RESUMO
Introdução: A contaminação de alimentos consumidos crus, como salada de alface, é previsível pela origem telúrica e pela manipulação indevida nos estabelecimentos comerciais constituindo um possível risco à saúde pública. A utilização de fermentado acético como antibacteriano poderia ser um mecanismo hábil para melhorar a qualidade e a segurança desse alimento.
Objetivo: Avaliar a qualidade microbiológica das saladas de alface (Lactuca sativa) comercializadas na cidade de Duque de Caxias, RJ, e a efetividade do fermentado acético de maçã como descontaminante.
Método: Foram coletadas amostras de saladas de alface em quatro restaurantes, que foram analisadas antes e após a descontaminação com fermentados acéticos em acidezes voláteis (4, 5 e 6 em g. 100 mL -1) e concentrações de 10% e 50% quanto à contagem de bactérias aeróbicas mesófilas, coliformes totais e termotolerantes e quanto à presença de Salmonella spp.
Resultados: As análises revelaram má qualidade das amostras em três restaurantes (A, B, C) nos quais, embora não tenha sido constatada a presença de Salmonella spp., verificou-se contagens elevadas de bactérias aeróbias mesófilas e de coliformes totais e termotolerantes. De acordo com as normas legais, em dois estabelecimentos as amostras seriam reprovadas pelo excesso de coliformes termotolerantes. Com o uso do fermentado acético na descontaminação, houve redução das contagens bacterianas, permitindo que todas as amostras apresentassem condições satisfatórias para consumo humano. Não houve diferença significativa (p < 0,05) entre os tratamentos com diferentes concentrações e acidezes de fermentado acético em relação as amostras não tratadas.
Conclusões: O fermentado acético pode ser uma alternativa segura e prática para melhorar a qualidade higiênico-sanitária da alface em saladas cruas, garantir a segurança alimentar e reduzir os riscos à saúde humana.
PALAVRAS-CHAVE: Lactuca sativa, Ácido Acético, Análise Microbiológica, Descontaminação, Segurança Alimentar.
ABSTRACT
Introduction: Contamination of raw consumed foods such as lettuce salads is predictable by telluric origin and improper handling in commercial establishments constituting a possible risk to Public Health. The use of acetic fermented as antibacterial could be a skillful mechanism to improve the quality and safety of this food.
Objective: To evaluate the microbiological quality of lettuce (Lactuca sativa) salads marketed in the city of Duque de Caxias, RJ and the effectiveness of acetic acid lecithin as a decontaminant
Method: Lettuce salad samples were collected at four restaurants and analyzed before and after decontamination with acetic fermented in volatile acidity (4, 5 and 6 in g. 100 mL -1) and concentrations of 10% and 50% the count of mesophilic aerobic bacteria, total and thermotolerant coliforms and the presence of Salmonella spp.
Results: The analyses revealed poor quality of the samples in three restaurants (A, B, C) where, although the presence of Salmonella spp. was not observed, there were high counts of mesophilic aerobic bacteria and total and thermotolerant coliforms. In accordance with legal regulations, in two establishments, the samples would be disapprove by the excess of thermotolerant coliforms. With the use of acetic fermentation in the decontamination, bacterial counts were reduced, allowing all the samples to present satisfactory conditions for human consumption. There was no significant difference (p < 0.05) between the treatments with different concentrations and acidity of acetic fermented in relation to the untreated samples.
Conclusions: Acetic fermented can be a safe and practical alternative to improve the hygienic-sanitary quality of lettuce in raw salads, ensuring food safety and reducing risks to human health.
KEYWORDS: Lactuca sativa, Acetic Acid, Microbiological Analysis, Decontamination, Food Safety.
ARTIGO
Avaliação da eficiência antibacteriana de fermentados acéticos comerciais em saladas de alface (Lactuca sativa) comercializadas na cidade de Duque de Caxias, Rio de Janeiro
Evaluation of antibacterial efficiency of commercial acetic fermented in lettuce salad (Lactuca sativa) marketed in Duque de Caxias city, Rio de Janeiro
Barbara Mazeto Saraiva
Elaine de Castro Antunes Marques Fernandez
Alfredo Tavares Fernandez altafe3@gmail.com
Recepção: 11 Abril 2019
Aprovação: 08 Julho 2019
O consumo de folhas verdes como a alface ( Lactuca sativa) vem crescendo devido aos benefícios nutricionais e à conveniência, já que são alimentos ready-to-eat (RTE), ou seja, já prontos para consumo 1, 2.
Behrens et al. 3 observaram entre consumidores que esses alimentos, embora convenientes pela economia de tempo, levantam suspeitas sobre integridade e segurança.
