstra certa limitação do tratamento na eliminação desses patógenos. Essa limitação pode estar associada ao tamanho da população microbiana inicial, aos diferentes estágios de desenvolvimento do microrganismo, à concentração do desinfetante, ao potencial hidrogeniônico do efluente (pH) e ao tempo de exposição ao desinfetante⁵⁶. A avaliação da suscetibilidade aos antibióticos de Pseudomonas spp. em afluentes e efluentes de uma estação de tratamento de esgoto demonstrou a presença de cepas resistentes aos antibióticos carbapenêmicos somente no efluente tratado⁵⁷.

Nossos resultados demonstraram claramente que as condições físico-químicas do ambiente e a presença de antimicrobianos provavelmente afetaram os fenótipos de suscetibilidade aos antibióticos dessas bactérias. Além disso, sabe-se que os antibióticos em concentrações subinibitórias podem ter um impacto sobre as funções celulares e alterar a expressão de fatores de virulência ou a transferência de genes de resistência aos antibióticos⁵⁸.

Por outro lado, a baixa suscetibilidade observada frente às sulfonamidas (80%), seguida pela ciprofloxacina e norfloxacina (50%), merece destaque. Embora não tivéssemos informações sobre as prescrições terapêuticas nesses hospitais, a presença de uma sulfonamida, a sulfametoxazol, tanto no esgoto bruto quanto no tratado, observada em nossos dados nos permite sugerir que a utilização de altas concentrações desses antimicrobianos pode interferir na indução de mutações na enzima DNA girase ou na superexpressão do sistema de efluxo, contribuindo para essa resistência^17,59. As sulfonamidas também podem resistir fortemente à biodegradação natural, como refletido na alta frequência de sua detecção em ambientes aquáticos. Pesquisadores do U. S. Geological Service (USGS) demonstraram a detecção de sulfametoxazol em rios e córregos com frequências de até 27%⁶⁰. Além disso, sua baixa tendência para partição em sedimentos permite que eles sejam transportados por longas distâncias em águas correntes. Perez et al.⁶¹ realizaram a avaliação da degradabilidade da sulfamethazine, sulfametoxazol e sulfatiazol em amostras de águas superficiais. Após mais de um mês, as sulfonamidas não foram degradadas por microrganismos de águas superficiais em um reator de batelada.

Considerando a composição do esgoto hospitalar e a baixa suscetibilidade encontrada às sulfonamidas em nossos isolados (60%), resolvemos investigar a presença dos genes sul1, qacE e qacEΔ1, que conferem resistência à sulfonamida e aos QAC, respectivamente. Verificamos então que a detecção do gene sul1 não coincidiu com os resultados revelados pelo fenótipo, nos quais 80% dos isolados apresentaram resistência à sulfonamida e 100% deles apresentaram o gene sul1. Esse percentual de resistência pode ter ocorrido devido à ausência de expressão do gene sul1. Grape et al.⁶² demonstraram que dentre 105 isolados clínicos da família Enterobacteriaceae, 64 foram resistentes às sulfonamidas. O gene sul1 foi encontrado em 14 isolados, o gene sul2 em 23 isolados, os genes sul1 e sul2 foram simultaneamente detectados em 25 isolados e o gene sul3 foi encontrado somente em dois isolados.

A distribuição dos genes qacE e qacEΔ1 foi avaliada em isolados Gram-negativos de origem clínica e ambiental por Kazama et al.⁴⁶ O percentual de cepas positivas para esses dois genes em isolados clínicos de P. aeruginosa (n = 63) foi 65% para qacEΔ1 e 24% para qacE. Já em cepas ambientais de P. aeruginosa (n = 5) a distribuição foi de 40% para qacEΔ1 e nenhum para qacE. Outro estudo também detectou a presença de qacEΔ1 em 48% dos isolados clínicos de P. aeruginosa (n = 60), sendo encontrado em 88% das cepas MDR e em 35% das não multirresistentes, o que reforça a associação da presença deste gene com a multirresistência aos antimicrobianos²⁷.

