Análise tricológica de pelos-guarda de Mus musculus, Rattus rattus e Rattus norvegicus (Rodentia: Muridae) aplicada à pesquisa e à identificação em alimentos

Trichological analysis of guard hairs of Mus musculus, Rattus rattus and Rattus norvegicus (Rodentia: Muridae) applied to research and identification in food

Cinthia Iara de Aquino cinthia.aquino@ial.sp.gov.br

Instituto Adolfo Lutz, Brasil

Juliana Quadros

Universidade Federal do Paraná, Brasil

Roedores estão entre as mais importantes pragas do mundo ^{1 , 2 , 3} . Estes mamíferos não causam somente danos físicos, mas também contaminam os produtos com substâncias alergênicas ⁴ , patógenos ^{5 , 6} , fungos toxigênicos ⁷ e contaminantes físicos, como pelos, urina e fezes ⁸ . É de conhecimento da saúde pública que urina e fezes de roedor podem conter parasitas, bactérias patogênicas e vírus, como: Toxoplasma gondii, Salmonella, Staphylococcus aureus, Enterococcus spp., Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Serratia sp., Proteus sp. e Hantavirus spp. ⁹ . Historicamente, roedores têm sido responsáveis por mais doenças e mortes em humanos do que qualquer outro grupo de mamíferos ¹⁰ .

Além das commodities agrícolas, roedores também contaminam os alimentos processados. Após invadirem um novo local, como armazéns ou supermercados, camundongos inevitavelmente começam a roer os alimentos e as embalagens, contaminando o ambiente com seus pelos e excreções ¹¹ . As principais espécies de roedores que infestam ambientes de armazenamento de alimentos são as exóticas introduzidas: Mus musculus Linnaeus, 1758 (camundongo), Rattus rattus Linnaeus, 1758 (rato de telhado) e Rattus norvegicus Berkenhout, 1769 (ratazana) ³ .

Roedores ingerem diariamente uma quantidade de alimento equivalente a 10% do seu peso ¹² e contaminam muito mais que isso por suas fezes, pelos e urina, tornando o alimento impróprio para o consumo humano ¹³ . Por essa razão, a Resolução de Diretoria Colegiada (RDC) da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (Anvisa) nº 623, de 9 de março de 2022, que dispõe sobre os limites de tolerância para matérias estranhas em alimentos, os princípios gerais para o seu estabelecimento e os métodos de análise para fins de avaliação de conformidade, considera que os roedores (rato, ratazana e camundongo) e morcegos, inteiros ou em partes, são matérias estranhas indicativas de risco à saúde por veicularem agentes patogênicos para os alimentos (art. 3º, inciso IX, alíneas b e c). Adicionalmente, a presença de pelos humanos e dos demais mamíferos é considerada apenas indicativa de falhas das boas práticas (art. 3º, inciso X, alínea c) ¹⁴ . Sendo assim, nas investigações de matérias estranhas em alimentos é fundamental caracterizar os pelos dos roedores sinantrópicos mais comuns, quais sejam, os camundongos ( Mus musculus ) e as ratazanas ( Rattus spp.), para diferenciá-los dos pelos de outras espécies de interesse sanitário segundo a referida resolução (ou seja, de seres humanos e das demais espécies de mamíferos).

Entre os diferentes tipos de pelos dos mamíferos (ou seja, vibrissas, sobrepelos, subpelos, pelos-guarda), os pelos-guarda primários e secundários são os mais úteis na identificação microscópica por apresentarem as características microestruturais mais diagnósticas para os táxons. Os pelos-guarda apresentam, da base para o ápice: o bulbo, a haste e o escudo ( Figura 1A ). Na maior parte das espécies de mamíferos os pelos-guarda são formados por três camadas concêntricas de células, de dentro para fora: a medula, o córtex e a cutícula ( Figura 1B ). Os principais caracteres diagnósticos são os padrões cuticulares observados na haste e os padrões medulares observados no escudo dos pelos-guarda ¹⁵ . A identificação microscópica de pelos de mamíferos é uma técnica útil na identificação de pelos em diferentes contextos como, por exemplo: no controle de qualidade de fibras animais comercializadas ^{16 , 17 , 18 , 19 , 20} , em investigações forenses ^{21 , 22 , 23} e no controle de qualidade dos alimentos ^{23 , 24 , 25} . Exceto pelos esforços desses últimos autores, que tratam os roedores no nível taxonômico de família (ou seja, Muridae), não foram encontradas publicações ilustradas, tampouco protocolos de identificação dirigidos a auxiliar o perito nas análises laboratoriais de pelos contaminantes de alimentos, no sentido de caracterizar os pelos dos roedores sinantrópicos mais comuns e enquadrar a matéria estranha como indicativa de risco à saúde ou não, conforme preconiza a RDC Anvisa nº 623/2022.