As saladas de alface são reconhecidas, por sua origem e manipulação, como um dos alimentos com maior taxa de contaminação por microrganismos diversos. O fermentado acético comercialmente mais conhecido como vinagre pode ser usado como ingrediente para contribuir com o sabor nas saladas, mas também é conhecido como uma substância segura ( Generally Recognized As Safe – GRAS), podendo ser utilizado na descontaminação de vegetais.
Os vegetais consumidos crus são responsáveis por surtos de doenças de origem alimentar causados devido a bactérias como: Clostridium botulinum, Bacillus cereus e Listeria monocytogenes, habitantes normais do solo, Salmonella, Shigella, Escherichia coli e Campylobacter spp., presentes no trato intestinal de animais, incluindo seres humanos. Em geral, a contaminação de frutas e vegetais crus ocorre por meio do contato com fezes, esgoto ou água de irrigação não tratada 4.
A alface crua, devido à alta taxa de contaminação, pode apresentar vários efeitos sobre a saúde humana, resultando em diarreia leve e autolimitante até grave com desidratação severa, perda de peso e anemia 5.
Diversos estudos revelaram que numerosos surtos de doenças de origem alimentar estão relacionados ao consumo de alface contaminada principalmente por E. coli enterohemorrágica 6, 7, 8, 9, Salmonella spp. 10, 11 e Yersinia spp. 12, 13.
Para o preparo desses vegetais, eles devem ser lavados com água potável para que a carga microbiana dos vegetais possa ser reduzida em 90%. Porém, isso pode não ser suficiente para eliminar a contaminação sendo essencial aplicar um plano de higienização 14.
No Brasil, o cloro é o mais usado para a descontaminação de vegetais, particularmente o hipoclorito de sódio, devido ao pequeno custo. A recomendação de uso legal é de 200-250 ppm com contato mínimo de 15 min 15.
Nos últimos anos, tem havido crescimento no consumo de frutas e vegetais minimamente processados. Entretanto, produtos químicos clorados usados como sanificantes podem formar compostos carcinogênicos com impactos adversos à saúde humana, havendo necessidade de introdução de novos sanificantes e tecnologias para garantir a segurança desses alimentos 16.
O ácido acético tem sido estudado pela sua eficiência em remover patógenos de frutas e vegetais frescos. Foi evidenciado em um estudo sobre a desinfecção de alface inoculada com E. coli O157:H7(10 7 UFCg 1) que um vinagre comercial de arroz com 5% de ácido acético (pH 3,0) por 5 min reduziu a população desse patógeno em três ciclos logarítmicos 17.
O uso comercial de soluções ácidas orgânicas pode minimizar os riscos ao ambiente e a saúde pública 18. Também existem vantagens no uso desses produtos já que são baratos, biodegradáveis e de fácil manuseio 14. A utilização de ácidos orgânicos GRAS é reconhecida como segura embora a sua eficácia dependa do tipo de alimento em questão e varie de ácido orgânico para ácido orgânico 19.
Na literatura existem numerosos estudos sobre a eficácia destes agentes em frutas e vegetais, mas a maioria foi conduzida em condições sob contaminações artificiais usando diferentes microrganismos e as condições técnicas de aplicação nem sempre são passíveis de comparação 17, 20, 21, 22, 23, 24, 25
Esta pesquisa foi conduzida com o intuito de avaliar a qualidade de saladas de alface ( Lactuca sativa) comercializadas em restaurantes self-service e a eficácia da descontaminação através de fermentados acéticos com diferentes acidezes e concentrações quanto à contagem de bactérias aeróbias mesófilas, coliformes (totais e termotolerantes) e Salmonella spp.
As amostras foram compostas de saladas de alface ( Lactuca sativa) prontas para consumo e sem temperos, expostas em balcões self-service de quatro restaurantes escolhidos aleatoriamente e identificados como A, B, C e D; localizados na cidade de Duque de Caxias no estado do Rio de Janeiro. As amostras foram colhidas assepticamente em embalagens de papel cartão aluminizado na quantidade aproximada de 350 g, identificadas e transportadas ao laboratório de controle microbiológico de alimentos da Universidade do Grande Rio (Unigranrio), onde as análises foram conduzidas. Os fermentados acéticos de maçã utilizados nesse experimento foram adquiridos em estabelecimentos comerciais de acordo com sua acidez expressa na rotulagem.
