Análise de limite de galactosamina em hexosaminas totais em amostras injetáveis de heparina sódica suína

Galactosamine limit analysis in total hexosamines in injectable porcine sodium heparin samples

As funções da vigilância sanitária não se restringem apenas à fiscalização do cumprimento da legislação sanitária e repreensões. A pesquisa é uma vertente pouco difundida e investida, porém sua importância se justifica na articulação das ações intersetoriais a fim de que se produza conhecimento e na busca de respostas aos diversos prejuízos relativos à saúde¹. Quando um determinado produto tem sua credibilidade e reputação fragilizada, as instituições reguladoras direcionam sua atenção para o tema com a finalidade de pesquisar o dano sanitário estabelecido². É o caso do produto biológico heparina, um dos polissacarídeos lineares com estrutura mais complexa da família dos glicosaminoglicanos, que inclui também o sulfato de condroitina (SC) e o dermatan sulfato (DS)³. A heparina possui propriedades anticoagulantes e antitrombóticas amplamente difundidas há mais de seis décadas. A extração comercial ocorre a partir da mucosa intestinal de suínos ou do tecido pulmonar de bovinos, entretanto, não são fármacos equivalentes. No final de 2007 e início de 2008, a confiabilidade deste produto biológico foi comprometida depois dos episódios relatados pela Food and Drug Administration (FDA), em que cerca de 350 casos de eventos adversos, devido ao uso de heparina suína fabricada pela empresa Baxter Healthcare Corporation nos Estados Unidos, foram registrados⁴. A investigação da composição das amostras suspeitas concluiu que existia teor de 20% de condroitina supersulfatada (OSCS) e mais de 1% em peso de DS. Autores apontam que a exposição a determinados vírus suínos desencadeia a produção de pequenas quantidades de OSCS, mas nada comparado a grande quantidade encontrada nestes lotes^5,6. Por meio da técnica de espectroscopia de ressonância magnética nuclear (RMN) foi elucidada a estrutura da OSCS, composta por unidades repetidas dissacarídicas de ácido D-glicurônico e N-acetilgalactosamina, ligadas da forma β (1 → 3), análoga ao sulfato de condroitina, porém com um padrão peculiar de sulfatação encontrado nas posições 2 e 3 do ácido glicurônico e em 4 e 6 da N-acetilgalactosamina⁷. Sabe-se que o SC é composto de ácido D-glicurônico ligado de forma β (1 → 3) à N-acetilgalactosamina, normalmente, sua estrutura possui um grupo sulfato nas posições 4 ou 6 na porção da N-acetilgalactosamina. Enquanto que o DS tem em sua estrutura ácido L-idurônico ligado β (1 → 3) à N-acetilgalactosamina, com grupos sulfatos presentes no carbono 2 do ácido urônico e no carbono 4 da N-acetilgalactosamina. A heparina é constituída principalmente de ácido L-idurônico e N-sulfoglicosamina ligados de forma β (1 → 4), altamente substituída com resíduos O-sulfato no carbono 6 dos resíduos de glicosamina e no carbono 2 dos resíduos de ácido urônico⁸. Na época, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa) liberou um informe no qual a empresa Baxter Healthcare Corporation notificava que os lotes envolvidos nos casos americanos não haviam sidos distribuídos ou comercializados no Brasil⁹. No entanto, ficou evidente a necessidade de procurar métodos seguros que pudessem atestar mais fielmente a qualidade do produto oferecido à população, levando os compêndios oficiais a atualizarem suas monografias de heparina. Neste contexto, a Farmacopeia Brasileira 5ª ed. contém monografias para heparina cálcica¹⁰ e sódica¹¹, cujo princípio ativo e finalidade são os mesmos, mas as duas são destinadas para matéria-prima e não para o produto acabado. Observa-se que as monografias pertencentes à Farmacopeia Brasileira 5ª ed.^10,11 são semelhantes à da Farmacopeia Europeia 8ª ed.^12,13, na qual há ausência de métodos para a forma injetável. Em contrapartida, a Farmacopeia Americana USP39-NF34 é mais abrangente a respeito de monografias para heparinas com formas farmacêuticas distintas: matéria-prima¹⁴ e injetável¹⁵. Entre os métodos cromatográficos abordados para a matéria-prima, encontra-se a análise de limite de galactosamina em hexosaminas totais, técnica de cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) com coluna de troca iônica e detecção amperométrica pulsada, também estudado por Itoh et al.¹⁶. Enquanto que, para heparina injetável, na Farmacopeia Americana USP39-NF34¹⁵, há ausência de métodos cromatográficos preconizados. Este fato nos mostrou a importância de desenvolver métodos, a fim de que haja abrangência no controle de qualidade tanto na matéria-prima quanto no produto acabado. O produto acabado possui peculiaridades que precisam ser avaliadas, como, por exemplo, a composição dos excipientes. Neste caso, as amostras de heparina sódica suína possuem como excipientes cloreto de sódio, ácido clorídrico, hidróxido de sódio, álcool benzílico e água para injeção, destes o sal é o mais problemático quando se trata de análise por cromatografia de troca iônica. Este excipiente pode concorrer pelo sítio de interação da fase estacionária com o analito, interferindo assim na análise, por isso as amostras necessitam passar por um tratamento de dessalinização a fim de que os sais presentes na formulação sejam removidos. Sendo assim, este trabalho teve como objetivos propor método de análise físico-química de limite de galactosamina em hexosaminas totais a partir do produto acabado de heparina sódica suína, bem como otimizar o preparo de amostra.