Figura 1
Desenho esquemático (A) dos tipos de pelos presentes na pelagem dos mamíferos segundo Teerink 15 , sendo: a) pelo-guarda primário; b) pelo-guarda secundário com haste reta; c) pelo-guarda secundário com haste ondulada; d) subpelo. (B) camadas que formam os pelos da maioria das espécies de mamíferos, sendo a mais externa para a mais interna: a) cutícula; b) córtex; c) medula.
Fonte: Quadros ²⁶ .

Nesse sentido, o presente estudo teve como objetivo caracterizar os padrões cuticulares e medulares de pelos-guarda das três espécies de roedores que mais comumente contaminam alimentos: Mus musculus (camundongo), Rattus rattus (rato de telhado) e Rattus norvegicus (ratazana) e apresentar um protocolo de auxílio para análise tricológica de pelos isolados.

Tufos de pelos de roedores taxidermizados das espécies Mus musculus (dois indivíduos), Rattus rattus (um indivíduo) e Rattus norvegicus (dois indivíduos) foram coletados manualmente do dorso de espécimes colecionados no Laboratório de Citogenética e Genética da Conservação do Departamento de Genética da Universidade Federal do Paraná (UFPR). As amostras de pelos foram levadas ao Laboratório de Microscopia e Morfologia do Setor Litoral da UFPR, onde foram selecionados pelos-guarda inteiros (com bulbo e ápice) com o auxílio de microscópio estereoscópico marca Bioval®. As lâminas foram preparadas contendo de três a oito pelos-guarda selecionados para observação da medula e da cutícula segundo o protocolo de Quadros e Monteiro-Filho ²⁷ (Anexo I, p. 278). No total, 20 pelos-guarda foram analisados para caracterização dos padrões medulares e 91 impressões cuticulares de pelos-guarda foram examinadas para caracterização de padrões cuticulares ( Tabela ).

Tabela
Quantidade de lâminas confeccionadas e pelos-guarda utilizados para observação da medula e da cutícula de pelos de Mus musculus, Rattus rattus e Rattus norvegicus .

Tanto o estudo da microestrutura dos pelos-guarda quanto as fotomicrografias foram feitos utilizando o microscópio óptico Leica DM 2500 (Microsystems, Wetzlar, Alemanha), aumento de 100, 200 e 400 vezes, no Laboratório de Microscopia de Alimentos do Núcleo de Ciências Químicas e Bromatológicas do Centro de Laboratório Regional do Instituto Adolfo Lutz de Ribeirão Preto VI. A análise e a descrição da microestrutura dos pelos dos roedores foram realizadas de acordo com Teerink ¹⁵ e Quadros e Monteiro-Filho ²⁸ . A nomenclatura dos padrões medulares e cuticulares utilizada segue a proposta de Quadros e Monteiro-Filho ²⁸ . As denominações em inglês ou francês, propostas por outros autores e mencionadas no presente estudo, bem como sua correspondência com padrões medulares e cuticulares observados neste trabalho podem ser consultadas em Quadros e Monteiro-Filho ²⁸ (Tabelas III e IV, p. 287). Estudos pretéritos utilizados para a compreensão da morfologia dos pelos das três espécies de roedores aqui abordadas foram realizados por Teerink ¹⁵ , Brunner e Coman ²⁹ , Keogh ³⁰ e Keller ³¹ .

Os resultados apresentados descrevem os padrões cuticulares e medulares das três espécies de roedores sinantrópicos estudadas com foco na diferenciação destas em relação a outras espécies de mamíferos de interesse sanitário. Também evidenciam diferenças e inconsistências em relação à literatura, cujas causas são discutidas. Adicionalmente, é sugerido um protocolo de análise tricológica para pelos isolados encontrados em alimentos.