De cada amostra, 14 subamostras de 25 g foram obtidas, das quais sete foram usadas para realização das análises de contagem de bactérias aeróbias mesófilas viáveis, coliformes (totais e termotolerantes) e as outras sete foram usadas para pesquisa de Salmonella spp. Das 14 subamostras, duas foram analisadas em separado para avaliação da microbiota inicial, sem o tratamento com o fermentado acético; sendo essas duas definidas como controle. As 12 subamostras foram, então, submetidas a descontaminação com fermentado acético sob imersão por 15 min em diferentes proporções de acidez volátil (em g. 100mL -1) e diluídas em água destilada esterilizada nas seguintes soluções: acidez 4 a 10% e 50%, acidez 5 a 10% e 50%; e acidez 6 a 10% e 50%.
As análises foram conduzidas em triplicata para estimar: o número mais provável (NMP) de coliformes (totais e termotolerantes), a presença/ausência de Salmonella spp. e a contagem total de bactérias aeróbias mesófilas. Essas análises foram realizadas como estabelecido pela Instrução Normativa nº 62, de 26 de agosto de 2003 26, e os resultados comparados a Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) nº 12, de 02 de janeiro de 2001, norma reguladora da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa) 27.
As técnicas de contagem foram realizadas a partir das três diluições decimais em série consecutiva, nas quais a primeira diluição foi feita a partir da subamostra de pesagem de 25 g e, depois, adicionada a 225 mL de solução salina peptonada a 0,1%. As diluições decimais seguintes foram feitas a partir de 1 mL da primeira diluição em 9 mL de solução salina peptonada a 0,1% seguidas de homogeneização.
De cada diluição decimal, uma alíquota de 1 mL foi transferida para três conjuntos de três tubos com caldo Lauril Sulfato Triptose (LST) com tubos de Durham invertidos, os quais foram incubados a 36 ± 1ºC por 48 h. A turbidez, juntamente com a presença de gás em um ou mais tubos de Duhram, caracterizava a positividade.
Alíquotas de cada tubo considerado positivo no teste presuntivo foram transferidas pelo uso de alça bacteriológica para tubos com caldo Verde Brilhante Bile Lactose (VBBL), com tubos de Duhram invertidos sendo incubados à temperatura de 36 ± 1ºC durante 48 h. Os resultados foram expressos em log NMP/mL após comparação em uma tabela.
De forma semelhante, dos tubos LST considerados positivos no teste presuntivo, alíquotas de cada um foram transferidas pelo uso de alça bacteriológica para tubos com caldo Escherichia coli (EC) e tubos com caldo VBBL, com tubos de Duhram invertidos sendo incubados à temperatura de 45ºC durante 24 h, nos quais, através de comparação com a tabela, os resultados foram expressos em log NMP/mL.
A técnica pour plate foi aplicada pelo uso de inóculo de 1,0 mL de cada uma das diluições decimais seriadas em placas de Petri em duplicata com ágar padrão para contagem previamente fundido. Após a homogeneização e a solidificação, as placas foram invertidas e incubadas durante 48 h a 36 ± 1ºC. As contagens foram realizadas em contador de colônias para placas após seleção das placas que apresentaram contagem entre 25 e 250 unidades formadoras de colônias (UFC) e os resultados foram expressos como log UFC/g de amostra.
Inicialmente foi realizada a etapa de pré-enriquecimento, na qual cada alíquota de 25 g da subamostra de salada de alface foi adicionada a 225 mL de água peptonada tamponada e submetida à incubação a 36 ± 1°C por 20 h. Em seguida, foram transferidas alíquotas de 0,1 mL para tubos contendo caldo Rappaport Vassiliadis. Paralelamente, também foram transferidas alíquotas de 1 mL para tubos contendo caldo selenito cistina sendo incubados em banho de água a 42°C por 24 h constituindo a etapa de enriquecimento. Em continuidade, alíquotas do crescimento foram submetidas a espalhamento superficial em meios seletivos sólidos para obtenção de colônias isoladas sendo usadas placas com Ágar Ramback, Bismuto-sulfito, Xilose Lisina Desoxicolato (XLD) e Salmonella-Shigella, as placas foram incubadas a 36 ± 1°C por 24 h. Três a cinco colônias suspeitas por placa foram selecionadas e inoculadas em ágar padrão, incubado a 36 ± 1ºC por 24 h para posterior realização dos testes bioquímicos para verificação de comportamento típico de Salmonella spp.: ausência de urease, reações bioquímicas típicas no ágar TSI, descarboxilação ou não de lisina, reações bioquímicas e de motilidade no ágar SIM e o teste de oxidase em fitas de papel. Todos os testes foram incubados a 36 ± 1°C por 24 h.
Para a análise estatística foram usados o Coeficiente de Correlação de Pearson, o teste t de Tukey sendo utilizado o programa PAST. Para todas as análises o nível de significância considerado foi de 5% 28.