O presente estudo demonstrou a presença dos genes qacEΔ1-sul1 em 100% dos isolados do esgoto hospitalar (45% MDR, 40% R e 15% S) e a ausência do gene qacE. Essa ausência, muito provavelmente, se deve à inserção do segmento contendo o gene de resistência à sulfonamida (sul1) próximo a região 3´ do gene qacE, transformando-o em qacEΔ1³².

Os genes qacEΔ1 e sul1 estão frequentemente associados a integrons classe 1^63,64,65. A associação desses genes em integron classe 1 foi detectada em 97% de isolados de bactérias do gênero Salmonella em Portugal⁶⁶. Assumindo que a presença desses genes sugere fortemente a presença de um integron de classe 1, podemos concluir que estes elementos estão amplamente distribuídos nas diferentes etapas do sistema de tratamento desse esgoto hospitalar.

Compostos à base de QAC estão frequentemente presentes em formulações de biocidas catiônicos. Assim sendo, o uso desses produtos pode ter um papel importante, porém indireto, na seleção de bactérias resistentes aos antibióticos⁶⁷. Genes de resistência aos QAC, especialmente relacionados às bombas de efluxo, são amplamente encontrados em estabelecimentos de assistência à saúde humana e animal. Bombas de efluxo específicas ou multidroga são importantes determinantes de resistência intrínseca e/ou adquirida aos antimicrobianos. Alguns desses elementos acomodam resistência a ambos antibióticos e biocidas. Este fato, ainda não bem compreendido, pode conduzir à seleção de organismos antibiótico-resistentes via seleção por biocidas^31,68.

A exposição a antibióticos, biocidas ou metais pesados e muitos outros fatores ambientais diferentes resulta em um aumento de células contendo integrons^39,69,70. Além disso, a exposição a diferentes antibióticos (aminoglicosídeos, β-lactâmicos, fluoroquinolonas, entre outros) facilita a recombinação de cassete de genes; envolvendo ocasionalmente a superexpressão da integrase IntI1 desencadeada pelo sistema SOS que induz a desativação de LexA^71,72. A tendência atual, de uso mais amplo e indiscriminado de biocidas, pode conduzir à emergência de novos elementos genéticos, com consequências imprevisíveis para o bem-estar humano².

É evidente que, embora exista uma compreensão geral sobre as origens, os mecanismos de aquisição e a disseminação de genes de resistência aos antibióticos nas populações microbianas, ainda faltam muitos detalhes a serem esclarecidos a esse respeito. Esses aspectos pouco esclarecidos, em grande parte, ocorrem porque os estudos se concentram principalmente nas propriedades de patógenos de origem clínica e pouco esforço tem sido despendido para estabelecer o comportamento de cepas ambientais.

CONCLUSÕES

De acordo com os resultados apresentados foi possível concluir que a presença de P. aeruginosa resistente aos antibióticos em todas as etapas da ETEH do complexo hospitalar estudado tem caráter relevante na avaliação da eficiência do tratamento biológico de efluentes hospitalares. A detecção do maior percentual de cepas MDR na etapa de cloração sugere aumento da transferência horizontal e a disseminação de genes e organismos de resistência.

A presença de cepas de P. aeruginosa resistentes e de MDR no efluente tratado indica que o tratamento apresentou limitações na eliminação desses patógenos e alerta para os riscos à comunidade local, uma vez que o destino final desse efluente é um complexo lagunar utilizado como recreação e pesca de subsistência.

Embora com limitações em função do número reduzido de cepas estudadas, os resultados obtidos são altamente impactantes, pois foram detectadas cepas microbianas resistentes a antibióticos utilizados no tratamento de infecções graves, como as cefalosporinas de quarta geração, drogas carbapenêmicas e até resistência à polimixina, um dos últimos recursos no arsenal terapêutico antimicrobiano.

Os dados obtidos no presente estudo colaboram com a interpretação da eficiência do tratamento do resíduo líquido hospitalar. Além disso, poderão contribuir com a Vigilância Ambiental em Saúde no que se refere ao desenho de ações preventivas aos impactos negativos desses efluentes nos sistemas aquáticos e na saúde pública.

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Declaração de interesses