Com as técnicas empregadas foi possível observar que os pelos-guarda das três espécies se apresentam achatados dorso-ventralmente, evidenciando a face côncava e a convexa nas preparações de lâminas com os pelos inteiros e nas impressões cuticulares. Brunner e Coman ²⁹ basearam-se especialmente nas características dos cortes transversais para a diagnose, o que torna as comparações com o presente estudo limitadas. Porém, a percepção de que os pelos analisados aqui são reniformes ou côncavo-convexos está de acordo com as descrições de Brunner e Coman ²⁹ e Teerink ¹⁵ , como detalhado nas descrições das espécies a seguir.

Caracterização dos pelos-guarda das espécies estudadas com vistas à identificação de amostras de pelos desconhecidas

Mus musculus

O padrão medular no escudo dos pelos-guarda é do tipo alveolar, apresentando quatro alvéolos com contornos bem definidos na largura dos pelos-guarda ( Figuras 2A e 2B ), o que corrobora a descrição de Teerink ¹⁵ para a espécie. Segundo a nomenclatura utilizada pelo referido autor, este padrão é denominado isolated . As ilustrações apresentadas por Brunner e Coman ²⁹ para a medula de Mus musculus mostram o padrão reticular para a espécie, que o autor denomina wide aeriform lattice . Isto difere do que foi observado aqui para Mus musculus .

Figura 2
Fotomicrografias ópticas dos padrões medulares e cuticulares dos pelos-guarda de Mus musculus . Medula visualizada sob aumento de (A) 200x e (B) 400x; e cutícula visualizada sob aumento de (C) 200x na face côncava e (D) 400x na face convexa.
Fonte: Elaborada pelos autores, 2021.

O padrão cuticular na haste é losângico ²⁸ , porém, como descrito também por Teerink ¹⁵ , observou-se que pode apresentar variações na forma e tamanho das escamas entre as faces côncava e convexa dos pelos-guarda ( Figuras 2C e 2D ). Keogh ³⁰ descreve a presença de escamas largas com margens lisas na cutícula de Mus musculus , assim como observado no presente estudo, porém denomina o padrão de petal .

O comprimento médio dos pelos-guarda primários de M. musculus é de 12 mm, segundo Teerink ¹⁵ . Não foi objeto desse estudo mensurar comprimento dos pelos, porém observou-se que, para Mus musculus, os pelos são sempre menores do que para Rattus rattus e R. norvegicus , o que está de acordo com o aferido pelo autor, entre 15 e 25 mm para Rattus spp.

Rattus rattus

O padrão medular do escudo é reticulado, com cinco a seis espaços delimitados na retícula na largura do pelo. A delimitação dos espaços da retícula apresenta formas irregulares, às vezes de difícil visualização ( Figuras 3A e 3B ). O padrão observado está de acordo com Brunner e Coman ²⁹ que o denominam wide aeriform lattice . Teerink ¹⁵ não diferencia os padrões alveolar e reticulado como fazem Quadros e Monteiro-Filho ²⁸ , e Keller ³¹ descreve o padrão reticulado para roedores como uma treliça e o denomina en treillis .

Figura 3
Fotomicrografias ópticas dos padrões medulares e cuticulares dos pelos-guarda de Rattus rattus . Medula visualizada sob aumento de (A) 200x e (B) 400x; (C) lado côncavo e (D) lado convexo da cutícula visualizados sob aumento de 200x.
Fonte: Elaborada pelos autores, 2021.

O padrão cuticular na face côncava da haste de pelos-guarda apresenta escamas com orientação oblíqua dupla em relação ao eixo longitudinal do pelo, como descrito por Quadros e Monteiro-Filho ²⁸ . As escamas na reentrância são tão largas quanto longas e assemelham-se ao padrão losângico ( Figura 3C ). Da mesma forma, na face convexa, o padrão cuticular se aproxima do losângico descrito por Quadros e Monteiro-Filho ²⁸ , porém as escamas têm variações na forma e tamanho ( Figura 3D ). Isso é reportado por Teerink ¹⁵ , que se refere a este padrão como irregular ( irregular diamond petal ). Para Keogh ³⁰ , o padrão cuticular de R. rattus é denominado mosaico ( mosaic ). Embora o nome do padrão utilizado por Keogh ³⁰ seja diferente, as ilustrações apresentadas por essa autora evidenciam um padrão losângico segundo a nomenclatura utilizada no presente estudo, o que coincide com o observado aqui na reentrância da face côncava e na face convexa.

Rattus norvegicus

A medula do escudo é reticulada, como também descrito por Brunner e Coman ²⁹ , e apresenta de cinco a sete espaços da retícula na largura dos pelos-guarda. Porém, diferentemente de R. rattus , a delimitação dos espaços é inconspícua e estes estão arranjados transversalmente, não raramente fusionados, aparentando a formação de listras transversais dispostas ao longo do escudo dos pelos-guarda ( Figuras 4A e 4B ). Quadros e Monteiro-Filho ²⁸ apresentam a formação do padrão listrado para roedores sigmodontíneos (por exemplo, Akodon sp.), entretanto, para estes autores, o padrão medular listrado é resultante do arranjo e fusão transversal de alvéolos do padrão alveolar, uma transição de alveolar para listrado. Silveira et al. ³² , estudando nove espécies do gênero Akodon, corroboram a existência desta modificação do padrão alveolar em listrado, o que denomina “padrão medular misto de alveolar e listrado”. Neste trabalho, no caso de R. norvegicus , optou-se por não denominar o padrão de listrado apesar da aparência das listras, porque o padrão medular de R. norvegicus advém da fusão de espaços da retícula do padrão reticular, e não do padrão alveolar, como descrito originalmente por Quadros e Monteiro-Filho ²⁸ para o padrão listrado. Como reportado para R. rattus , Teerink ¹⁵ não diferencia o padrão reticulado do padrão alveolar, então, para este autor, a medula de R. norvegicus é isolated .

Figura 4
Fotomicrografias ópticas dos padrões medulares e cuticulares dos pelos-guarda de Rattus norvegicus . Medula visualizada sob aumento de (A) 200x e (B) 400x; (C) lado côncavo e (D) lado convexo da cutícula visualizados sob aumento de 200x.
Fonte: Elaborada pelos autores, 2021.

O padrão cuticular observado na porção central da haste dos pelos-guarda é do tipo losângico conforme descrito por Teerink ¹⁵ . Na face côncava, as escamas variam mais em forma e tamanho e estão discretamente dispostas no padrão oblíquo duplo em relação ao eixo longitudinal dos pelos-guarda (em “V”) quando comparado a R. rattus . Já na face convexa o padrão losângico apresenta maior regularidade na forma e tamanho das escamas ( Figuras 4C e 4D ). Na região proximal da haste há um padrão cuticular em mosaico que faz a transição entre o bulbo e o padrão cuticular losângico, característico da haste dos pelos-guarda dessa espécie. Isto também foi observado por Teerink ¹⁵ . Para Keogh ³⁰ , o que diagnostica R. norvegicus é a presença desse padrão mosaico de transição na haste ( waved mosaic ).

Silveira et al. ²³ reportaram-se aos padrões cuticulares e medulares de pelos de roedores no nível taxonômico de família (ou seja, Muridae), porém o fizeram com base nas três espécies aqui estudadas (ou seja, M. musculus, R. rattus, R. norvegicus ). Segundo os autores, a cutícula das referidas espécies é folidácea, contrariando o observado neste trabalho. Como alertado por Quadros e Monteiro-Filho ³³ , analisando pelos de felinos “as diferenças nos padrões cuticulares folidáceo e losângico são sutis e de difícil observação”. Ainda nesse sentido, para Silveira et al. ²³ , a medula é alveolar em Mus musculus , como relatado neste trabalho; mas também em Rattus spp., em desacordo com o presente estudo, que identificou o padrão reticulado. Certos autores não diferenciam esses padrões (alveolar e reticulado) ^{15 , 31} , sugerindo que possa se tratar do mesmo padrão visualizado de duas formas diferentes por razões não exploradas nos estudos. Ainda nesse sentido, Brunner e Coman ²⁹ consideram o padrão reticulado de Quadros e Monteiro-Filho ²⁸ como lattice e o alveolar como aeriform lattice , ou seja, para os autores os dois padrões se aproximam e têm a aparência de uma treliça. No padrão aeriform lattice espaços com ar aparecem como uma rede ou treliça ²⁹ .

O padrão cuticular losângico, recorrente com pequenas variações nas espécies de roedores sinantrópicos estudadas, está presente em roedores silvestres sigmodontíneos e em várias espécies de outras ordens de mamíferos como Didelphimorpha e Carnivora ³³ , incluindo gatos domésticos ²³ . Dessa forma, a identificação de fragmentos de pelos formados apenas por haste, em que a cutícula é caráter diagnóstico, conduz a um parecer inconclusivo no sentido de enquadramento no inciso IX ou X do artigo 3º da RDC Anvisa nº 623/2022 ¹⁴ ( Figura 5 ).

