Culturas de células animais foram introduzidas no início do século XX como método de estudo e, após o isolamento da primeira linhagem de células tumorais humanas, as células HeLa, na década de 1950, foram crescentemente utilizadas^{21 , 22}. Embora esta técnica tenha permitido inegáveis avanços na área de biologia celular e ainda seja amplamente utilizada, a partir do final do século XX e início do XXI, as limitações do modelo, em especial no que diz respeito a testes de novos fármacos, se tornaram evidentes. Numa cultura tradicional, em geral denominada de cultura bidimensional (2D), as células tendem a formar uma monocamada aderida a uma superfície de poliestireno modificado para favorecer a adesão, o que é obviamente um substrato não encontrado in vivo e que induz uma polarização artificial das células, não observada quando estas estão nos tecidos. In vivo , as células interagem entre si através de moléculas de adesão, principalmente da família das caderinas, e de complexos juncionais (desmossomos, junção íntima ou oclusiva e junção de adesão) que se ligam, na sua porção citoplasmática, a proteínas do citoesqueleto, através de moléculas adaptadoras^{23 , 24 , 25 , 26}. Além disso, dependendo do tipo, as células se encontram: (a) imersas numa matriz extracelular de composição variada, que inclui diversos tipos de colágeno, fibras elásticas, diversas glicoproteínas, como fibronectina, laminina e vitronectina, além de proteoglicanos e glicosaminoglicanos ou (b) apoiadas numa lâmina basal formada predominantemente por laminina, além de colágeno IV e proteoglicanos. As células ligam-se à matriz extracelular via moléculas principalmente do tipo integrina, que também interagem, através de moléculas adaptadoras, ao citoesqueleto^{27 , 28 , 29}. Estas interações célula-célula e célula-matriz extracelular criam forças mecânicas que organizam espacialmente tanto a matriz extracelular quanto os componentes celulares (citoesqueleto e organelas), modulando diversas propriedades celulares, como forma, diferenciação e migração^{26 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 , 36}. Associadas a gradientes químicos gerados por difusão de fluídos, O₂ e metabólitos celulares^{37 , 38 , 39 , 40}, e pela associação de fatores de crescimento e quimiocinas a moléculas da matriz extracelular^{27 , 41} estas interações formam microambientes específicos, ou nichos, que regulam a homeostasia dos tecidos^{42 , 43 , 44 , 45}. Tanto as interações celulares complexas quanto os gradientes físicos e químicos observados nos tecidos não são reproduzidos nas culturas em monocamada sobre plástico^{33 , 40 , 46 , 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 52 , 53 , 54}. Além disso, possivelmente como resultado de sua adaptação às condições de cultura em monocamada, as células modificam o padrão de expressão gênica^{49 , 51 , 54 , 55 , 56}. Portanto, não é surpreendente que, dependendo dos objetivos do estudo, os resultados observados com estes modelos in vitro muito frequentemente não sejam reproduzidos in vivo . De fato, os resultados instigantes do grupo da Dra. Mina Bissell^{57 , 58}, obtidos a partir de cultivo de células em sistema tridimensional (3D), mudaram o panorama na área de oncologia, merecendo um editorial na revista Nature intitulado “ Goodbye flat biology? ”⁵⁹ e o lançamento, pelo Instituto Nacional do Câncer nos Estados Unidos (NIC – National Cancer Institute ), de um programa de pesquisa, iniciado em outubro de 2003, com orçamento anual de US$ 400 milhões para modelos de cultura 3D⁶⁰. Isto impulsionou o desenvolvimento de sistemas in vitro que buscam mimetizar a fisiologia e a histologia de órgãos e tecidos humanos, o que é refletido pelo aumento no número de publicações científicas sobre o assunto desde então⁵¹. Um levantamento no portal PubMed, utilizando os termos “ 3D culture ” OR spheroid resultou em 5.497 artigos publicados no período de 1971 a 2017. A análise ao longo do tempo indicou um grande aumento no número de artigos publicados a partir do início do século XX. De 1971 até 2000, a média foi de 37 artigos ao ano, passando para 261 artigos ao ano a partir de 2001. Somente em 2017 foram publicados 936 artigos, o que comprova o interesse no assunto e o impacto dos resultados obtidos com modelos in vitro tridimensionais.