a solução previamente dessalinizada foram vertidos 100 µL para um recipiente e então a secagem foi realizada no SpeedVac por 4 h, sem aquecimento, com vácuo de 0,1 vac e temperatura do trap de -90°C. Após a secagem, os tubos utilizados foram pesados e a diluição aconteceu de forma a atender a proporção da Farmacopeia Americana USP39-NF34¹⁴, cuja relação é de 12,0 mg de heparina sódica para 5 mL de 5 N de ácido clorídrico. Estas soluções foram hidrolisadas por 6 h a 100°C e, ao esfriarem à temperatura ambiente, foram filtradas em membrana Milipore Millex 0,22 mm, em seguida diluídas com água purificada do Tipo I na proporção de 1:100.

A presença de OSCS e o alto teor de DS em uma amostra de heparina indicam má qualidade e o seu consequente descarte. Para a avaliação da presença ou ausência de OSCS e DS, pode-se utilizar o método de limite de galactosamina em hexosaminas totais. Neste método, a amostra é hidrolisada e convertida em monossacarídeos e espera-se encontrar apenas glicosaminas provenientes da estrutura da heparina, pois a galactosamina advém de impurezas como o DS e adulterantes como a OSCS. De forma relativa consegue-se quantificar o teor de galactosamina presente na amostra, a partir do sinal de glicosamina. A separação cromatográfica ocorre pelo fenômeno da troca iônica e a detecção é realizada pelas reações de oxirredução ocorridas entre o analito e a célula do detector amperométrico pulsado a partir de diferença de potencial empregado na análise. Cabe ressaltar que o padrão necessita passar pelo mesmo processo de hidrólise para que seja submetido as mesmas condições da amostra. O método contido na Farmacopeia Americana USP39-NF34 não obteve resultados que atendessem aos critérios de adequação do sistema do próprio compêndio, por isso eles não foram mostrados neste trabalho. O método abordado por Itoh et al.¹⁶ possui semelhanças com o da Farmacopeia Americana USP39-NF34¹⁴ em relação ao preparo da amostra, que, em ambos os casos, reporta-se à matéria-prima. A Tabela 2 reúne as principais diferenças entre os métodos, que envolvem basicamente, a fase móvel e a coluna cromatográfica.

Tabela 2
Principais diferenças entre os métodos para matéria-prima de heparina sódica presentes na Farmacopeia Americana e no trabalho de Itoh et al. 16

As colunas cromatográficas em questão são indicadas para separações com alta resolução de monossacarídeos e são funcionalizadas com resina trocadora de ânions de sal de amônio, no entanto a Carbo Pac PA1¹⁹ possui comprimento, diâmetro e tamanho de partícula superior aos da Carbo Pac PA20²⁰. Ao se tratar de monossacarídeos extremamente substituídos, a interação com partículas maiores é mais estabilizada do que com as menores, facilitando assim a separação cromatográfica. Segundo o fabricante do cromatógrafo líquido Thermo Fisher Scientific²¹, o qual reproduziu o método da Farmacopeia Americana USP39–NF34¹⁴, a substituição de hidróxido de potássio por hidróxido de sódio não causaria alterações nos resultados encontrados. Sendo assim, o sucesso deste método pode ser atribuído à coluna cromatográfica e à etapa de lavagem. A Figura 1 mostra a comparação entre cinco injeções da solução de adequação do sistema com o método adaptado de Itoh et al.¹⁶, no qual foram observados tempos de retenção de aproximadamente 7,75 e 9,50 min para galactosamina e glicosamina, respectivamente. Em algumas injeções, um sinal não identificado no tempo de 1,60 min pode ser detectado. Os dados foram tratados pelo Teste de Grubbs e a injeção 3 foi descartada por apresentar valores aberrantes (α = 0,05).