As contagens de bactérias aeróbias mesófilas nas amostras controle de salada de alface dos restaurantes oscilaram entre quatro e seis log UFC/g ( Tabela 1). A legislação vigente não prevê limites para a contagem total de bactérias aeróbias mesófilas para hortaliças frescas in natura, porém, segundo Morton 29, alimentos que apresentam contagens totais de microrganismos aeróbicos acima de 6 log UFC/g começam a apresentar sinais de deterioração. Uma das amostras apresentou esta contagem elevada caracterizando possível deterioração.
Constatou-se a eficiência do fermentado acético em todas as concentrações e acidezes (p < 0,05) na redução de bactérias aeróbias mesófilas ( Tabela 1). Foi possível observar maior eficiência no tratamento com fermentado acético a 50% com resultados de redução de três a quase cinco ciclos decimais nas amostras submetidas a esse tratamento e variando de dois a até mais de quatro ciclos decimais nas amostras submetidas a tratamento com 10% de fermentado acético. Nesse aspecto, os resultados são similares aos obtidos por Entani et al. 30 que, na utilização de fermentados acéticos a 2,5%, obtiveram redução de três ciclos logarítmicos. No Brasil, de forma similar, Oliveira 31 obteve redução na contagem de bactérias aeróbias mesófilas de até dois ciclos logarítmicos na descontaminação de alface com vinagre a 2% e 20% por 15 min.
Nas acidezes 5 e 6 (em g. 100 mL -1) foram obtidos resultados de redução de quase cinco ciclos decimais enquanto que nas demais amostras as reduções obtiveram resultados onde alguns atingiram até quatro ciclos decimais. No entanto; estatisticamente, não houve diferença significativa entre os tratamentos com fermentado acético quanto às acidezes e às concentrações, porém houve diferença significativa (p < 0,05) quanto ao tratamento com fermentado acético em relação as amostras controle denotando que o uso de fermentado acético pode ser efetivo na redução bacteriana independente de concentração e acidez.
No Brasil, de forma similar, Silva 32 utilizando vinagre a 4% na descontaminação de couve, obteve redução significativa na contagem de bactérias aeróbias mesófilas, coliformes totais e termotolerantes para níveis aceitáveis.
Em concordância, Zerio-Egli et al. 33 verificaram que soluções a 1,6% e 2,5% de ácido acético usadas por 30 seg, 2 e 5 min, respectivamente, agiram na descontaminação de folhas verdes com reduções entre 1,5 e 4,0 log UFC/g de bactérias aeróbias, bolores e leveduras e coliformes e concluindo que as reduções não foram dose ou tempo dependentes. No presente trabalho foi constatado que o uso de fermentado acético nas concentrações utilizadas causou a redução bacteriana.
De acordo com a International Commission on Microbiological Specifications for Foods (ICMSF) 21, as contagens de coliformes totais em alface são usadas como parâmetros da carga microbiana presente, embora não sejam usadas como base legal, servem como um alerta das condições de higiene durante a manipulação e dos riscos oferecidos à saúde do consumidor.
Os resultados da contagem de coliformes totais nas amostras controle variaram entre 0,47 e 2,66 log NMP/g ( Tabela 2). A utilização do fermentado acético reduziu os valores NMP de coliformes totais em todos os tratamentos principalmente nas amostras dos restaurantes A e C, obtendo até resultados superiores a dois ciclos decimais. Nas amostras dos restaurantes B e D, foram encontradas baixas contagens de coliformes totais. Quanto ao efeito da concentração de fermentado acético, a redução foi mais evidente em tratamentos com concentração de 50% de fermentado acético e, quanto a acidez, o tratamento com acidez 5 foi o mais eficiente em ambas as concentrações (10% e 50%) alcançando até valores superiores a dois ciclos decimais. Oliveira 26 também constatou redução na contagem de coliformes totais de dois a três ciclos logarítmicos na descontaminação de alface com vinagre a 2% e 20% por 15 min. Não houve diferença significativa entre os tratamentos com fermentado acético quanto às acidezes e às concentrações, porém houve diferença significativa (p < 0,05) quanto ao tratamento com fermentado acético em relação as amostras controle.
Para coliformes fecais, a legislação federal da Anvisa 13 fixou limite máximo de 2 x 10 2 NMP/g ou 2,30 log NMP/g. Conforme a Tabela 3, as amostras de saladas de alface dos restaurantes A e B foram consideradas impróprias para consumo segundo a legislação. Observou-se maior eficiência de redução bacteriana nessas amostras por meio do tratamento com fermentado acético, já que apresentavam maior quantidade de coliformes, consequentemente houve maior eficiência com redução de dois a quase três ciclos decimais.