Diversos sistemas de cultura, que propõem uma abordagem onde uma organização mais fisiológica, complexa e tridimensional das células ocorra, têm sido desenvolvidos, desde os primeiros relatos em 1971. Técnicas, denominadas de cultura 3D, culturas organotípicas ou culturas de organoides, incluem sistemas onde as células são cultivadas em moldes tridimensionais de composição variável, modelos em que células ou fragmentos de órgãos são mecanicamente sustentados ( Figura 1 ) e modelos de agregados em suspensão, denominados esferoides por seu aspecto arredondado ( Figura 2 ). Mais recentemente, sistemas microfabricados de cultura microfluídica ( microfluidics culture ) e os denominados de órgãos sobre chip ( organ-on-a-chip ) foram introduzidos.

Figura 1
Modelos de cultura de células e culturas organotípicas. (A) Modelo de cultura sobre biopolímero. As células são distribuídas em frascos de cultura cuja superfície foi recoberta com moléculas de matriz extracelular, como colágeno I e matrigel. (B) Modelo de cultura em molde de biopolímero natural ou sintético. As células são encapsuladas em gel de biopolímero, o que permite sua organização tridimensional mais fisiológica (C-D). Linhagens humanas de tumor de mama basal MDA-MB-231 (C) e luminal T-47D (D) foram encapsuladas em matrigel (cultivo 3D), formando, respectivamente, estruturas semelhantes a dutos ramificados (C) ou ácinos (D). Contraste de fase. Barras = 100 µm (C) e 50 µm (D). (E-F) Cultura sobre suporte mecânico. Órgãos ou fragmentos de órgãos (E) e células (F) são cultivados em inserto na interface líquido-ar.

Figura 2
Modelo de cultura 3D do tipo esferoide multicelular. (A) Suspensão celular cultivada utilizando a técnica de gota pendente (acima), em frasco de cultura com superfície modificada para impedir a adesão (meio) e utilizando a técnica de levitação magnética, na qual as células são incubadas com nanopartícula e expostas a campo magnético. (B) Morfologia dos esferoides de fibroblasto humano (B’) e de linhagens humanas de tumor de mama luminal, MCF-7 (B’’) e basal MDA-MB-231 (B’’’). Notar a superfície irregular do esferoide de MDA-MB-231 quando comparado ao do de fibroblasto e a expressão da molécula de adesão E-caderina (em verde) nas células de MCF-7. Núcleos corados com DAPI (em azul). Contraste de fase (B’ e B’’’) e microscopia confocal (B’’). Barras = 50µm. (C) Esquema de esferoide mostrando gradiente de O2 e CO2 do centro para a periferia e as regiões de proliferação, quiescência e morte celular que podem ser observadas estão indicadas.

Os modelos que utilizam moldes procuram criar um ambiente que mimetize a matriz extracelular e, consequentemente, regule a organização espacial das células, sua migração, proliferação e diferenciação. Uma grande diversidade de substâncias, como moléculas de matriz extracelular, biopolímeros naturais, polímeros sintéticos ou híbridos, cerâmicas e metais, tem sido utilizada como molde^{49 , 51 , 53 , 61 , 62 , 63 , 64}. Os diversos biomateriais variam na sua rigidez, porosidade e potencial biodegradável e a escolha do material depende tanto do tipo celular, quanto da aplicação do estudo. Fatores de crescimento podem ser incorporados, favorecendo a proliferação e a diferenciação das células cultivadas nestes moldes e tornando-os mais fisiológicos, ou seja, mais similares à matriz extracelular dos tecidos. A variedade de biomateriais e suas aplicações são objetos de revisões específicas^{49 , 51 , 53 , 63 , 64}.

Os sistemas com matriz extracelular ou biopolímeros foram inicialmente propostos com o cultivo de células primárias (obtidas por dissociação de tecidos ex vivo ) ou linhagem estabelecida, em suspensão ou como agregados, sobre substrato de matriz extracelular, o que não constitui propriamente uma cultura 3D (Figura 1A). Ainda assim, verificou-se que este tipo de cultura favoreceu a proliferação e a diferenciação das células, permitindo que estas se associassem de forma mais fisiológica, mimetizando sua organização in vivo . Estes estudos contribuíram para o entendimento do impacto das interações célula-matriz extracelular nas propriedades celulares e como estas eram modificadas dependendo do tipo de substrato^{49 , 63 , 64 , 65 , 66 , 68}.

Na tentativa de reconstituir um ambiente mais fisiológico, as células foram encapsuladas na matriz polimerizada, que forma um gel (Figura 1B). Neste ambiente tridimensional, em contato com moléculas da matriz extracelular, diferentes tipos celulares (tumorais e fibroblastos, entre outras) foram capazes de migrar de forma muito semelhante ao observado in vivo , o que o possibilitou investigar os detalhes da interação célula-matriz durante a migração^{69 , 70}. Além disso, estes modelos permitem que as células se organizem de forma complexa. Por exemplo, células derivadas de glândulas mamárias formam estruturas semelhantes a dutos ramificados ou a ácinos^{71 , 72} (Figura 1C-D). Ou seja, num ambiente 3D, as células organizam-se espontaneamente formando estruturas histológicas complexas, que se assemelham às observadas nos órgãos dos quais derivam. Por este motivo, estas estruturas foram denominadas de organoides ( oides , do latim, significa semelhante). No entanto, alguns grupos de cientistas restringem o termo organoide a modelos 3D iniciados com células-tronco ou progenitores, que proliferam e se diferenciam, gerando uma progênie que forma estruturas histológicas semelhante à dos órgãos de origem^{63 , 73 , 74}. Organoides de intestino ( mini-guts ) foram descritos em 2009 a partir de células com potencial de célula-tronco, isoladas das criptas do intestino delgado, que foram cultivadas em modelo 3D de matrigel. O sistema permitiu a proliferação e a diferenciação destas células que originaram as demais populações do epitélio intestinal (enterócitos, células caliciformes e células de Paneth) e formaram estruturas semelhantes às criptas e vilosidades intestinais^{75 , 76}. Ou seja, o modelo foi capaz de revelar o potencial de diferenciação das células-alvo, confirmando sua identidade como célula-tronco intestinal. Organoides de cérebro ( mini-brains ) foram desenvolvidos a partir de uma adaptação do modelo de indução de neuroectoderma em corpos embrionários formados por células-tronco embrionárias⁷⁷. Além de possibilitar a compreensão da morfogênese do tecido nervoso, estes organoides mostraram-se uma ferramenta importante na descrição de mecanismo patológico do vírus Zika e sua possível implicação no desenvolvimento de microcefalia⁷⁸. Os exemplos acima mostram as potenciais aplicações deste sistema de cultura na compreensão da morfogênese dos tecidos e na modelagem de doenças e, portanto, não é de se estranhar que uma lista crescente de outros modelos, como de fígado, retina, pituitária, pulmão, pode ser encontrada na literatura científica^{63 , 73 , 74 , 79}.

Culturas de órgãos e fragmentos de tecido foram introduzidas em meados do século XX e, como as condições de difusão de nutrientes e trocas gasosas não são ideais se os tecidos ficam imersos em meio líquido, as estratégias de cultura foram orientadas no sentido de favorecer estes processos. Assim, as culturas de órgãos utilizam um suporte que permite que os tecidos fiquem numa interface líquido-ar (Figura 1E). Inicialmente, os suportes foram montados com filtro microporoso aplicado sobre grade de metal, gel de colágeno ou esponja, mas, recentemente, insertos com membrana porosa, disponíveis comercialmente, são os suportes mais utilizados^{21 , 63 , 80 , 81}. Este tipo de cultura mantém as características histológicas dos tecidos e trouxe avanços em várias áreas do conhecimento. Entre os vários tipos de cultura de órgãos, o modelo de cultura de timo fetal (FTOC, fetal thymus organ culture ) foi um dos mais amplamente utilizados, tendo contribuído de forma relevante na compreensão das etapas e mecanismos de diferenciação de linfócitos T^{80 , 81 , 82 , 83}.

Este tipo de modelo com suporte mecânico foi mais recentemente adaptado para cultura de células que tradicionalmente se encontram em contato com o ar in vivo , como queratinócitos e epitélio respiratório (Figura 1F). As células são cultivadas sobre membrana porosa de inserto e expostas à interface líquido-ar. A superfície da membrana pode ser coberta por matriz extracelular e, ainda, este modelo permite cocultura com fibroblastos, que, imersos na matriz de colágeno, mimetizam o estroma subjacente. Queratinócitos derivados da epiderme, quando cultivados em meio líquido, formam uma monocamada, mas, ao serem expostos a uma interface líquido-ar, estratificam e diferenciam-se formando uma camada queratinizada^{63 , 84}. De maneira similar, as células das vias aéreas condutoras cultivadas neste sistema se organizam de forma mais fisiológica, reproduzindo a morfologia do epitélio respiratório, ou seja, um epitélio pseudoestratificado cilíndrico ciliado, onde células caliciformes podem ser observadas^{85 , 86 , 87 , 88}. O potencial destes sistemas de cultura, não só na compreensão de mecanismos de morfogênese e de propriedades biológicas dos epitélios, mas, sobretudo, como modelos alternativos para teste de novos fármacos e de citotoxicidade, é evidente. De fato, modelos de epiderme, como o Episkin (L’Oreal e Shanghai Episkin Biotechnology Ltd.), e de epitélio respiratório, como o EpiAirway™ (MatTek Corporation) e o MucilAir™ (Epithelix) estão comercialmente disponíveis atualmente.

O modelo de cultura 3D do tipo esferoide multicelular foi inicialmente desenvolvido como reagregados celulares para estudo de biologia do desenvolvimento nas décadas de 1940–1950^{89 , 90 , 91}. A partir da década de 1970, Sutherland et al.⁹² impulsionaram as pesquisas na área de oncologia, ao propor o modelo para estudo sistemático da resposta dos tumores à radioterapia e a drogas^{89 , 90}. O modelo de esferoide multicelular baseia-se na capacidade de adesão homotípica célula-célula, quando sua adesão ao plástico dos frascos de cultura é impedida. De forma geral, os métodos (Figura 2A) como a técnica de cultura em gota pendente, o cultivo em superfícies não aderentes^{89 , 90 , 91 , 93 , 94} e, mais recentemente, o método de levitação magnética (MLM – magnetic levitation method ), no qual as células são cultivadas com nanopartículas e mantidas em cultura com campo magnético⁹⁵, permitem a formação de agregados celulares arredondados (Figura 2B). O tamanho dos esferoides varia em função do número de células cultivadas e do tipo celular. Além disso, diferenças na capacidade de estabelecer adesões célula-célula influenciam a formação dos esferoides, que podem ser mais frouxos, com uma superfície irregular, ou mais firmes (Figura 2B)^{33 , 54 , 89 , 90}. O modelo permite o cocultivo de diferentes tipos celulares e é interessante que nestes esferoides as células se organizam espontaneamente, depositam matriz extracelular e formam microambientes específicos^{89 , 90 , 91 , 96 , 97}. Em função da difusão da periferia, em contato com o meio de cultura, para o centro do esferoide, um gradiente químico de O₂ e de nutrientes e metabólitos celulares se estabelece ao longo do raio do esferoide (Figura 2C). Essa difusão pode ser melhorada com o uso de biorreatores⁵³. Deve ser dito que diversos tipos de biorreatores estão hoje disponíveis, mas nem todos serão igualmente adequados.

A concentração de O₂ no centro do esferoide correlaciona-se inversamente com o tamanho do mesmo e, embora variações sejam observadas, em geral os esferoides de diâmetro acima de 500 µm desenvolvem apoptose e necrose das células localizadas na região central em função da hipóxia. Esta zona central é circundada por uma região de células quiescentes e, mais externamente, pode-se formar uma zona de proliferação, presente nos esferoides de células tumorais, mas praticamente ausente naqueles formados por células não transformadas^{54 , 89 , 90 , 91 , 93 , 94 , 97 , 98 , 99 , 100 , 101 , 102}.

A hipóxia central e as diversas regiões formadas tornam o modelo especialmente vantajoso na área de oncologia por se assemelhar a nódulos tumorais não vascularizados^{54 , 103}. Por outro lado, o modelo também pode favorecer o estudo de mecanismos de angiogênese, quando coculturas com células endoteliais são estabelecidas^{101 , 104 , 105 , 106}. Digno de nota, a integração das células endoteliais no modelo de esferoide de cardiomiócitos murinos promoveu sobrevivência das células, sugerindo que houve melhora na difusão das moléculas presentes no meio de cultura¹⁰⁵. O modelo vem sendo utilizado, com discernimento e menor frequência em função do possível desenvolvimento de necrose central, na área de bioengenharia tecidual^{106 , 107 , 108}.

A semelhança dos esferoides com nódulos tumorais avascularizados impulsionou sua aplicação em testes com quimioterápicos e novos fármacos. Diversos ensaios mostraram que enquanto células tumorais em monocamada foram sensíveis à ação de diversos quimioterápicos, quando cultivadas em modelo de esferoide mostraram-se resistentes. Por outro lado, algumas drogas mostraram-se eficazes somente quando as células se encontravam em ambiente 3D^{54 , 103 , 109 , 110}. Como resultado dessas diferenças, ensaios de alto desempenho com modelo de esferoide para triagem de fármacos antitumorais ( high-throughput screening assay ) têm sido cada vez mais frequentes^{54 , 103 , 111 , 112 , 113 , 114 , 115}. Concomitantemente, novas ferramentas de análise têm sido desenvolvidas^{116 , 117 , 118}, o que reforça o potencial deste modelo na área de oncologia.

A ausência de vasos sanguíneos na maioria dos modelos 3D tem impacto sobre o transporte de fluidos e pequenas moléculas^{119 , 120}. Com o objetivo de tornar mais fisiológico os modelos 3D de cultura de células, técnicas que possibilitam criar um controle espacial dos fluídos, denominadas de microfluídica ( Microfluidic techniques ), têm sido desenvolvidas. O controle do fluxo de fluídos permite regular os gradientes químicos e, consequentemente, a formação de microambientes específicos. O controle espacial é a base da técnica e os modelos mais sofisticados envolvem equipes multidisciplinares para a criação de canais padronizados de tamanho micrométrico ( micropatterning ) em moldes de biopolímero^{53 , 119 , 120 , 121}.

A microfluídica, aliada à cultura de células 3D, possibilitou o cultivo de órgãos em chips , onde os microcanais preenchidos com meios de cultura interligam cavidades de formatos específicos que mimetizam os órgãos de onde as células são retiradas¹²². As células são cultivadas nessas cavidades específicas e a interação entre os diferentes tipos celulares, que formam os órgãos sobre o chip , ocorre por meio dos microcanais. Essa comunicação possibilita o estudo toxicológico sistêmico¹²³, pois a microfluídica permite a interligação de câmaras que mimetizam órgãos diferentes, os chamados “ body-on-a-chip ”^{124 , 125 , 126}. Somado a esse sistema sobre chip , forças mecânicas podem ser empregadas ao substrato onde as células são cultivadas de modo a gerar estímulos que mimetizem o observado in vivo, como, por exemplo, a contração cardíaca e o movimento de inspiração e expiração pulmonar^{127 , 128}. Esses estímulos mecânicos modulam o comportamento celular tornando o sistema mais fisiológico¹²⁹. O potencial destes modelos na área de bioengenharia e de substituição de experimentação animal é inegável.

Não restam dúvidas de que os modelos 3D de cultura de células, por mimetizarem melhor as condições in vivo , trouxeram grandes avanços em diversas áreas do conhecimento, o que inclui influência do microambiente em diversas propriedades celulares (expressão de genes e proteínas, proliferação, morte, migração e diferenciação), morfogênese, modelagem de doenças e ensaios de citotoxicidade para avaliação de novos fármacos^{46 , 47 , 48 , 49 , 50 , 51 , 53 , 54 , 55 , 63 , 64 , 73}. Além disso, esses sistemas abrem a possibilidade de serem realizados estudos personalizados, com o cultivo de células extraídas de tecidos ex vivo (culturas primárias) em sistemas mais fisiológicos. Assim, cada indivíduo teria suas próprias células cultivadas em diferentes modelos e sua resposta celular seria testada frente a drogas a serem estudadas para o desenvolvimento de medicamentos ou terapias específicas para o indivíduo em questão^{74 , 120 , 130 , 131 , 132 , 133}.