Figura 5
Fluxograma aplicado à identificação de pelos de roedores contaminantes de alimentos.
Fonte: Elaborada pelos autores, 2021.

Figura 6
Fotomicrografias dos tipos de pelos e seus fragmentos. (A) pelo-guarda, (B) subpelo, (C) fragmento de pelo-guarda apenas com haste definível e (D) fragmento de pelo-guarda apenas com escudo definível (barra de escala A, D = 500 µm; B, C = 200 µm).
Fonte: Elaborada pelos autores, 2021.

O padrão alveolar da medula dos pelos-guarda de Mus musculus também pode ser observado em pequenos roedores silvestres, como em espécies de Sigmodontinae ^{32 , 33} . No entanto, estes roedores silvestres não têm a sinantropia como hábito. Ainda nesse sentido, embora o padrão reticulado observado nas ratazanas ( Rattus spp.) também seja relatado para outros roedores como Nectomys squamipes e Holochilus brasiliensis ; e para o marsupial Chironectes minimus³³ , todos são silvestres e de hábito semiaquático, o que reduz as possibilidades dessas espécies contaminarem alimentos.

Adicionalmente, os padrões medulares observados (alveolar e reticulado) são diferentes dos observados em pelos humanos ou de outros grupos de mamíferos aos quais a RDC Anvisa nº 623/2022 ¹⁴ se refere. Segundo Silveira et al. ²³ , em humanos a medula está ausente ou é unisseriada; cães e gatos domésticos apresentam medula matricial e trabecular, respectivamente; nos morcegos, a medula é ausente; e nos gambás é do tipo crivada ²⁸ . Felix et al. ³⁴ , trabalhando com raças brasileiras de bovinos utilizadas na produção de alimentos, observaram a medula trabecular. De Marinis e Asprea ³⁵ , estudando a morfologia dos pelos de ungulados domésticos (vacas, ovelhas, cabras, cavalos e burros), relataram a presença de medula unisseriada ou multisseriada, com ou sem a formação de vacúolos, podendo apresentar-se descontínua e estreita. Todas essas características diferem acentuadamente das observadas nos roedores.

Nesse sentido, a presença dos padrões alveolar e reticulado no escudo de pelos-guarda inteiros conduz ao diagnóstico de roedor ( Figura 5 ) e possibilita o enquadramento no inciso IX do art. 3º da RDC Anvisa nº 623/2022 ¹⁴ . Adicionalmente, outro padrão que conduz ao diagnóstico de roedor por ter sido observado exclusivamente nesse grupo de mamíferos é o padrão listrado. Embora este não tenha sido descrito para as três espécies de roedores sinantrópicos estudadas aqui, já foi descrito para outras espécies de pequenos roedores silvestres (Sigmodontinae) ^{32 , 33} .

A análise tricológica dos pelos de roedores estudados mostrou que estas espécies sinantrópicas podem ser diferenciadas das demais espécies de mamíferos de interesse sanitário pela presença dos padrões medulares alveolar e reticulado no escudo de pelos-guarda. Os padrões cuticulares na haste, por outro lado, apresentam sobreposições interespecíficas, tornando-os inúteis para a referida diagnose. Portanto, ao analista interessa mais especificamente dominar o reconhecimento de pelos-guarda e a identificação dos padrões medulares na porção do escudo desses pelos.

O protocolo de análise tricológica, contendo o fluxograma ilustrado, evidencia aqueles casos em que o parecer é inconclusivo (subpelos e fragmentos de haste) e, especialmente, possibilita enquadrar, única e exclusivamente, pelos-guarda inteiros ou fragmentos de escudo como matéria estranha indicativa de risco à saúde (pelos de roedores) ou como indicativa de falhas das boas práticas (pelos humanos e dos demais mamíferos) de acordo com a RDC Anvisa nº 623/2022.

À Dra. Fernanda Gatto Almeida, por disponibilizar os exemplares de roedores para coleta de pelos junto ao Laboratório de Citogenética e Genética da Conservação do Departamento de Genética da Universidade Federal do Paraná (UFPR).