Figura 1
Resultado de cinco injeções de solução de adequação do sistema, onde o sinal em 7,75 min é referente a galactosamina e o sinal em 9,50 min referente a glicosamina

Os parâmetros de adequação do sistema para o método em questão seguiram os abordados na Farmacopeia Americana, com a finalidade de avaliar se o sistema cromatográfico está adequado para a análise. A Tabela 3 resume os dados para avaliação.

Tabela 3
Resultado dos parâmetros de adequação do sistema para o método de limite de galactosamina em hexosaminas totais

Para todos os critérios avaliados, o método foi aprovado e, portanto, apto a ser testado para as amostras. A Figura 2 mostra a comparação entre branco, solução de adequação do sistema, matéria-prima e amostras analisadas, na qual pode ser observado que o pico referente ao tempo de 1,60 min continua a ser detectado, levantando a hipótese de que pode estar relacionado com o ácido clorídrico utilizado para a hidrólise, pois se encontra não só no padrão, matéria-prima e nas amostras, como também no branco. Este pico não é detectado no trabalho de Itoh et al.¹⁶, mas foram observados sinais próximos ao volume morto nos estudos da Thermo Fisher Scientific²¹e de Restaino et al.²². Nos resultados da Thermo Fisher Scientific²¹, em que foi reproduzido o método da Farmacopeia Americana USP39-NF34¹⁴, assim como em Restaino et al.²², o qual estudou o comportamento cromatográfico de outras espécies de polissacarídeos hidrolisados, a hidrólise ocorreu nas mesmas condições deste trabalho, por isso, a detecção de sinais próximos ao volume morto, como o visto em 1,60 min, pode incontestavelmente ser atribuída ao ácido clorídrico. O pico de glicosamina permanece no tempo de retenção de 9,5 min, aproximadamente, em todos os casos. Na amostra 1 foi detectado pico proveniente da galactosamina no tempo de 7,75 min e, nas amostras subsequentes, nenhum pico no tempo de retenção da galactosamina foi detectado, portanto não foi possível encontrar galactosamina dentro do limite de detecção do método que é de 0,01 mg/mL.

Figura 2
Comparação entre (A) Branco; (B) Solução de adequação do sistema; (C) Amostra 1; (D) Amostra 2; (E) Amostra 3; (F) Matéria-prima de heparina sódica suína

Seguindo o critério de aceitação visto na Farmacopeia Americana USP39-NF34¹⁴ de ≤ 1% de limite de galactosamina em hexosaminas totais, foi possível avaliar a amostra 1, na qual os resultados de cinco injeções foram tratados por teste de Grubbs (α = 0,05) e nenhum valor aberrante foi encontrado. Os dados usados nas Equações 4 e 5 foram os resultados da média das injeções, sendo assim, PGALACTOSAMINA/PGLICOSAMINA seria a razão entre a resposta de galactosamina e glicosamina na solução de adequação do sistema; PA_{GALACCTOSAMINA} é a área do pico de galactosamina da solução de adequação do sistema; PM_{GALACTOSAMINA} é referente à massa de galactosamina da solução padrão; PM_GLICOSAMINA seria a massa de glicosamina da solução padrão; PA_GLICOSAMINA é a área do pico de glicosamina da solução de adequação do sistema; AA_{GALACTOSAMINA} é referente à área do pico de galactosamina da solução da amostra e, por fim, AA_GLICOSAMINA é igual à área do pico de glicosamina da solução da amostra.

Portanto, pelo cálculo, pode-se afirmar que a amostra possui teor de galactosamina dentro do limite aceitável. De acordo com os resultados promissores vistos neste trabalho e da importância de se desenvolver métodos de análise físico-química para a heparina na forma injetável, podemos sugerir que um dos caminhos para a implementação em compêndios oficiais seria a proposta adaptada do trabalho de Itoh et al.¹⁶ para o produto acabado.

Conclui-se que o método cromatográfico proposto para análise físico-química de amostras de heparina suína injetável possui parâmetros de adequação do sistema dentro dos critérios de aceitação estabelecidos pela Farmacopeia Americana e a análise de três amostras de heparina sódica suína evidenciou a presença de galactosamina em apenas uma das apresentações, a qual obtinha teor abaixo do estabelecido pelo compêndio. Sendo considerado simples e econômico, o método será encaminhado para a Farmacopeia Brasileira como sugestão de monografia para o produto acabado.

À estrutura cedida pelo Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde. Ao auxílio financeiro proporcionado pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico e pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária.