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INTRODUÇÃO

O soro fetal bovino (SFB) é o suplemento mais utilizado para a expansão ex vivo de células humanas destinadas a ensaios clínicos e terapias celulares. No entanto, as diretrizes de boas práticas de fabricação de insumos para uso clínico ( Good Manufacturing Practice – GMP ) recomendam substituir os produtos derivados de animais por produtos quimicamente definidos, ou por produtos derivados de humanos.

O SFB não é um produto definido e, sendo de origem bovina, as reações imunológicas contra antígenos xenogênicos no organismo recebedor não podem ser excluídas. As proteínas do SFB associam-se ao complexo principal (maior) de histocompatibilidade (CPH) de classe I em culturas celulares de longo prazo, levando à proliferação de células T no recipiente, mesmo numa configuração de uso de células autólogas cultivadas¹. Os glicoconjugados do soro bovino podem ser diretamente transferidos do meio de cultivo às células e incorporados nas membranas de células cultivadas, permanecendo na sua composição por até 48 horas, podendo causar uma reação imunológica aguda. Patógenos e seus derivados como micoplasmas, endotoxina bacterianas, vírus e príons não são necessariamente eliminados do meio de cultivo de células contendo soro bovino, e podem ser potencialmente transferidos para os pacientes que irão receber o transplante celular^{2 , 3 , 4 , 5}. Além disso, existem preocupações sobre o desajuste entre as demandas globais e os suprimentos do SFB, de um ponto de vista ético e de bem-estar animal, uma vez que o SFB é coletado de fetos bovinos^{6 , 7}. É importante considerar também o problema da variabilidade lote a lote do SFB, com diferenças qualitativas e quantitativas decorrentes de influências geográficas e sazonais. O conjunto destes fatores leva os órgãos regulatórios a recomendarem o desenvolvimento de protocolos de cultura celulares livres de produtos animais, chamadas de culturas celulares xeno-free^{6 , 7}.

O desafio é encontrar um substituto biológico de origem humana, que não ofereça riscos à saúde e que seja capaz de sustentar a proliferação celular. As quantidades de células usadas em ensaios clínicos ou terapias celulares são altas, podendo atingir ou ultrapassar a ordem de 100.000.000 de células por paciente, o que requer uma alta e prolongada estimulação da proliferação celular in vitro⁸. Também, é importante manter o perfil celular desejado ao longo do processo de expansão in vitro , que pode variar de um estágio mais imaturo até alcançar um estágio completo de diferenciação celular, dependendo da qualidade de meio de cultivo e de seus suplementos⁸.

Diferentes populações de células humanas são avaliadas em ensaios clínicos. Células adultas, em estágios avançados de diferenciação celular, podem ser isoladas de tecidos humanos e ser aplicadas no tratamento de doenças específicas. Elas possuem uma capacidade de proliferação celular limitada, por isso, sua aplicação clínica é restrita. Células progenitoras e/ou células-tronco adultas, por outro lado, apresentam um alto potencial de proliferação celular e podem dar origem a diferentes linhagens celulares, sendo alvo de inúmeros estudos. O tipo de célula-tronco mais avaliado em ensaios clínicos no mundo é a célula mesenquimal estromal ( mesenchymal stem cell – MSC)⁹. Neste momento, existem 760 estudos clínicos que avaliam a segurança e eficácia do tratamento com MSC em diferentes patologias^*. As principais características das MSC incluem: aderência a superfícies de plástico, morfologia fibroblastoide, expressão de marcadores de superfície (CD105, CD73 e CD90), capacidade de formar colônias a partir de uma única célula (colônias formadoras de células fibroblastoides, CFU-F) e de se diferenciar em células de origem mesodérmica e ecto-mesodérmica^{10 , 11}. MSC são facilmente expandidas in vitro e são consideradas imunologicamente inertes, o que reduz o risco de rejeição do transplante celular¹². A maioria dos estudos abordam MSC isoladas a partir de cordão umbilical humano, sangue periférico, medula óssea ou tecido adiposo, mas as MSC podem ser isoladas, a priori, a partir de qualquer tecido adulto humano¹³.

Este estudo de revisão teve como objetivo avaliar diferentes alternativas de suplementação de cultura celulares xeno-free . Em particular, investigamos o potencial de utilização do plasma rico em plaquetas humano como substituto do SFB em cultura de células humanas.

MÉTODO

Este estudo foi elaborado como uma revisão integrativa. Foram avaliados 50 de 75 artigos científicos que abordavam métodos de suplemento de cultura xeno-free , comparando técnicas e resultados encontrados. A pesquisa de literatura científica foi realizada em documentos do Ministério da Saúde e por consulta à base de dados do PubMed para artigos publicados em inglês ou português até janeiro de 2018. Palavras-chave utilizadas: cell culture, xeno-free, platelet-rich plasma, plasma, platelet lysate, chemically-defined xeno-free medium, cell therapy, clinical trials, mesenchymal stem cells, progenitor cells, human cells, human serum .

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Alternativas para sistemas de cultura xeno-free

Existem diferentes suplementos de cultura celular xeno-free comercialmente disponíveis no mercado. A princípio, esses produtos industrializados são padronizados e não interferem no perfil celular¹⁴. No entanto, alguns estudos alertam sobre alterações biológicas importantes de algumas células humanas quando cultivadas com meios de cultura xeno-free comerciais. MSC de tecido adiposo humano, cultivadas em sistema de cultura xeno-free com produtos industrializados, apresentaram uma redução significativa da aderência celular e perda do marcador de superfície celular CD54 (ICAM-1). Também foram detectadas variações na expressão de CD11a, CD14, CD10 e CD86, os quais estão relacionados com a interação das MSC com células do sistema imunológico, o que pode ter afetado a sua imunogenicidade¹⁵. Além disso, as MSC não conseguem formar esferoides quando cultivadas em três dimensões com alguns tipos de meios de cultura xeno-free¹⁶. Existe uma mudança no perfil genético destas células humanas, com redução da produção de citocinas anti-inflamatórias e moléculas antitumorais¹⁶. Acredita-se que o potencial terapêutico das MSC possa ser comprometido com a utilização de determinados produtos xeno-free comerciais^{15 , 16}. Existe um pensamento equivocado de que estes produtos industrializados são quimicamente definidos e totalmente desprovidos de produtos animais. Na verdade, eles possuem fatores de crescimento em quantidades indefinidas e podem ser suplementados com albumina de soro humano ou animal¹⁵.

Outra opção de suplementação de cultura celular xeno-free é a adição de fatores de crescimento ao meio de cultura. Eles podem ser sintéticos ou derivados de tecido animal ou humano, sendo utilizados de forma isolada ou combinados como um coquetel¹⁵. O uso de fatores de crescimento tem sido associado ao aumento da proliferação celular^{16 , 17} e pode induzir um fenótipo celular específico¹⁶. No entanto, sua aplicabilidade é reduzida porque eles não são capazes de sustentar a expansão celular a longo prazo¹⁵.

Derivados plaquetários humanos aplicados em sistemas de cultura celular xeno-free

Produtos derivados do plasma sanguíneo humano são considerados hoje como os potenciais substitutos do SFB para sistemas de cultura celular xeno-free^{18 , 19}. O plasma sanguíneo puro, coletado de um doador em estado fisiológico normal, contém normalmente baixas quantidades de fatores de crescimento celular. Entretanto, ele abriga as plaquetas que, apesar de apresentarem uma cito-arquitetura relativamente simples, possuem um conteúdo complexo e muito bem organizado. Esse conteúdo é liberado somente com a ativação das plaquetas. Isto pode ocorrer sob efeito de sinalização de fatores circulantes pró-inflamatórios, indicando a presença de uma agressão ou irritação tecidual. Alternativamente, uma lesão das paredes vasculares pode causar um sangramento grave e necessitar ser imediatamente resolvida. Ela expõe as plaquetas ao contato com a matriz extracelular tecidual, principalmente colágeno e os glicoconjugados associados, que imediatamente ativam as plaquetas, causando a liberação do seu conteúdo. A primeira consequência é a ativação in situ das cascatas de coagulação do sangue, que interrompe o sangramento com a liberação dos seus grânulos os fatores bioativos como serotonina, histamina, dopamina, cálcio e adenosina.

Tanto a inflamação quanto a ativação das plaquetas pela adesão nos tecidos lesados sinalizam também a necessidade de iniciar os processos de reparo tecidual. Essa é a segunda função das plaquetas ativadas, sendo elas os primeiros componentes sanguíneos que chegam no local da lesão e liberam seus conteúdos granulares para promover o reparo tecidual²⁰. Nessa função, as plaquetas funcionam como grandes reservatórios de enzimas, hormônios e fatores de crescimento. Diversos fatores de crescimento celular já foram identificados, dentre eles: fator de crescimento tumoral ( transforming growth factor -b – TGF-b), fator de crescimento derivado de plaquetas ( platelet-derived growth factor – PDGF), fator de crescimento tipo insulina I e II ( insulin-like growth factor I, II – IGF-I, IGF-II), fator de crescimento de fibroblastos ( fibroblast growth factor – FGF), fator de crescimento epidérmico ( epidermal growth factor – EGF), fator de crescimento vaso-endotelial ( vascular endothelial growth factor – VEGF) e fator de crescimento de células endoteliais ( endothelial cells growth factor ). Estes fatores de crescimento e moléculas bioativas, produzidas pelas plaquetas, modulam e estimulam as células locais a promoverem regeneração. Esta sua capacidade moduladora é a principal justificativa de utilizar o conteúdo plaquetário em um ambiente de cultivo celular²¹.

Os produtos derivados de plaquetas que estão sendo avaliados em sistemas de cultura celular xeno-free são: 1) Plasma Puro (PP); 2) Plasma Rico em Plaquetas (PRP); 3) Lisado Plaquetário (LP). O PP e o PRP são obtidos através de uma sequência de centrifugações do sangue periférico. O PP é obtido através de apenas uma centrifugação, enquanto o PRP é obtido após duas ou mais centrifugações consecutivas. O LP, também conhecido como Hormônios Derivados de Plaquetas (HDP), é obtido através de centrifugações seguidas pela adição de agonista de epinefrina, e posteriormente, ciclos repetidos de criocongelamento e descongelamento e choque hipotônico para interromper a membrana plasmática das plaquetas e liberar todos os seus conteúdos^{18 , 19}.

Em comum, todos eles possuem os mesmos componentes biológicos, isto é, possuem o rico conteúdo plaquetário. Porém, existe uma grande divergência nas nomenclaturas e nos métodos de preparo destes produtos biológicos. Não há um padrão no número de centrifugações, velocidade e temperatura ideal para isolar cada um destes produtos, nem mesmo existe um consenso sobre protocolo específico para cultura de cada tipo de célula⁵⁶. As variações englobam também aspectos como seleção de doadores, processo de coleta (aférese ou doação de sangue total), presença de solução aditiva, implementação de inativação de patógenos, tipo de ativação plaquetária, presença ou não de leucorredução e consideração sobre grupos sanguíneos ABO. Todos estes fatores podem influenciar a sua aplicabilidade¹⁹. O uso de PP, PRP ou LP como suplementos de cultura de células humanas possui efeitos distintos no comportamento celular e pode influenciar de forma diferente a migração, proliferação e diferenciação de células humanas ( Tabela ). A variabilidade do processo de produção é um problema para padronização destes produtos biológicos, e deve ser prioridade no processo de desenvolvimento de uma alternativa de culturas celulares xeno-free¹⁹.

Plasma Rico em Plaquetas como suplemento de cultivo celular

Dentre os diferentes produtos plaquetários, o PRP é considerado o suplemento mais promissor para cultura de células humanas destinadas ao uso clínico^{5 , 19 , 21 , 27 , 32 , 40}. O PRP é obtido através de uma sequência de centrifugações do sangue fresco, que tem como objetivo aumentar a concentração de plaquetas em pequeno volume do próprio plasma²¹. As vantagens de sua utilização em culturas de células humanas xeno-free são: 1) possibilidade de utilização de soro autólogo para preparo do implante celular; 2) redução de riscos de contaminação cruzada e reações imunológicas indesejadas para o paciente; 3) presença de fatores de crescimento que estimulam proliferação e diferenciação celular; 4) facilidade e seu preparo; 5) baixo custo de produção e 6) possibilidade de uso alogênico para cultura celular de larga escala.

O rico conteúdo liberado pelas plaquetas ativadas, presentes no PRP, é capaz de estimular a proliferação celular e a diferenciação de diversos tipos celulares, desde células adultas até as células progenitoras²². O PRP foi avaliado como suplemento de cultura xeno-free em diferentes tipos de células adultas humanas, tais como: fibroblastos de pele⁴¹, fibroblastos gengivais^{38 , 39 , 40}, células de ligamento periodontal³⁹, osteoblastos³⁷, condrócitos^{27 , 31}, mioblastos²⁸, tenócitos^{26 , 29} e fibrocondrócitos de menisco humano⁵⁷. O gel de PRP também tem sido estudado como uma forma de abrigar células cultivadas in vitro^{41 , 42 , 43 , 44}. Ele consegue criar um ambiente favorável para a formação de uma rede celular tridimensional (3D)⁴⁴ e oferece um suporte adequado para fibroblastos de pele⁴¹ e células endoteliais⁴².

Em geral, os estudos pré-clínicos avaliaram a capacidade de adesão, migração, proliferação e diferenciação celular na adição do PRP no meio de cultura. Não há relatos de formação de tumores em nenhum estudo^{5 , 19 , 21 , 27 , 32 , 40}. O uso de PRP favorece a adesão celular no substrato da cultura e estimula a migração através da reorganização do citoesqueleto celular³⁹. O PRP não afeta o potencial de proliferação celular e, em alguns casos, pode ampliar a capacidade de expansão in vitro destas células humanas^{10 , 28 , 29 , 30 , 31}. Já o efeito do PRP sobre o potencial de diferenciação celular varia de acordo com o tipo de célula cultivada. Mioblastos de músculo esquelético humano não se diferenciam na presença de PRP no meio de cultura²⁸. Por outro lado, células progenitoras de tenócitos são induzidas a se diferenciar em tenócitos e passam a produzir colágeno²⁹. O mesmo comportamento é observado com células progenitoras de condrócitos. O PRP induz sua diferenciação em condrócitos e promove a formação de um tecido cartilaginoso denso e compacto, rico em colágeno tipo II e proteoglicanos¹⁰.

Outra população de células que tem sido alvo de muitos estudos que utilizam o PRP em culturas celulares xeno-free é a MSC^{14 , 27}. Os riscos de transmissão viral a partir de soro animal e o potencial de indução imunológica contra o antígeno bovino em pacientes foram relatados e suscitam preocupações sobre o uso de SFB para o preparo de MSC para pacientes submetidos à investigação clínica^{2 , 3 , 4}. Embora o meio de cultura isento de soro seja uma condição opcional para o preparo das MSC e um recurso comercialmente disponível, as características das MSC parecem serem variáveis de acordo com o tipo de meio utilizado^{58 , 59}.

A suplementação do meio de cultura com PRP humano tem sido recomendada para o preparo de MSC destinadas a protocolos clínicos^{14 , 19 , 60}. As justificativas para esta recomendação são: 1) o PRP adicionado ao meio de cultura não provoca ou estimula a formação de tumores ou variações genéticas ou fenotípicas das MSC cultivadas in vitro²⁷; 2) o PRP estimula a proliferação do MSC sem comprometer a sua capacidade de diferenciação^{5 , 19 , 27 , 32} e o seu imunofenótipo celular^{5 , 19 , 26 , 27}; 3) o PRP pode influenciar no potencial de diferenciação celular das MSC, direcionando-as para uma linhagem específica, visando atender a uma necessidade clínica^{35 , 39}; 4) o PRP pode diminuir a velocidade da senescência celular^{5 , 26 , 35}; 5) o PRP pode influenciar na função parácrina das MSC humanas⁶¹.

O uso do PRP autólogo é considerado ideal para preparo de células humanas destinadas a ensaios clínicos, por não oferecer riscos de rejeição imunológica para o paciente que receberá o transplante celular. Alguns estudos descrevem que as células humanas podem proliferar mais rapidamente quando suplementados com produtos plasmáticos autólogos do que alogênicos²⁴. Já existem produtos alogênicos comercialmente disponíveis, que podem ser utilizados para produção de células em larga escala. É uma opção econômica com variação limitada no seu conteúdo, mas que pode oferecer risco de aloimunização¹⁹. As limitações que ainda existem sobre a aplicação do PRP humano em culturas celulares xeno-free são a necessidade de um grande volume de sangue para seu preparo e impacto de sua variabilidade biológica nas células cultivadas^{22 , 33}.

Uma fonte estratégica de sangue periférico e seus derivados para produção de PRP humano utilizado para suplementação de culturas celulares xeno-free são os bancos de sangue. Também conhecidos como hemocentros, eles constituem laboratórios especializados no armazenamento e processamento de sangue periférico que será destinado ao atendimento clínico. Em média, de 20 a 40% do sangue disponível é descartado por motivos diversos, principalmente pelo prazo de uso vencido. O índice de perdas de concentrado de plaquetas em banco de sangues públicos atinge 33%. De acordo com as diretrizes gerais para os bancos de sangue, o concentrado de plaquetas tem vida de prateleira de cinco dias. Devido a essa vida útil curta, é comum o descarte de grande quantidade deste produto após a data de transfusão recomendada^{62 , 63 , 64 , 65 , 66}. Além de evitar o desperdício, o uso do sangue e seus derivados em bancos de sangue é uma forma de assegurar que os produtos de suplemento à cultura celular tenham uma boa qualidade, pois seguem um padrão de processamento que minimiza contaminação e proliferação microbiana, e são submetidos a uma análise detalhada no ato de coleta para verificar a presença de possíveis doenças infeciosas, como sífilis, vírus HIV, hepatite B e hepatite C (recomendações descritas na Resolução da Diretoria Colegiada da Agência Nacional de Vigilância Sanitária RDC n° 24, de 24 de janeiro de 2002).

A Lei nº 10.205, de 21 de março de 2001 e a Portaria nº 2.712, de 12 de novembro de 2013 tratam especificamente de sangue, seus componentes e derivados, assim como do regulamento técnico de procedimentos hemoterapêuticos, respectivamente^{67 , 68}. Elas viabilizam o uso deste material biológico, que foi captado para fins terapêuticos e que não teve uso programado, para produção de compostos e derivados destinados a outras finalidades terapêuticas. O uso semelhante poderá ser estendido então à produção do PRP para cultivo de células humanas e pode movimentar o segmento econômico de empresas de biotecnologia, estimulando investimentos em produção de insumos para pesquisa. Os hemocomponentes excedentes são considerados como matéria prima de boa qualidade, e já foram sugeridos como “ouro líquido”^{62 , 66 , 69}, em função da alta lucratividade das empresas que investem em inovações tecnológicas.

CONCLUSÕES

Este estudo de revisão comparou os resultados encontrados em diferentes métodos de suplemento de cultura celular xeno-free e verificou que o plasma rico em plaquetas humano é o candidato ideal para substituir o SFB em cultura de células humanas destinadas à pesquisa clínica. Não há risco de alterações genéticas da população celular^{21 , 27 , 32}, tampouco perda de suas propriedades biológicas^{5 , 19 , 27 , 32} e contaminação com patógenos que poderia causar danos à saúde do paciente que receberá o transplante celular^{27 , 32}. Os desafios que existem, neste momento, para que o PRP seja efetivamente adotado no preparo de células humanas são: 1) padronizar processo de produção do PRP humano (número, velocidade, gravidade e tempo de centrifugações), 2) determinar a concentração ideal de PRP humano para suplementar o meio de cultura de diferentes tipos celulares; 3) estabelecer os controles de qualidade para detectar possíveis contaminações exógenas; 4) determinar estratégias para diminuir variabilidade biológica; e 5) certificar os laboratórios e pesquisadores qualificados para oferecer tais produtos para o mercado nacional. É necessário o desenvolvimento de ensaios clínicos para avaliar a segurança e eficácia do transplante de células humanas que foram submetidas à suplementação com plasma rico em plaquetas durante o processo de cultivo e expansão celular in vitro . Estas condições devem ser estudadas como uma prioridade da comunidade científica e também avaliadas pelos órgãos regulatórios que fiscalizam os ensaios clínicos.

O concentrado de plaquetas destinados ao descarte nos centros de hemoterapia pode ser utilizado para produção do PRP humano. Sendo congelado, esse material de descarte pode ser guardado e processado em condições adequadas. A finalidade de seu uso final seria o cultivo de células humanas em condições xeno-free , para sua aplicação subsequente no cultivo de células destinadas às terapias avançadas. As autoridades competentes deverão estabelecer os parâmetros de sua manipulação e os controles de qualidade necessários para liberar o posterior uso desse produto nos procedimentos de terapias avançadas.

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Notas

Autor notes

* E-mail: karlamenezess@gmail.com

Declaração de interesses

IR