A grande maioria destes modelos permite fácil manipulação, teste rápido de hipóteses e análises em tempo real, quando comparados a modelos in vivo . Portanto, estes sistemas são candidatos a métodos alternativos ao uso de animais em experimentação. De fato, em algumas áreas, como na de citotoxicidade de cosméticos, modelos in vitro 3D estão sendo utilizados em substituição ao teste in vivo , erradicado em vários países. No entanto, mesmo nesta área, algumas limitações do modelo devem ser consideradas, como veremos.

A escolha do modelo, que deve levar em conta vários fatores, como o tipo celular e a aplicação do estudo é fundamental na reprodutibilidade dos resultados. Por exemplo, células epiteliais de revestimento podem formar múltiplas camadas ou não, mas encontram-se apoiadas sobre membrana basal e apresentam uma polarização baso-apical. Por outro lado, alguns tipos celulares encontram-se imersos em uma matriz extracelular com características próprias. Exemplificando, osteoblastos estão associados a uma matriz rígida por associação de cristais de hidroxiapatita com moléculas de colágeno I, num processo denominado de mineralização da matriz. Ou seja, o tipo de molde pode ter impacto nos resultados obtidos. Como vimos, os componentes da matriz extracelular incluem uma grande variedade de moléculas, que se associam entre si e ligam fatores de crescimento e citocinas, criando microambientes específicos. As diferenças na composição da matriz alteram sua organização tridimensional, suas propriedades mecânicas e o gradiente químico^{27 , 29 , 32}. Não só, mas a polimerização de alguns componentes da matriz pode criar diferenças estruturais que impactam as propriedades celulares. Por exemplo, diferenças no diâmetro das fibrilas e na porosidade da matriz de colágeno I derivada de rabo de rato ou de derme de bovino tiveram impacto na migração de linhagens celulares tumorais¹³⁴. O grupo de Tatiana Coelho-Sampaio mostrou que o pH altera o padrão de polimerização da laminina, o que, por sua vez, modifica o comportamento de diversos tipos celulares^{68 , 135 , 136}. A variação na polimerização destes biopolímeros também ocorre em função de diferenças na sua extração, como no caso do matrigel, que é comercialmente disponível, mas que varia de lote para lote na sua propriedade de induzir tubulogênese, o que certamente tem impacto na reprodutibilidade dos resultados^{54 , 137}. Ou seja, ainda é desafiador reproduzir, nas condições de cultura, as propriedades mecânicas, a porosidade, a elasticidade e o gradiente químico da matriz extracelular dos tecidos. Mesmo no caso dos órgãos engenheirados, os modelos de órgãos em chip , mimetizar a proporção de massa e volume ou determinar os vários tipos celulares que serão incluídos são desafios que vão além da microfluídica e da engenharia de arcabouços que mimetizem órgãos¹³⁸. Ou seja, é necessária a padronização dos modelos, com critérios bem definidos, para reduzir a variação nos resultados. Além disso, o custo deve ser levado em conta, assim como a ausência de métodos controlados de avaliação em larga escala dos efeitos obtidos^{53 , 54}.

A utilização dos modelos 3D de cultura em substituição ao uso de animais em experimentação deve levar em consideração ainda que mesmo os modelos mais complexos representam somente parcialmente as características dos órgãos e tecidos. Ou seja, o microambiente é mais simples do que o observado in vivo e, portanto, diversos mecanismos fisiopatológicos não são reproduzidos. In vivo , diversos sistemas interagem e, portanto, o microambiente é mais complexo, com contribuição de células do sistema linfohematopoiético e nervoso, além do vascular, já abordado. Macrófagos, células dendríticas, apresentadoras de antígeno, e linfócitos, entre outras, compõem o microambiente, mas estão ausentes na grande maioria dos modelos, comprometendo a avaliação de efeitos inflamatórios e de hipersensibilidade^{47 , 63}. Finalmente, os sistemas de cultura desenvolvidos até o momento, além das limitações espaciais, têm limitação temporal, pois são sistemas que mimetizam eventos de curta duração, enquanto in vivo os eventos se sucedem, ou seja, progridem⁴⁷.

* E-mail: idrossi@hucff.ufrj.br