Quanto aos coliformes fecais, não houve diferença significativa entre os tratamentos com fermentado acético quanto às acidezes e às concentrações, porém houve diferença significativa (p < 0,05) quanto ao tratamento com fermentado acético em relação as amostras controle.
Entani et al. 30, fazendo uso de diferentes tipos de fermentados acéticos, constataram sua forte ação bacteriostática em 34 linhagens bacterianas encontrando também atividade bactericida em E. coli enteropatogênica e enterohemorrágica, sendo a última bastante resistente à acidez. A redução observada na quantidade de coliformes fecais na presente pesquisa indicou também a eficiência do fermentado acético.
Semelhantemente, Amoah et al. 35 constataram que a utilização de vinagre como sanitizante de alface em concentrações aproximadas de 33% e 17%, respectivamente por 1 min e acima de 10 min, removeu valores superiores a quatro ciclos logarítmicos de coliformes fecais. Na presente pesquisa, os resultados obtidos com relação à redução de coliformes fecais foram similares nas concentrações de fermentado acético a 10% e 50%.
Chang e Fang 17, ao realizarem tratamento de alface inoculada (10 7UFCg -1) com vinagre comercial com ácido acético (pH 3,0) a 5% por 5 min, verificaram a redução da população em três ciclos logarítmicos de E. coli enterohemorrágica. Da mesma forma, Poimenidou et al. 23 demonstraram que, em comparação a outros agentes químicos e antimicrobianos naturais, o vinagre possuiu a maior atividade letal contra E. coli enterohemorrágica, com redução de 1,8–2,3 log UFC/g e 2.8 log UFC/g na contagem total de bactérias. Akbas e Ölmez 18 obtiveram redução de E. coli enterohemorrágica entre 1,3 e 1,7 log UFC/g em alfaces cortadas na utilização de ácido acético em tratamento entre 0,5% e 1,0% por 2 e 5 min. De forma semelhante, no presente estudo, obteve-se a redução superior a dois ciclos logarítmicos em amostras de dois restaurantes.
Não se detectou Salmonella spp. em nenhuma das amostras de alface dos quatro restaurantes. Tais resultados classificam as amostras analisadas de acordo com a RDC da Anvisa 22 que estabeleceu para hortaliças in natura a ausência de Salmonella spp. em 25 g de produto, visando a preservação da saúde pública.
Sengun e Karapinar 36 constataram redução significativa de Salmonella Typhimurium em cenouras com o uso de vinagre de uva a 4% com redução de 1,87 a 3,33 ciclos logarítmicos dependente do tempo de tratamento.
Nascimento et al. 37 relataram que as hortaliças consumidas cruas são susceptíveis a contaminações microbiológicas, pois não passam por nenhum tratamento térmico. Por isso, é importante fazer a desinfecção para reduzir o número de microrganismos.
De acordo com Azerêdo, Conceição e Stamford 38, 100% das amostras de saladas cruas analisadas em um restaurante universitário estavam dentro dos padrões exigidos pela legislação vigente, embora tenha sido constatado em algumas amostras elevada contagem de aeróbios mesófilos, o que também ocorreu na presente pesquisa. Isso mostra que, mesmo não sendo detectada Salmonella, os estabelecimentos devem se adequar às práticas de higiene e manipulação que envolvem o produto.
Corroborando sua ação, o uso de ácido acético em concentrações de 1 a 2% reduziu em 0,52 a 2,78 ciclos logarítmicos as populações de Escherichia coli enterohemorrágica, Salmonella Typhimurium e Listeria monocytogenes em alface e maças orgânicas 39.
Embora não tenha sido constatada a presença de Salmonella spp., as amostras coletadas em três restaurantes estavam comprometidas higiênica e sanitariamente devido à presença elevada de bactérias aeróbias mesófilas e coliformes totais além de coliformes fecais acima dos padrões legais. Houve diferença estatística entre as saladas controle e as tratadas com fermentado acético de maçã, independentemente das concentrações e acidezes, com redução significativa das contagens de bactérias aeróbias mesófilas, coliformes totais e fecais. Nas amostras em não conformidade, houve restabelecimento aos padrões aceitos legalmente devido a sensível redução na quantidade de coliformes fecais. O fermentado acético demonstrou ser uma alternativa eficiente e de fácil acesso para utilização em saladas cruas de vegetais para descontaminação bacteriológica.
Os autores informam não haver qualquer potencial conflito de interesse com pares e instituições, políticos ou financeiros deste estudo.
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